BIOTECNOLOGIE


utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo
di produrre quantità commerciali di prodotti utili
migliorare le caratteristiche di piante ed animali
Tecniche biochimiche
TECNICHE OTTICHE o SPETTROSCOPICHE
Il passaggio della luce o di radiazioni elettromagnetiche
attraverso
Una sostanza
Informazioni
qualitative
Informazioni
quantitative
INTERAZIONE tra una radiazione elettromagnetica e la MATERIA
FENOMENO QUANTICO
Le radiazioni sono onde elettromagnetiche che
viaggiano alla velocità di 3x108 m/sec.
Sono caratterizzate da una componente elettrica ed una
magnetica perpendicolari fra loro e che vibrano in una
infinità di piani
 PARAMETRI CHE LE CARATTERIZZANO


l = lunghezza d’onda: distanza tra due stessi punti
dell’onda elettromagnetica (si misura in METRI)
 T = periodo d’onda: intervallo di tempo in cui avviene
una oscillazione completa (si misura in SECONDI)

n = frequenza: numero di oscillazioni compiute
nell’unità di tempo
(si misura in Hertz; 1 Hz = 1 ciclo/sec)
RAPPRESENTAZIONE DI UNA RADIAZIONE
ELETTROMAGNETICA
E = energia o intensità di una
radiazione elettromagnetica
detta:
l
FOTONE o QUANTO DI LUCE
T

La lunghezza d’onda ( l ) di una radiazione
elettromagnetica e la sua frequenza ( n ) sono
grandezze tra loro inversamente proporzionali:
ln=C
C = rappresenta la velocità di propagazione nel
vuoto Il suo valore è di circa 3 x 108 m/sec.
Per una qualsiasi radiazione è necessario conoscere solo
uno dei due parametri per poter ricavare anche l’altro.
E=n
l
Radiazioni a bassa lunghezza d’onda e ad elevata frequenza: elevata
Elevata lunghezza d’onda ed bassa frequenza: bassa
energia
energia
Spettro delle radiazioni elettromagnetiche
Lunghezza d’onda
Nome radiazione
Å (10 -8cm)
Raggi gamma
10-3 – 10-1
Raggi X
10-1 – 10
Ultravioletto (UV)
10 – 350
Visibile
350 - 800
Infrarosso
800 -10- 4
Onde hertziane
10- 4 – 1010
Lunghezza d’onda
Lunghezza
d’onda
SPETTRO DELLE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE
Nella regione del VISIBILE: radiazioni che possono essere
percepite dall’occhio umano
Radiazioni a bassa lunghezza d’onda e ad elevata frequenza: elevata energia
Elevata lunghezza d’onda ed bassa frequenza: bassa energia
Come avviene l’interazione tra le radiazioni
elettromagnetiche e la materia ?



Il fenomeno può essere spiegato sulla base della
teoria quantistica della materia
Gli elettroni presenti in un orbitale atomico o
molecolare si distribuiscono secondo unità discrete
di energia o quanti
L’energia associata al passaggio dallo stato
fondamentale Eo a quello eccitato avviene solo se è di
una particolare frequenza o lunghezza d’onda
E eccitato
DE = frequenza
Eo fondamentale
SI VERIFICANO TRANSIZIONI ELETTRONICHE
associabili ALLE DIVERSE RADIAZIONI
ELETTROMAGNETICHE
La spettroscopia atomica o molecolare
in seguito a transizioni che si verificano a livello
atomico e molecolare

Considera l’energia delle radiazioni elettromagnetiche che
viene assorbita:
SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO

Oppure quella parte dell’energia delle radiazioni
elettromagnetiche che viene emessa:
SPETTROSCOPIA DI EMISSIONE
Sulla base delle diverse radiazioni
elettromagnetiche avremo:

· spettroscopia rotazionale (onde radio)

· spettroscopia vibrazionale (infrarosso)

spettroscopia molecolare elettronica
(visibile e ultravioletto)

· spettroscopia atomica (raggi X)
LA TECNICA SPETTROSCOPICA CONSENTE AI CHIMICI DI
OTTENERE INFORMAZIONI QUALI-QUANTITATIVE
Le tecniche spettroscopiche sono basate sullo scambio
di energia che si verifica fra l’energia radiante e la
materia
SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO
assorbimento delle radiazioni luminose della regione
dello spettro elettromagnetico appartenenti al campo
del visibile (350 – 700 nm) e del vicino ultravioletto
(200 – 350 nm)
L’assorbimento di questi tipi di radiazioni da parte delle
molecole è in grado di produrre delle transizioni
energetiche degli elettroni esterni della molecole
Quando una radiazione elettromagnetica
attraversa una sostanza, provocherà
una transizione elettronica e la radiazione
emergente dalla sostanza avrà una intensità
Inferiore (SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO )
I0 = Intensità radiazione incidente
 IR =
“
“
riflessa
 IA =
“
“
assorbita
 IT =
“
“
trasmessa
I0 = IR + IA + IT
LA LEGGE DI LAMBERT-BEER

It / I0 = 10 -ecl
Nelle soluzioni:
I0 = IA + It
IL SOLUTO è responsabile dell’assorbimento
l = il cammino ottico (cm)
c = concentrazione molare del soluto
e = coefficiente di estinsione molare, costante
caratteristica di ogni soluto
ma il log I0 / It = E = e c l
E=ecl
E = Densità ottica o ASSORBANZA è direttamente
proporzionale alla concentrazione del soluto che sta
assorbendo la luce

e = coefficiente di estinsione molare
Rappresenta quella densità ottica di una
soluzione in cui la concentrazione = 1 (C = 1)
ed il cammino ottico è unitario (l = 1)
It / I0 = 10 -ecl
E=ecl
La legge di Lambert-Beer consente di calcolare
facilmente la concentrazione di una soluzione dalla
misura dell’intensità della radiazione trasmessa It
quando è nota l’intensità della luce incidente I0 , e ed
il cammino ottico
T = TRASMISSIONE PERCENTUALE
T = 100 It
I0



T=1
T=0
sostanza trasparente E = 0
sostanza opaca E =
8

Log T = 2 - log I0 / It
Log T = 2 - E
E = 2 - Log T
T varia da 0 a 100
E varia da + a 0
E = 2 – log T
8

Componenti schematici di una apparecchiatura per analisi
spettroscopica
S = Sorgente di radiazioni (lampada)
M = Monocromatore
LP = Radiazione policromatica
LMI = Rad. Monocromatica incidente
LME = Rad. Monocromatica emergente
C = Contenitore campione (cuvetta)
SP = Specchio
R = Rivelatore
Spettrofotometri UV-VISIBILE, i tipi più comuni
sono il “monoraggio” e il “doppio raggio”:
1) SORGENTE DI RADIAZIONE
2) SELEZIONATORE DI LUNGHEZZE D’ONDA O
MONOCROMATORE
3) CELLA
4) RIVELATORE
5) LETTORE
Sorgenti di radiazioni per spettroscopia nel
visibile ed ultravioletto
(spettroscopia molecolare elettronica)




· Ad incandescenza
( compresa tra 350 800 nm) adatte solo per il
visibile
· Ad idrogeno
( compresa tra 200 400 nm) adatte solo per
ultravioletto
Lampada al Tungsteno + deuterio
Il monocromatore è il sistema ottico usato per disperdere la luce
policromatica in bande monocromatiche, che vengono inviate
in successione sul campione.
Essi sono basati su un ELEMENTO DISPERDENTE
(prisma o reticolo), che separano le varie componenti della
radiazione e ne permettono la successiva selezione della banda
desiderata.
Consistono nel far incidere il fascio policromatico su un oggetto
(un prisma o un reticolo) in grado di deviare le diverse
radiazioni con diversi angoli: la radiazione uscente sarà quella
che passa attraverso la fenditura di uscita.
MONOCROMATORI
separa la luce policromatica in bande monocromatiche, che
vengono inviate in successione sul campione.
A prisma
A reticolo
CUVETTE






Sono i contenitori dei campioni da analizzare
Cammino ottico calibrato (1 cm)
Volume diverso
Materiale diverso in dipendenza della lunghezza
d’onda
Quarzo per UV e visibile
Vetro solo per il visibile
Durante questi esperimenti vengono utilizzate cuvette in quarzo,in
quanto questo materiale permette alla luce bianca di oltrepassare
senza alcun cambiamento.
PORTACUVETTE dove inserire il campione
Sono dispositivi capaci di produrre un segnale
elettrico che dipende dall'energia delle
radiazioni ricevuta.
Tale segnale elettrico (proporzionale all'intensità
luminosa) viene poi trasferito a un indicatore
RILEVATORI


Sistemi capaci di determinare l’intensità di una
radiazione trasformando un segnale luminoso in
energia elettrica
Fotocella (o fototubo)
Effetto fotoelettrico

Fotomoltiplicatori
Effetto fotoelettrico amplificato

Rivelatori a serie di diodi
Elettronici, fanno anche lo spettro delle radiazioni
di cui determinano l’intensità.
Tramite un convertitore analogico digitale è possibile
così ottenere i risultati dell’analisi direttamente su un
personal computer che ne elabora i dati.
Il
segnale
proveniente
dal
rivelatore
viene
opportunamente amplificato e un amperometro ne
rileva l’intensità.
Il lettore converte quindi il segnale elettrico in un valore
numerico proporzionale all’intensità del segnale, e
questo valore va da 0 a 100.
Ponendo pari a 100 il valore del segnale in assenza
del campione, otteniamo la trasmittanza e da
questa l’assorbanza.
ASSORBANZA
L’assorbanza è il logaritmo negativo della trasmittanza
A = 2 - log(T)
A = ecl
Secondo la legge di Lambert – Beer l’assorbanza A è proporzionale
alla concentrazione della sostanza assorbente, per cui più elevata
è la concentrazione delle molecole che passano dallo stato
fondamentale a quello eccitato, maggiore sarà l’assorbanza
Esistono diversi tipi di spettrofotometro, a seconda di come
sono organizzate le varie componenti:
♥ SPETTROFOTOMETRI MONORAGGIO
♥ SPETTROFOTOMETRI A DOPPIO RAGGIO
Gli SPETTROFOTOMETRI MONORAGGIO, sono usati
prevalentemente in analisi quantitativa e non sono comodi per
ottenere spettri di assorbimento
La difficoltà sta nel fatto che per ogni misura, si deve ripetere
l'azzeramento contro il bianco, oppure registrare prima lo
spettro del bianco, poi lo spettro del campione ed infine
sottrarre al secondo il primo.
Negli SPETTROFOTOMETRI A DOPPIO RAGGIO si ha invece un
sistema che invia due raggi, identici per frequenza e intensità,
uno attraverso il campione e l'altro attraverso il bianco, per
cui si ha un confronto continuo tra l'assorbanza del campione
e quella del bianco.
Grazie a queste caratteristiche è possibile effettuare misure
direttamente senza ripetere azzeramenti, e soprattutto
registrare continuativamente lo spettro di assorbimento.
SCHEMA DI UNO STRUMENTO A
SINGOLO RAGGIO
IL MONOCROMATORE è un
PRISMA o un RETICOLO DI
DIFFRAZIONE
1) Si mette nella cuvetta il solvente e si misura l’Intensità.
2) Si lava la cuvetta.
3) Si mette la soluzione e si misura l’intensità.
4) Si fa il rapporto fra le due Intensità
Converte l’Intensità
della radiazione in
Intensità di corrente
SCHEMA
DI UNO STRUMENTO A
DOPPIO RAGGIO
Il bianco (o riferimento) è costituito dal
solvente ad eccezione della sostanza di
cui si vuol esaminare l’assorbimento
La radiazione proveniente dal
MONOCROMATORE si divide in due raggi che
sono inviati contemporaneamente al campione
ed al solvente.
Il secondo raggio passa
attraverso il campione e
fuoriesce con l’Intensità
trasmessa Icampione
Il computer
registra
entrambe in
modo alterno e
calcola il
rapporto.
FOTOMETRIA
I valori di T sono convertiti in E o assorbanza (A)
Per risalire dai valori di E alla concentrazione della
soluzione in esame :
Noto il coefficiente di estinsione molare
Noto il cammino ottico
Si allestisce una CURVA STANDARD di una soluzione a
concentrazione nota
Assorbanza 280nm
Conoscendo il valore dell’assorbanza del campione si può
Interpolare graficamente il valore della sua concentrazione
1,25
1,00
.
0,75
0,50
0,25
0’5
1,0
1,5
2,0
2,5
Concentrazione albumina mg
Lo studio delle radiazioni assorbite da una sostanza
(SPETTRO DI ASSORBIMENTO) può essere utilizza
A SCOPO ANALITICO



Il colore delle sostanze è dovuto al fatto che esse
assorbono specifiche radiazioni e ne lasciano
passare o riflettono altre
SOSTANZA COLORATA: assorbe solo alcune
radiazioni che costituiscono la luce bianca e lascia
passare tutte le altre
SOSTANZA INCOLORE: non assorbe nessuna
radiazione che costituisce la luce bianca ma assorbe
radiazioni a lunghezza d’onda comprese
nell’ultravioletto o nell’infrarosso
Il massimo dell’assorbimento dipende dai gruppi
funzionali presenti nelle molecole ed identifica
LO SPETTRO DI ASSORBIMENTO
ASSORBIMENTO DELLA
LUCE ULTRAVIOLETTA
DA PARTE DEGLI Aa
AROMATICI
Il triptofano e la tirosina
Assorbono la luce
ultravioletta, ciò spiega
perché la maggior parte
delle proteine hanno un
caratteristico
assorbimento della luce
ad una lunghezza d’onda
di 280nm
Spettri di di assorbimento della luce da parte dei
comuni nucleotidi, gli spettri sono quasi identici,
per effettuare misure di assorbimento viene usata
la luce a 260 nm
I citocromi possono
essere distinti in base agli
spettri diassorbimento della
luce
LUNGHEZZA D’ONDA
Applicazioni


METODI DIRETTI
Sfruttano le proprietà ottiche delle molecole
analizzate
PROTEINE = 280 nm





ACIDI NUCLEICI = 260 nm
METODI INDIRETTI
Amminoacidi = ninidrina (570nm)
Proteine = biureto (540)
Zuccheri = proprietà riducenti
Enzimi = substrati o prodotti
Metodi enzimatici indiretti

Reazioni enzimatiche accoppiate in cui il prodotto viene
utilizzato come substrato in un’altra reazione nella quale è
coinvolta una sostanza cromofora
Glucosio ossidasi

Glucosio + O2 + H2 O
=
ac. Gluconico + H2 O2
perossidasi



H2 O2 + sost. Ridotta (incolore)
Glucosio + ATP =
=
sost. colorata
Glucosio-6-fosfato + ADP
Glucosio-6-fosfato + NADP = 6-fosfogluconato + NADPH
La riduzione dell’anello nicotinamidico produce una
nuova banda di assorbimento della luce con un
massimo a 340 nm
FLUORIMETRIA

Tecnica ottica quantitativa e qualitativa
Una molecola assorbe una radiazione elettromagnetica
Si produce uno stato eccitato instabile
nel ritornare allo stato basale

EMETTE ENERGIA A LUNGHEZZA D’ONDA MAGGIORE

L’energia della radiazione emessa è sempre inferiore a
quella assorbita, pertanto avrà una frequenza inferiore e
lunghezza d’onda superiore



SPETTROFLUORIMETRIA




Tecnica ottica di analisi qualitativa e quantitativa basata
sul fenomeno della fluorescenza.
La fluorescenza è un fenomeno di emissione di una
radiazione elettro-magnetica che si verifica in seguito ad
una transizione elettronica da uno stato energetico
superiore ad uno inferiore.
Affinché possa avvenire è necessario che una molecola
si trovi in uno stato eccitato.
L’energia della radiazione emessa è sempre inferiore a
quella assorbita, pertanto avrà una frequenza inferiore e
lunghezza d’onda superiore.
RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA DI UNO
SPETTROFLUORIMETRO
APPLICAZIONI

· Metodi diretti
Sfruttano la fluorescenza intrinseca delle molecole
da analizzare
Proteine 300-350 nm
Gruppi prostetici (400 600 nm)




· Metodi indiretti
Sfruttano le proprietà di sostanze che diventano
fluorescenti in seguito alla loro interazione con
le sostanze da analizzare.
Cloruro di dansile (DNS)
· Acido 1-anilinonaftalen-8-solfonico (ANS)
· Etidio bromuro (EB)
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BIOTECNOLOGIE



utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo
di produrre quantità commerciali di prodotti utili
migliorare le caratteristiche di piante ed animali
Ingegneria genetica: tecniche che consentono di
modificare il patrimonio genetico di organismi in
modo da trasferire da un essere vivente ad un altro
caratteristiche utili