TECNICHE SPETTROSCOPICHE
Le tecniche spettroscopiche sono tutte quelle tecniche basate sull’interazione
tra la materia e le radiazioni elettromagnetiche.
La luce, il calore ed altre radiazioni elettromagnetiche sono vibrazioni di
campi magnetici ed elettrici che si propagano nello spazio.
Ogni radiazione, o onda elettromagnetica, è caratterizzata dai parametri:
Frequenza (n) il numero di vibrazioni nell'unità di tempo
Lunghezza d'onda (l)
distanza tra due punti adiacenti in fase (ad esempio
tra due massimi consecutivi)
Velocità di propagazione(c)
dipende dal mezzo in cui si propaga la
radiazione. La relazione che lega questi parametri è:
l = c/n
E’ utile anche considerare queste radiazioni elettromagnetiche come un
treno di particelle chiamate fotoni o quanti.
La l di una radiazione elettromagnetica è in relazione con l’energia
contenuta in un quanto mediante la relazione
E=hn
h costante di Planck = 6.63x10-34 Joule●sec
ENERGIA E FREQUENZA SONO DIRETTAMENTE PROPORZIONALI
Un fascio di luce è più o meno intenso a seconda che porti più o meno
fotoni nell'unità di tempo, ma l'energia di ciascun fotone (il quanto di
energia), è sempre la stessa per una determinata frequenza della
radiazione.
La frequenza è inversamente proprorzionale alla lunghezza d’onda
Tipi di radiazione elettromagnetica
Esistono quindi vari tipi di radiazione elettromagnetica, che differiscono per
la loro lunghezza d'onda (e di conseguenza per la loro frequenza ed energia)
L'analisi spettrofotometrica consiste in misurazione di radiazioni
elettromagnetiche per ottenere informazioni sia qualitative che
quantitative: ogni sostanza assorbe o emette radiazioni di lunghezza d'onda
ben determinata
– l'analisi dello spettro permette allora di individuare la natura della sostanza
in esame
– la misura dell'intensità delle radiazioni emesse o assorbite permette di
risalire alla quantità di sostanza analizzata.
PRINCIPIO
Atomi o molecole, trovandosi in campi energetici possono assorbire quantità
definite e caratteristiche di energia
• quando atomi o molecole vengono eccitati da adatte radiazioni
elettromagnetiche (“hν”), passando a stati energetici maggiori, si ha il
fenomeno di ASSORBIMENTO
• quando dagli stati eccitati, ritornano allo stato fondamentale, gli atomi e le
molecole emettono quanti di energia sotto forma di radiazioni
elettromagnetiche (“ hν ”) si ha il fenomeno di EMISSIONE (FLUORESCENZA)
In genere per l’assorbimento nell’UV e nel Visibile (l=200–700 nm)
sono interessati, nelle transizioni energetiche, gli elettroni esterni
della molecola assorbente sia impegnati che non impegnati in un
legame.
La parte della sostanza assorbente chiamata cromoforo interessata a
tali transizioni è generalmente costituita da anelli eterociclici
aromatici, doppi legami coniugati, ponti disolfuri e gruppi chimici
funzionali come COOH, NH2.
Analisi qualitativa: spettro di assorbimento
DEF: curva ottenuta congiungendo i valori di assorbimento presi in funzione
della lunghezza d’onda in un certo intervallo di lunghezze d’onda.
Ogni sostanza assorbente ha un suo caratteristico spettro utile alla
identificazione di tale sostanza nel campione in esame. L’unicità dello
spettro consiste nella presenza di caratteristici picchi di assorbimento a
determinate lunghezze d’onda non riscontrabili negli spettri
di altre
sostanze assorbenti.
Un esempio è lo spettro del coenzima NAD+
•NADH ha due picchi, 260 e 340 nm
•NAD+ ha un solo picco, 260 nm
Citocromi: REAZIONI DI TRASFERIMENTO REVERSIBILE MONOELETTRONICHE (Fe3+Fe2+)
cit. b
l ≃560nm
Legame
covalente
(ponti
tioeteri)
cit. c
l ≃550nm
l ≃605nm
cit. a
Analisi quantitativa
Le determinazioni quantitative sono basate sul fatto che, quando una
radiazione
attraversa
intensamente
a
una
seconda
soluzione,
della
viene
assorbita
concentrazione;
l'assorbimento dipende dalla concentrazione.
I0 l’intensità della radiazione incidente
I l’intensità della radiazione trasmessa.
Definiamo Trasmittanza
T = I/I0
in
più
altre
o
meno
parole
Trasmittanza : 0 ≤ T ≤ 1
T = 1 la radiazione è completamente trasmessa I0 = I
T = 0 la radiazione è completamente assorbita I = 0
T = 10
–elc
= I/I0
log I/I0= -ecl
Definendo A (Assorbanza)= log I0/I
A = ecl
Legge di Lambert Beer
C = concentrazione della soluzione o specie chimica in esame (moli/litro)
l = cammino ottico (ovvero spessore dello strato attraversato dalla
radiazione incidente)
e = coefficiente di estinzione molare (ovvero l’assorbimento che subisce un
raggio di luce monocromatica nell’attraversare una soluzione a
concentrazione unitaria e cammino ottico di 1 cm)
L’assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione
del campione: mettendo in grafico l’A in funzione di c avremo
una retta passante per l’origine degli assi.
Se l= 1 cm la pendenza della retta data da A/c = e fornisce il
valore del coefficiente di estinzione molare alla l considerata
A
e
c
Secondo la legge di Lambert – Beer, più elevata è la
concentrazione delle molecole che passano dallo stato
fondamentale a quello eccitato, maggiore sarà l’assorbanza
(maggiore sarà la diminuzione dell’intensità del raggio
incidente).
Validità della legge di Lambert-Beer:
•
la luce incidente e’ monocromatica
•
l’assorbimento del solvente e’ trascurabile
•
la concentrazione del campione e’ contenuta entro limiti
adatti
•
non si verificano reazioni chimiche delle molecole del
campione fra loro o con il solvente
STRUMENTAZIONE: Spettrofotometro
I componenti essenziali sono:
•
Sorgente di luce policromatica (tungsteno per il visibile, deuterio
per l’UV)
•
Fessura d’ingresso-lente (per minimizzare la luce diffusa e
rendere paralleli i raggi della sorgente)
•
Filtro o monocromatore (per selezionare una banda di l definita)
•
Fessura d’uscita
•
Cella o cuvetta
•
Fotomoltiplicatori (trasforma il segnale luminoso in impulso
elettrico)
Esistono diversi tipi di spettrofotometro, a seconda di come sono
organizzati i vari componenti:
•SPETTROFOTOMETRI MONORAGGIO
•SPETTROFOTOMETRI A DOPPIO RAGGIO
•SPETTROFOTOMETRI A DOPPIA LUNGHEZZA D’ONDA
Spettrofotometro a singolo raggio
Questo strumento lavora ad una singola lunghezza d’onda
selezionata; è utilizzato normalmente per effettuare analisi che
prevedono misure ad una sola lunghezza d’onda e per soluzioni con
un solo analita.
Spettrofotometro a doppio raggio
E’ presente un componente che sdoppia il raggio: è possibile avere il
confronto simultaneo tra l’assorbimento della cuvetta contenente il
campione e la cuvetta di riferimento. E’ possibile effettuare misure
direttamente a qualsiasi l senza ripetere azzeramenti, e soprattutto
registrare continuativamente lo spettro.
Spettrofotometro a doppia lunghezza d’onda
Elimina l’assorbimento aspecifico ed è possibile registrare spettri
differenziali per la possibilità di utilizzare due lunghezze d’onda, una
di riferimento, l’altra di misura.
APPLICAZIONI DELLA SPETTROFOTOMETRIA
•
analisi qualitativa: spettro d’assorbimento
•
analisi quantitativa diretta per sostanze che assorbono ad una
data lunghezza d’onda, tipo le proteine il cui assorbimento a 280
nm si basa principalmente sul suo contenuto di tirosina e
triptofano
•
analisi quantitativa indiretta tramite reazione colorimetrica;
molte sostanze possono reagire con altre a dare un prodotto
colorato. Si misura l’estinzione dei campioni rispetto a quella di
un bianco che contiene tutti i reagenti tranne la sostanza da
determinare
•
attività e cinetica enzimatica: si misura la velocità di comparsa o
scomparsa di una sostanza con un picco caratteristico di
assorbimento che partecipi come substrato o come prodotto alla
reazione enzimatica in esame
Analisi quantitativa indiretta
•Metodo Bradford
Questo metodo è semplice, rapido, economico e sensibile. Esso si basa
sull'azione del Coomassie brilliant blue G-250 che si lega
specificatamente a residui di arginina, triptofano, tirosina, istidina e
fenilalanina. Si lega a questi residui in una forma anionica, con
assorbanza massima a 595 nm.
•Metodo del Biureto
il reattivo del biureto consiste in una soluzione alcalina di solfato di rame
contenente tartrato di sodio e potassio. Gli ioni rameici formano un
complesso di coordinazione con 4 gruppi NH2 ed ha un picco di
assorbimento a 540 nm.
Entrambi i metodi necessitano del valore di concentrazione di una
proteina di riferimento, l’albumina dosata a 280nm (analisi
diretta)
Dosaggio enzimatico
1.Dosare la quantità di un substrato che prende parte ad una
reazione catalizzata da un enzima
2.Dosare l’attività di un enzima, cioè la velocità di una reazione
catalizzata da un enzima
• Enzimi plasmatici a scopo diagnostico: un dosaggio degli enzimi
nel plasma può essere utilizzato per diagnosticare il danno di un
tessuto od organo particolarmente ricco in alcuni enzimi e l’entità
del rilascio enzimatico fornirà un indice del grado del danno
cellulare.
• carenze/difetti enzimatici responsabili di sindromi biochimiche
Come si misura l’attività di un enzima ?
Si misura la variazione nel tempo di una qualsiasi grandezza
correlata alla concentrazione del substrato o del prodotto.
Velocità di reazione: quantità di substrato trasformato nel tempo
v = - d [S] / dt = d [P] / dt
DO = elc
c = DO/el
v = dc/dt
v = 1 dDO/dt
el
La misura della variazione di DO nel tempo è la misura della velocità di
reazione. Quando si vuole misurare la velocità di una reazione enzimatica
si misura la variazione di DO nel tratto iniziale : in questo intervallo il
reagente si trasforma in prodotto alla massima velocità dopodichè la
velocità diminuisce man mano che si instaura l’equilibrio.
In quali condizioni fare i dosaggi?
Vi = Vmax [S] / [S] + Km
se [S] > > Km
Vi = Vmax
Per valutare l’attività di un enzima si lavora in eccesso di
substrato (condizioni di Vmax )
Dosaggio dell’ attività enzimatica (metodo diretto)
Un esempio è il dosaggio della lattico deidrogenasi che catalizza la
reazione:
Per dosare l’attività della LDH si misura la velocità iniziale della
reazione catalizzata dall’enzima per concentrazioni di piruvato
(substrato) saturanti.
Dosaggio dell’attività enzimatica (metodo indiretto)
Un esempio è dato dalla reazione catalizzata dalla PK
Si aggiunge un enzima ausiliario (LDH) e il NADH
LDH
Piruvato + NADH + H+ <=> Lattato + NAD+
Si segue la scomparsa del NADH a 340 nm
•
il parametro da misurare deve essere limitante
•
tutti i substrati devono saturare l’enzima
Dosaggio dell’attività enzimatica (metodo indiretto)
Un esempio è dato dalla reazione catalizzata dalla GOT (glutammico
ossalacetico transaminasi (GOT)
Malato DH
Dosaggio enzimatico del substrato
Possiamo risalire al numero di moli di piruvato che vengono trasformate in lattato
calcolando le moli di NADH ossidate, tenendo presente che esiste un rapporto
stechiometrico 1:1 fra substrato e coenzima.
DA = Af-Ai
•
•
DA=elDC
DC=DA/el
enzimi ed eventuali substrati devono essere in eccesso
il substrato da dosare deve essere limitante
Elettrodo per ossigeno di Clark
Misura l’ossigeno in una soluzione usando il principio
polarografico, cioè monitorando la corrente che passa fra
due elettrodi quando si applica un voltaggio.
La porzione superiore di tale elettrodo è costituita
da una camera di reazione termostatata in cui si
posiziona il campione di cui si vuole conoscere la
tensione di ossigeno
La porzione inferiore è rappresentata dalla camera
degli elettrodi, in cui si verificano reazioni di
ossido-riduzione
I due compartimenti sono separati da una
membrana di teflon che da una parte, permette
all’ossigeno di diffondere verso la camera degli
elettrodi
La camera degli elettrodi comprende un catodo di platino e un
anodo d’argento, entrambi immersi nella stessa soluzione
satura di cloruro di potassio (KCl). Quando viene applicata tra
gli elettrodi una differenza di potenziale di circa 0.6 volt,
all’anodo si verifica la seguente reazione di ossidazione:
4Ag + 4Cl-
4AgCl + 4e-
Gli elettroni generati sono impiegati per ridurre al catodo
l’ossigeno che diffonde attraverso la membrana, formando
acqua:
O2 + 4H+ + 4e-
2H2O
La corrente prodotta dall’elettrodo è proporzionale alla
tensione dell’ossigeno nel campione: tale valore può essere
così amplificato e registrato attraverso un tracciato continuo.
Il consumo di ossigeno in vitro dipende da vari fattori:
•Disponibilità di ossigeno
•Disponibilità di substrati ossidabili
•Presenza di inibitori della catena respiratoria
Il consumo di ossigeno in vitro permette di:
•Valutare l’ICR (indice di controllo respiratorio)
•Misurare il PO (efficienza di fosforilazione ossidativa)
•Studiare gli effetti degli inibitori
ICR = v st3/v st4
mito
P/O = nmoli ATP prodotto /
natomi di O2 consumati
substrato
ADP
mM O2
Stato 3
Stato 4
ADP
O2 consumato
oligomicina
DNP
Tempo(min)
Mit
Pir/Mal
Rot
Succ
Ant.A
Asc/TMPD
[O2]
KCN
tempo
Succinato
Piruvato/Malato
Rotenone
CII
Antimicina A
Cianuro
NADH
CI
Q10
CIV
CIII
Cit.c
Ascorbato/TMPD
O2
cells
DNP
dig
Pir/Mal
Rot
[O2]
Succ
Ant.A Asc/TMPD
KCN
tempo