Enzimi amilolitici
L’amido, uno dei polimeri più abbondanti sulla Terra, è un polimero di molecole
di glucosio, legate mediante legami a-glicosidici:
Amilosio  glucano lineare con legami a-1,4
Amilopectina  glucano lineare con legami a-1,4 e ramificato con legami a-
1,6
Le amilasi (a-amilasi, -amilasi, glucoamilasi) scindono le catene dei costituenti
dell’amido, introducendo una molecola d’acqua, a livello dei legami glucosidici.
ENDOAMILASI
PM 15-50k
Industria alimentare
Attaccano all’interno delle catene del polimero a qualsiasi punto.
Scindono il legame a-1,4 e portano alla formazione di DESTRINE di diversa lunghezza
(eritrodestrine con PM elevato e le acrodestrine con PM più basso).
Es. la ptialina salivare, l’amilasi pancreatica, la takadiastasi (a-amilasi da A. orizae) e
diverse amilasi di microrganismi.
ESOAMILASI
(da vegetali o microrganismi)
attaccano le estremità non riducenti delle catene di a-D-glucosio e liberano
sia molecole di maltosio, idrolizzando il penultimo legame a-1->4, di glucosio,
sia molecole di glucosio, idrolizzando l’ultimo legame a-1->4 o a-1->6 o a-1->63.
Nel primo caso abbiamo le -amilasi,
nel secondo caso le a-1->4 glucosidasi: glucoamilasi o -amilasi o amiloglucosidasi.
Le a-1->6 glucosidasi sono l’isoamilasi (enzima deramificante),
la pullulanasi (enzima R), e la destrinasi limite. Esse completano l’azione
delle amilasi del tubo digerente.
Utilizzate per la preparazione di sciroppi di glucosio.
Endoamilasi salivari e pancreatiche:
hanno una elevata attività, con pH ottimale: intorno a 7.
L’amilasi pancreatica può idrolizzare 4 milioni di volte il suo peso in amido.
Amilosio: lineare
Amilopectina: ramificazioni circa 20-30 legami alfa
5
Maltosaccaridi lineari con grado di
polimerizzazione (GP) 6-22 C
Sebbene le diverse amilasi catalizzino la stessa reazione – idrolisi del legame aglicosidico sullo stesso substrato – sono differenti sia per struttura che per
meccanismo di reazione.
STRUTTURA
Sia le a- che le -amilasi hanno una struttura a TIM-barrel [(/a)8-barrel
fold]. (TIM= trioso-P-isomerasi)
Il dominio catalitico consiste in una struttura a botte formata da 8 foglietti b
paralleli, circondati da 8 a-eliche, collegate da regioni loop di varia lunghezza
(le botti non sono identiche nei dettagli).
Barrel= barile
Colorazione dal blue (N-terminale) al rosso (Cterminale)
La struttura delle glucoamilasi (-amilasi) consiste di 6 a-eliche parallele,
circondate da altre 6 a-eliche, parallele tra loro ma antiparallele rispetto alle
prime [(a/a)6-barrel fold], collegate anch’esse da regioni loop di varia
lunghezza.
Barrel= barile
In base alle differenze e alle similarità delle strutture primarie, gli enzimi
amilolitici sono stati classificati nella famiglia delle idrolasi glicosidiche (GH, EC
3.2.1.-):
1. a-amilasi – clan GH-H (famiglie GH13, GH70 e GH77)
2. -amilasi – famiglia GH14
3. glucoamilasi – famiglia GH15.
Questa classificazione riflette anche le
differenze nel meccanismo di reazione tra i tre
tipi di amilasi.
http://www.cazy.org/
Clan GH-H: famiglie GH13, GH70 e GH77
Comprende non solo idrolasi (EC 3), ma anche
transferasi (EC 2) e isomerasi (EC 5): GH13,
GH70 e GH77 rappresentano la famiglia delle
a-amilasi.
Le caratteristiche comuni ai circa 30 enzimi del
clan GH-H sono:
1. Dominio catalitico TIM-barrel [(/a)8barrel fold], con un lungo loop che unisce
il filamento 3 con l’elica a3, noto come
dominio B;
2. Stesso meccanismo di reazione, in cui l’aspartato del filamento 4 funge
da base (nucleofilo) e il glutammato 5 funge da donatore di protoni
(catalisi acido-base), con l’aiuto di un terzo residuo di aspartato 7,
essenziale per il legame con il substrato
3. Utilizzano un meccanismo che mantiene la conformazione anomerica del
legame a-glicosidico.
Presentano strutture primarie
Molto diverse, sono conservati
Dagli 8 ai 10 residui, essenziali
Per l’attività enzimatica
E 
H 3 e 7
D 4 e 7
Famiglia delle a-amilasi GH13
Comprende più di 30 enzimi e più di 2000 sequenze e rappresenta la più
importante famiglia del clan GH-H.
Famiglia delle -amilasi GH14 e delle glucoamilasi GH15
Entrambe utilizzano un meccanismo di inversione della conformazione
anomerica del legame a-glicosidico: i prodotti di reazione sono infatti anomeri.
-amilasi GH14
I residui coinvolti nella catalisi sono
Glu186 e Glu380, al C terminale dei
filamenti 4 e 7, rispettivamente.
Indispensabile anche il ruolo di
Asp101 e Leu383.
Glucoamilasi GH15
I residui di Glu179 e Glu400 sono i
residui chiave per l’attività catalitica.
Amilasi utilizzate nei processi industriali:
a-amilasi
L’enzima più utilizzato per la degradazione industriale dell’amido è la aamilasi, una a-1,4-glucanoidrolasi.
L’enzima (EC 3.2.1.1) contiene una
caratteristica tasca di legame per il
substrato, che può accogliere da 4 a
10 unità di glucosio della molecola
di substrato, sebbene ogni sito di
legame ha affinità per una sola
unità di glucosio della catena
polisaccaridica di amido.
Le differenze, strutturali e cinetiche, tra le varie a-amilasi sono determinate da:
1. numero di siti di legame per il substrato
2. posizione del dominio catalitico
3. lunghezza del frammento oligosaccaridico rilasciato in seguito all’idrolisi
4. natura del prodotto finale
5. Capacità di rompere un legame a-1,4 in prossimità di una ramificazione a1,6
6. temperatura ottimale di reazione (varia tra i 25 e i 95°C)
7. presenza di ioni Ca2+
Le a-amilasi catalizzano la rottura del legame a-1,4-glicosidico nella porzione
interna della molecola di amido, causando una rapida diminuzione del peso
molecolare.
Possono essere divise in:
1. a-amilasi che provocano liquefazione  substrato con più di 15 unità di
glucosio
2. a-amilasi che provocano saccarificazione  (processo industriale che
consiste in una idrolisi amilasica dell’amido gelatinizzato*, che fornisce
essenzialmente maltosio).
L’idrolisi prolungata dell’amilosio produce maltosio, maltotriosio e catene
oligosaccaridiche di varia lunghezza, cui generalmente segue un secondo stadio
della reazione che produce glucosio dal maltotriosio.
* Gelatinizzazione: perdita della struttura semicristallina del granulo di amido in
seguito a trattamento idrotermico ( >50°C). Riguarda soprattutto l’amilosio di
cui aumenta la suscettibilità alla idrolisi.
Le a-amilasi vengono utilizzate in un gran numero di processi industriali, che
avvengono sotto diverse condizioni fisiche e chimiche.
Ogni enzima è specifico per ciascuna applicazione
Generalmente, enzimi termostabili vengono preferiti, visto che le alte
temperature:
 favoriscono la gelatinizzazione dell’amido
 abbassano mediamente la viscosità
 accelerano la velocità della reazione
 abbassano il rischio di contaminazioni batteriche
 inattivano gli enzimi dei prodotti alimentari, che potrebbero portare alla
formazione di prodotti indesiderati durante la reazione.
L’a-amilasi termostabile più utilizzata è quella prodotta dal Bacillus
licheniformis  rimane attiva per diverse ore alla temperatura di 90°C
Pyrococcus woesei  40-130°C (optimum 100°C, pH 5.5)
Pyrococcus furiosus  40-130°C (optimum 100°C, pH 6.5-7.5)
Tuttavia, per i processi industriali, le a-amilasi dovrebbero rimanere attive ad
un pH intorno a 4.0
Nessuna delle a-amilasi termostabili ha una stabilità a tale pH, quindi studi di
ingegneria proteica stanno cercando di favorire questa proprietà.
Amilasi utilizzate nei processi industriali:
Enzimi deramificanti
Ci sono due principali gruppi di enzimi endo-deramificanti, che tagliano il legame
a -1,6-glicosidico di amilopectina, glicogeno, pullulani e relativi oligosaccaridi:
Pullulanasi (EC 3.2.1.41)  attaccano il legame a-1,6, liberando oligosaccaridi
lineari di glucosio a-1,4.
Neopullulanasi e amilopullulanasi (EC 3.2.1.135 e 3.2.1.1/41) attive verso
entrambi i legami (a-1,4 e a-1,6)
Le pullulanasi sono piuttosto termostabili:
Klebsiella pneumoniae, Bacillus acidopullulyticus  50-60°C
Thermus caldophilus  75°C - fino a 90°C, pH 5.5
La maggior parte delle amilopullulanasi viene estratta da batteri termofili:
Bacillus subtilis
Thermoanaerobium brockii
Clostridium thermosulphuricum
Thermus acquaticus
Pyrococcus woeser  105°C, pH 6.0
Amilasi utilizzate nei processi industriali:
Eso-idrolasi
-amilasi (EC 3.2.1.2)
glucoamilasi (EC 3.2.1.3)
Entrambe agiscono alle estremità non riducenti di amilosio, amilopectina e
glicogeno, producendo carboidrati di basso peso molecolare in
conformazione -anomerica.
Il principale prodotto finale dell’idrolisi catalizzata dalla -amilasi è il
maltosio; la glucoamilasi produce glucosio.
Strutturalmente, questi due enzimi fanno parte rispettivamente delle famiglie
GH14 e GH15, ma, mentre le -amilasi presentano una struttura (/a)8-barrel
fold, le glucoamilasi hanno una struttura (a/a)6-barrel fold.
Tutte le -amilasi non sono in grado di tagliare i
legami a-1,6 e i prodotti finali sono rappresentati
da maltosio e destrine “-limit” ( polimeri
prodotti dall’idrolisi dell’amilopectina con amilasi, che non può idrolizzare i punti di
ramificazione a-1, 6)
Quando quindi la degradazione dell’amilopectina è completa, solo il 50-60%
risulta convertito in maltosio. Solo nel caso dell’amilosio, che non presenta o
che presenta poche ramificazioni, la resa è del 75-90%.
L’accumulo di destrine -limit non è desiderabile perché aumenta la viscosità
degli sciroppi di maltosio.
Le -amilasi sono presenti in molte piante superiori e in microrganismi quali
Pseudomonas, Bacillus e Streptococcus, ma non resistono a temperature
superiori ai 60°C.
Le glucoamilasi tagliano preferenzialmente i legami
a-1,4, ma possono tagliare anche quelli a-1,6 e a-1,3
le glucoamilasi sono capaci di degradare
completamente l’amido in glucosio
A concentrazioni medie di glucosio del 30-35% durante la reazione, le
glucoamilasi possono anche catalizzare la reazione inversa e formare
maltosio, isomaltosio e altri sottoprodotti, abbassando quindi la resa del
processo.
Fonti:
- Piante
- Animali
- Microrganismi (Saccharomices, Endomycopsis, Aspergillus, Penicillium,
Mucor, Clostridium)
45-60°C (come le -amilasi, sono rare tra i microrganismi termofili)
pH 4.5-5.0
Applicazioni
Idrolizzati di amido
La reazione di degradazione dell’amido avviene in 2 step.
1. Liquefazione
Il 30-40% dei granuli di amido è gelatinizzato, ad una temperatura di 90110°C. L’aggiunta di endoamilasi termostabili (EC 3.2.1.1) in questa fase del
processo protegge dal rapido aumento della viscosità della soluzione di
amido, causata dal rilascio di amilosio durante il rigonfiamento dei granuli.
L’idrolisi enzimatica dell’amilosio da parte dell’a-amilasi procede fino a
quando la lunghezza della catena del prodotto di reazione contiene circa 1020 unità di glucosio: a questo punto, infatti, il frammento di amido prodotto
non riesce più a legare bene l’enzima.
Si produce quindi una miscela di malto-oligosaccaridi che contengono
legami a-1,6 che l’a-amilasi non è stata in grado di rompere.
2. Saccarificazione
Questo processo avviene a temperature più basse e porta all’idrolisi degli
oligosaccaridi con formazione di glucosio o maltosio in reazioni catalizzate
dalle glucoamilasi (EC 3.2.1.3) o dalle -amilasi (3.2.1.2), rispettivamente.
La resa della reazione può essere aumentata (fino al 94%) aggiungendo
pullulanasi (EC 3.2.1.41) o altri enzimi deramificanti l’uso delle pullulanasi
aumenta la resa fino al 94%.
Preparazione di idrolizzati d’amido
Ca2+ aumenta la
stabilità dell’enzima
DE= destrosio
equivalente
Destrosio= glucosio
Per l’amido: DE=1
Per il maltosio: DE=ca.50
Per il glucosio puro: DE=100
Preparazione di idrolizzati d’amido
a-amilasi termostabili
(B. lichenifromis  90°C, pH 5.5-6.0)
-amilasi e glucoamilasi  non termostabili
La necessità di aggiustare pH e
temperatura, rendono il processo
più costoso e rendono necessario un
ulteriore passaggio cromatografico
sul prodotto finale per eliminare
l’NaCl formatosi
Un importante sviluppo di questo processo potrebbe essere rappresentato dalla
degradazione dell’amido in un unico step:
1.
a-amilasi più stabile termicamente, che richieda un pH più basso e non
richieda l’utilizzo di sali di calcio per la propria attività
2.
Tutti gli enzimi della fase di saccarificazione attivi a condizioni compatibili
con quelle dell’a-amilasi  a-glucosidasi (EC 3.2.1.20)  idrolisi del
legame a-1,4 all’estremità non-riducente e a-1,6, con formazione di
glucosio come prodotto finale.
Isomerizzazione del glucosio
L’isomerizzazione del glucosio derivato dall’amido in fruttosio conferisce una
maggiore dolcezza agli sciroppi comunemente utilizzati per i prodotti alimentari
e le bevande (saccarosio 1; fruttosio 1,35-1,7; glucosio e galattosio 0,75;
maltosio 0,4).
Lo sciroppo di fruttosio viene generalmente prepaarto utilizzando un processo in
continuo catalizzato dalla glucosio isomerasi (EC 5.3.1.5) immobilizzata, ad una
temperatura di 55-60°C.
A queste condizioni, solo il 40-42% di glucosio viene convertito in fruttosio. La
resa del processo può essere aumentata alle alte temperature che spostano
l’equilibrio della reazione verso un aumento della concentrazione del fruttosio.
Questo però fa diminuire la vita media dell’enzima, estratto da un batterio
mesofilo, e aumenta la quantità di sottoprodotti che si formano in seguito alla
reazione di Maillard che interviene proprio ai valori di pH leggermente alcalini
necessari per l’attività della glucosio isomerasi.
Anche in questo caso è necessaria una gel filtrazione per allontanare il glucosio e
altri grossi polissaccaridi presenti.
Questo passaggio può essere evitato utilizzando una glucosio isomerasi
maggiormente termostabile, che sia attiva ad un pH più acido, in modo da
evitare indesiderate reazioni collaterali.
Produzione di trealosio
Gli sciroppi di amido o di maltosio possono essere
trasformati in trealosio, in una reazione catalizzata
da un enzima isolato da microrganismi termofili o
mesofili.
Il trealosio è un disaccaride stabile, non riducente,
formato da un legame a-1,1 tra due molecole di
glucosio.
E’ coinvolto nella protezione delle strutture biologiche durante il congelamento,
essiccamento o la cottura. I cristalli amorfi di trealosio :
 intrappolano le molecole biologiche, senza modificarne la struttura nativa e
limitando di conseguenza i danni alle sostanze durante l’essiccamento
 sono permeabili all’acqua ma impermeabili agli esteri aromatici idrofobici:
questo limita la perdita di composti aromatici responsabili de sapori e questo
favorisce la produzione di cibi essiccati che mantengano lo stesso sapore del
prodotto fresco.
Il trealosio inoltre:
 è leggermente dolce
è solubile
 è stabile a pH bassi
 riduce l’attività dell’acqua
 ha bassa igroscopicità
 abbassa la temperatura di congelamento
 non caramellizza
 non subisce la reazione di Maillard
prezioso ingrediente alimentare
Viene utilizzato per:
bevande, cioccolata e caramelle, prodotti da forno, latticini, derivati della
frutta……..
Gli enzimi utilizzati per la produzione di trealosio dall’amido sono:
1.maltooligosil-trealosio sintasi  converte il legame a-1,4 terminale
dell’estremità riducente del maltooligosaccaride nel legame a-1,1 del
trealosio
2.maltooligosil-trealosio trealo-idrolasi  rimuove il trealosio durante
l’idrolisi del legame a-1,4 tra la seconda e la terza unità di glucosio, ripetendo
questa operazione fino a quando la catena oligosaccaridica rimanente
consiste di 2, massimo 3 unità di glucosio.
Il maltooligosaccaride di partenza viene prodotto trattando l’amido liquefatto
con enzimi deramificanti.
Sintesi di ciclodestrine
Gli enzimi amilolitici (batterici) vengono utilizzati anche per la produzione di
ciclodestrine.
1.
a-amilasi e pullulanasi  oligosaccaridi non ramificati
2. Ciclomaltodestrina glucanotransferasi  taglio degli oligosaccaridi
lineari per ottenere oligosaccaridi di 8 unità. Questo enzima è
estremamente termostabile (fino a 100°C) e possiede anche un’attività
a-amilasica e questo consente la produzione di ciclodestrine senza
l’aggiunta delle a-amilasi per la liquefazione preliminare.
A causa della struttura elicoidale di questi
oligosaccaridi, le due estremità di ciascuna
molecola sono molto vicine e di conseguenza
possono facilmente unirsi a formare la
struttura caratteristica delle ciclodestrine.
Il prodotto finale è una miscela di
a-, - e -ciclodestrine, a 6, 7 o 8
residui di glucosio con legami a1,4.
Le ciclodestrine hanno una
struttura conica in cui i gruppi
ossidrilici sono localizzati sulla
superficie, mentre l’interno è
apolare e può facilmente formare
complessi
con
molecole
idrofobiche .
Es.
1. Rimozione dell’amaro dai succhi
di agrumi
2. Protezione
dei
lipidi
dall’ossidazione
3. Rimozione del colesterolo dalle
uova
Incapsulaggio di principi aromatici