Organizzazione dei genomi
e
del genoma umano (2)
Capitolo 9 + Articoli (importante da studiare!)
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Organizzazione del genoma
umano: le novita’ dal
sequenziamento completo del
genoma umano
Tesi di dottorato Ventura disponibile nel sito docente
Dati recenti …
Il genoma umano puo’ essere completamente compreso grazie al
completamento del Progetto Genoma Umano
Il confronto tra geni e sequenze e’ essenziale per la comprensione della
funzione ed evoluzione della specie. Attraverso la comparazione si possono
evidenziare regioni genomiche piu’ conservate e regioni genomiche meno
conservate
Tantissime caratteristiche e proprieta’ del genoma umano, e dei
vertebrati in generale, sono chiare alla luce dei fenomeni
evolutivi
PLASTICITA’ GENOMICA
La capacità del genoma di evolvere ed in tal modo di diversificarsi
tra specie e tra individui
La plasticità del genoma umano
Nel genoma umano esistono regioni particolarmente libere di evolversi,
sequenze che possono variare nel genoma senza che ci sia alcuna
conseguenza per l’individuo. Esempi di queste sono:
- i centromeri e le sequenze ripetitive dei
centromeri
-  regioni pericentromeriche e le duplicazioni
segmentali in esse presenti
Recentemente è stato scoperto un altro fenomeno evolutivo: il
r i p o s i z i o n a m e n t o d e l c e n t ro m e ro m e d i a n t e l a
neocentromerizzazione
Le scimmie antropomorfe
GGO
PTR
HSA
PPY
MMU
PTR
GGO
PPY
MMU
  Un po’ di dati sulle divergenze:
HSA-PTR (Pan troglodytes) 5.5 mya
HSA-GGO (Gorilla gorilla) 6.7 mya
HSA-PPY (Pongo pygmeus) 8.2 mya
HSA-MMU (Macaca mulatta) 20 mya
HSA in bandeggio C
Una prima differenza tra le specie di Primati e’ distribuzione
dell’eterocromatina costitutiva.
PTR in bandeggio C
GGO in bandeggio C
I segnali si evidenziano non solo ai centromeri ma anche a livello di telomeri e in
localizzazione interstiziale
PERCHE’?
Perche’?
In PTR e GGO le unità ripetute costituenti il centromero sono in
numero equivalente al numero di unità ripetute costituenti il telomero.
Nell’uomo, invece, gli unici elementi visibili in bandeggio C sono
l’eterocromatina centromerica e l’eterocromatina del braccio lungo
del cromosoma Y.
E cosa dire in termini di sequenza?
Per rispondere a questa domanda faccio uno studio
comparativo. Ad esempio, comparo il comportamento di
una specifica sonda in varie specie.
Di regola una sonda di un cromosoma umano riconosce la
porzione omologa sul cromosoma di un’altra specie. Se la
sonda è relativa ad una regione del cromosoma 8
riconoscerà una regione omologa al cromosoma 8.
e cosa accade invece per le sonde dei centromeri?
E’ possibile studiare l’evoluzione del cariotipo mediante l’IBRIDAZIONE
COMPARATIVA di sonde BAC (ottenute da un organismo specifico) su
vetrini della specie che si vuole studiare.
Sonda del cromosoma 4 ibridata su diversi primati
HSA
PTR
GGO
PPY
MMU
HSA pDMX1
Sonda alfoide
umana
Cromosoma X
GGO con pDMX1
Sonda alfoide
umana
cromosoma X
HSA pBR12
Sonda alfoide
umana
cromosoma XII
GGO con pBR12
Sonda alfoide
umana
localizzazione
multipla eccetto
omologo HSA12
E cosa dire delle sequenze alfoidi che
costituiscono il centromero?
A differenza delle altre sequenze genomiche, le
sequenze alfoidi centromeriche di una specie non hanno
omologhi nei corrispondenti cromosomi … eccezione e’
la sequenza alfoide del cromosoma X che si localizza in
tutte le Grandi Scimmie sempre sul cromosoma X
CONCLUSIONI
DA QUESTI DATI
SPERIMENTALI
E cosa dire delle sequenze alfoidi che
costituiscono il centromero?
A differenza delle altre sequenze genomiche, le sequenze alfoidi
centromeriche di una specie non hanno omolghi nei corrispondenti
cromosomi….eccezione e’ la sequenza alfoide del cromosoma X che
accende in tutte le Grandi Scimmie sempre il cromosoma X
Come mai le sequenze alfoidi pur cosi’ importanti non sono
conservate nelle linee evolutive?
Cosa e’ realmente importante?
La ripetizione degli elementi
e ... cosa dire delle sequenze telomeriche?
In quanto FUNZIONALMENTE importanti le sequenze
telomeriche sono estremamente conservate nell’evoluzione
La plasticità del genoma umano
Nel genoma umano esistono regioni particolarmente libere di evolversi,
sequenze che possono variare nel genoma senza che ci sia alcuna
conseguenza per l’individuo. Esempi di queste sono:
- i centromeri e le sequenze ripetitive dei
centromeri
-  regioni pericentromeriche e le duplicazioni
segmentali in esse presenti
Recentemente è stato scoperto un altro fenomeno evolutivo: il
r i p o s i z i o n a m e n t o d e l c e n t ro m e ro m e d i a n t e l a
neocentromerizzazione
Di norma sonde ottenute dalle regioni eucromatiche non
pericentromeriche di una specie riconoscono tra le varie specie la stessa
regione (indicando le regioni di sintenia uomo-specie).
Le similarita’ tra regioni pericentromeriche invece ...
Organizzazione regione pericentromerica HSA10
D10S141 A e B
duplicazione 110-180kb
stesso orientamento (>90%)
10p
10q
cen
300-350kb
300-350kb
ZNF11/33/37 A e B
duplicazione 210-250kb
Invertito (>95%)
Sonda pericentromerica della regione 10q11
BAC rp11-80b18
HSA
Si evince che esistono delle regioni di similarita’ condivise tra le
regioni pericentromeriche di diversi cromosomi, all’interno della
s t e s s a s p eci e (sim ile alla distribu zione de lle r e gioni
subtelomeriche!!!)
Sonda pericentromerica HSA10 su PTR
BAC rp11-80b18
La stessa sonda riconosce in
scimpanze’ regioni
cromosomiche differenti
rispetto a uomo. Indicando
che la distribuzione delle
sequenze pericentromeriche
ha seguito una storia a se
stante per il gruppo dello
scimpanze’!
PTR
Sonda pericentromerica HSA10 su GGO
BAC rp11-80b18
Lo stesso discorso vale per il
gorilla distinto da uomo e
scipanze’.
IMP. L’omologia per la regione
pericentromerica del chr10 e’
mantenuta SEMPRE
GGO
Sonda pericentromerica HSA10 su PPY
BAC rp11-80b18
Piu’ la distanza evolutiva
aumenta, minori sono le regioni
in cui abbiamo segnale!!!
PPY
La diffusione tra le varie regioni pericentromeriche e’ tipica
dei primati “superiori”
Sonda pericentromerica HSA10 su MMU
BAC rp11-80b18
X
X
In macaca il segnale si ritrova
solamente sulla regione
sintenica a uomo al chr10
MMU
In definitiva …
Le sequenze che fiancheggiano il centromero del cromosoma
10 umano hanno un’organizzazione estremamente complessa
in quanto sono costituite da sequenze braccia-specifiche,
duplicazioni stabili e sequenze instabili con omologia verso i
telomeri e le localizzazioni centromeriche di altri cromosomi.
Queste sequenze hanno subito (e subiscono ancora) un
notevole numero di rimaneggiamenti tanti da sdisperderli nei
genomi.
Jackson MS, Rocchi M, Thomson G, Hearn T, Crozier M, Guy J, Kirk D, Mulligan
L, Ricco A, Marzella R, Viggiano L, and Archidiacono N.
Hum. Mol. Genet. 8:205-215 (1999)
Inoltre…
E’ sorprendente come le sequenze delle regioni
pericentromeriche sembrano aver subito un elevatissimo livello
di duplicazione, trasposizione, inversione e delezione, in altre
parole un’evoluzione piu’ rapida e complessa rispetto alle regioni
non pericentromeriche analizzate fino ad oggi.
Le regioni attorno ai centromeri sono
caratterizzate da alta plasticita’
Le regioni pericentromeriche sono “piu’ tolleranti” delle altre regioni
genomiche nell’accettare duplicazioni e variazioni di sequenza.
ESISTE UNA MINORE FORZA SELETTIVA
La plasticita’ del genoma umano
Nel genoma umano esistono regioni particoalrmente libere di evolversi,
sequenze che possono variare nel genoma senza che ci sia alcuna
conseguenza per l’individuo. Esempi di queste sono:
- sequenze ripetitive dei centromeri
-  regioni pericentromeriche e le duplicazioni
segmentali in esse presenti
Regioni del genoma piu’ grandi di 1 Kb senza “motivi”
ricorrrenti che le rendono dissimili dalle altre sequenze ripetute
del genoma con una percentuale di similarita’ >90%
Duplicazioni segmentali, evidenziate mediante FISH
e scoperte con analisi di sequenza
Evan Eichler
Programmi informatici per trovare le
similarita’ di sequenza
Tutti i programmi di ricerca di similarita’ si basano sul confronto di
sequenza. Le due sequenze che si vogliono paragonare si allineano e si
da’ un punteggio a questo allineamento, cio’ che cambia tra i
programmi e’ in genere il modo di fare vedere il risultato e il modo di
calcolare22il punteggio di similarita’.
22
Programmi informatici per trovare le
similarita’ di sequenza
Tutti i programmi di ricerca di similarita’ si basano sul confronto di
sequenza. Le due sequenze che si vogliono paragonare si allineano e si
da’ un puntegio a questo allineamento, cio’ che cambia tra i
programmi e’ in genere il modo di fare vedere il risultato e il modo di
calcolare il punteggio di similarita’.
22
22
Allineare due sequenze
•  Cosa vuol dire allineare due sequenze?
seq1: TCATG
seq2: CATTG
TCAT-G
.CATTG
4 caratteri uguali
1 inserzione/delezione
GENEALYZER OUTPUT
Duplicazioni segmentali
Frammenti di DNA di varia dimensione (anche maggiore di 200 Kb) che condividono
il 95-99% di similarita’.
Possono essere intercromosomici
Possono essere intracromosomici
Duplicazioni segmentali con similarita’ 98-100%
 Sequenze duplicate (intra+inter)
 Centromeri e p acrocentrici
10Mb
Dupliconi del cromosoma 22 (E.E.Eichler)
Comparazione del contenuto in SD
Famiglie multigeniche
 
40% del genoma e’ composto da gruppi di sequenze non alleliche che
mappano percio’ in loci diversi, ma sono strettamente correlate, sono presenti cioe’
sequenze con un numero di copie multiple.
 Il numero di copie di una sequenza puo’ essere identificato e studiato attraverso:
 il sequenziamento e bioinformatica per identificare l’appartenenza di nuove sequenze ad
una famiglia gia’ descritta e definire il grado di omologia fra le diverse copie.
 L’analisi su Southern blot e/o FISH di una nuova sequenza clonata rivela la presenza di un
pattern complesso di ibridazione. La sequenza puo’ quindi essere utilizzata per identificare e
clonare le altre. Lo screening di una library genomica identifica un numero di positivi superiori
all’atteso e conferma la supposizione consentendo il clonaggio delle sequenze correlate.
 A partire da una sequenza nota di cui e’ noto esistere copie nel genoma attraverso l’uso di
primers degenerati delle regioni che si suppone siano conservate, si possono amplificare
tramite PCR,le altre sequenze
Famiglie multigeniche
  Due sequenze vengono definite come appartenenti alla
stessa famiglia quando presentano omologia di sequenza
anche in una regione ristretta della sequenza. Si distinguono
in:
  Famiglie multigeniche: DNA ripetuto che contiene geni
funzionali
 Famiglie
di sequenze di DNA non genico
Famiglie multigeniche
Le famiglie presentano variabilita’ nell’omologia con la sequenza di
riferimento e nel grado con cui le sequenze conservate definiscono
la famiglia. Ne deriva che l’appartenenza ad una famiglia e’ data
non solo dall’omologia complessiva, ma dal presentare un
dominio condiviso o organizzazione simile. Si possono presentare
1.  raggruppati;
2. interspersi.
Famiglie multigeniche (con elementi raggruppati)
Alcuni membri (valido per il gruppo dei raggruppati che per i dispersi)
possono essere non funzionali: pseudogeni
Pseudogeni si distinguono in:
 Pseudogeni:
1. non processati
2. processati
 Pseudogeni non processati:
1.convenzionali
2.espressi
 Copie non funzionali del DNA genomico di un gene.
Contengono esoni, introni e spesso le sequenze fiancheggianti. Data la loro somiglianza
nell’organizzazione genomica, la loro natura non funzionale puo’ essere riconosciuta, a livello
di sequenza, dalla presenza di codoni di stop nella regione corrispondente alla porzione
codificante del gene funzionale o dalla presenza di un’elevato numero di mutazioni ognuna della
quali originerebbe una molecola mutante.
Sono comuni nelle famiglie di geni raggruppati
 Talvolta possono venire espressi a livello di RNA o addirittura come
polipeptide, che non viene utilizzato nella molecola funzionale:
gene della globina-θ, sicuramente viene espresso, ma non se ne riscontra la
presenza nell’emoglobina funzionale
Pseudogeni I
 Derivano da duplicazione genica rendono un locus hot-spot di
mutazione
Raggruppamento
α-γλοβινε 16p13
ξ2
ψξ1
ψα2
Raggruppamento
β-γλοβινε 11p15
ε
Gγ
Aγ
Raggruppamento
ormone della
crescita 17q23
hCH-N
CS-L
ψα1
ψβ
CS-A
α2
α1
δ hCH-V
θ
β
CS-B
Pseudogeni I
 Derivano da duplicazione genica e accumulo progressivo di
mutazioni
pressione
selettiva
A
lenta
duplicazione
diversificazione
genica
rapida
A
o
o
Funzione
originale
Funzione
A2 correlata
Nessuna
ψA funzione
Pseudogeni I
  Pseudogeni non processati sono presenti nel genoma in regioni
non sinteniche con la copia codificante.
  Caratteristica di questi pseudogeni e’ di essere copie tronche del
gene. La loro localizzazione e’ prevalentamente pericentromerica e la
loro presenza in queste viene ascritta alla plasticita’ pericentromerica
che costituisce un aspetto particolare della piu’ generale plasticita’
insita nel genoma umano….duplicazioni segmentali
Pseudogeni II
 Pseudogeni processati: sono copie, in genere, non funzionali degli esoni di
un gene espresso e si ritrovano nelle famiglie dei geni interspersi. La loro
origine sembrerebbe dovuta all’integrazione di una sequenza di DNA
originatesi per azione di una trascrittasi inversa.
Geni si distinguono in tre categorie in relazione all’RNApol che li trascrive:
classe I (geni per l’rRNA), classe II (geni per l’mRNA) e classe III (geni per i
tRNA, RNA 5S ed RNA7SL)
  se sono copie di trascritti dalla RNApolimerasi II di solito non sono espressi perche’ privi del
promotore. Possono venire espressi se integrati vicino ad un promotore, in questo caso
l’espressione potrebbe non essere nello spazio e nel tempo quella originaria (espressione selettiva
in un tessuto specifico e/o in uno specifico momento nello sviluppo: geni espressi nel testicolo,
SRY)
 se sono copie di trascritti dalla RNApolimerasi III possono avere al loro interno il promotore
ed essere espressi. Possono raggiungere un elevato numero di copie (sequenze Alu)
Articoli da studiare
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