Crioconservazione
Dr. F.M. Fusi
Congresso Internazionale di Ginecologia
Oncologica
Tumori Germinali, Stromali e Forme Rare
Stato dell’arte, Novità e Prospettive
Fertilità dopo il cancro
In circa 200000 donne tra i 20-45 anni ogni anno
è diagnosticato un cancro
Il 79% sopravvivono a 5 anni e il 74% a 10 anni
ai tumori che compaiono in queste fasce di età,
rendendo la preservazione della fertilità un
argomento importante (SEER National Cancer
Institute, Surveillance Research Program, 2008)
Premessa
Diverse classi di chemioterapici, come gli agenti alchilanti,
tra cui la procarbazina e la ciclofosfamide, sono molto
tossici per le ovaie (Lee et al 2006)
Le terapie di preparazione ai trapianti di cellule staminali
sono inoltre molto tossiche (Meirow et al 1999)
Preservazione della fertilità
Mantenimento della funzione uterina
Mantenimento della funzione ovarica
a) riduzione dei danni da chemioterapici
b) conservazione di ovaie o parti di ovaio
c) conservazione di ovociti
maturi
maturati in vitro
Mantenimento della funzione
uterina
 Nel caso di tumori ovarici in cui sia
possibile mantenere intatto l’utero, così
come in tutti i tumori non genitali, l’opzione
più semplice è il ricorso alla ovodonazione.
 La ovodonazione rappresenta però una
opzione gravata da problemi etici,
psicologici e legali
Protezione dai chemioterapici
Studi nei ratti suggeriscono che l’uso di analoghi del
GnRH può proteggere i gameti femminili dagli insulti
dei chemioterapici (Ataya e Moghissi 1989)
Il GnRHa nell’uomo agisce solo dopo il picco di LH, e
non c’è legame ai follicoli preovulatori (Brus 1997)
Protezione dai chemioterapici
Gli studi clinici effettuati sull’uomo sono controversi, e
non riescono a dimostrare un effetto dei GnRHa nella
prevenzione della POF da chemioterapici
(Waxman et al, 1987; Blumenfeld et al 1996, Revel et al
2002)
Protezione dai chemioterapici
Un recente studio italiano su donne sottoposte a
chemioterapia dopo tumore alla mammella indica una
percentuale di ripresa della funzione ovarica del 77% in
donne che assumevano triptorelina contro il 58% di quelle
che non la assumevano
(Del Mastro 2010)
Protezione dai chemioterapici
Tra i supposti meccanismi di azione dei chemioterapici c’è
la possibilità di indurre apoptosi. In particolare sembrerebbe
che sia coinvolto il sistema Bax (promotore di apoptosi) e
Bc12 (protettivo) (Basu e Haldar, 1988)
L’uso di farmaci anti-apoptotici appare pertanto interessante
(Revel et al 2002)
Criopreservazione
Tessuto ovarico o ovociti?
Problematiche per il congelamento di
ovociti
- L’ovocita è una cellula in cui il rapporto tra superficie e
volume è minimo. Pertanto le fratture della membrana o la
formazione di cristalli intracellulari lo danneggiano
facilmente
- Il DNA, organizzato nello spindle, non è protetto dalla
membrana nucleare, ma libero nel citoplasma
Conservazione di tessuto ovarico
La conservazione della corteccia ovarica presenta il
vantaggio che la maggior parte dei follicoli primordiali
sopravvive al congelamento (Tao 2008)
Dopo il trapianto però la maggior parte dei follicoli è
perduta durante il fenomeno della rivascolarizzazione
(Liu et al 2002, Nisolle et al 2007)
Conservazione di tessuto ovarico
Il gruppo di Donnez nel 2004 ha presentato la nascita di un
bambino da ovocita ovulato dopo un trapianto di corticale
ovarica criopreservata (Lancet)
Riposizionamento del tessuto
ovarico
 - rene
 - sottocutaneo
 - parete addominale
 - ovaio residuo (previa decorticazione
dell’ovaio e applicazione di colle di fibrina)
Crioconservazione di follicoli
I follicoli primordiali/preantrali isolati dalla corticale
ovarica possono essere criopreservati con congelamento
lento o vitrificazione.
Allo scongelamento devono andare incontro a
maturazione in vitro
Il congelamento lento
Con l’entrata in vigore della legge 40/2004 in Italia, primo
paese al mondo, si prese in considerazione l’ipotesi di
congelare ovociti invece che embrioni
Il congelamento lento, mutuato dalla criopreservazione
embrionaria, sembrava la strada più promettente
Il congelamento lento
Consiste nel proteggere l’ovocita con crioprotettanti
zuccherini, che determinino la fuoriuscita graduale dell’acqua
dalla cellula uovo, e la discesa della temperatura graduale e
controllata, fino al -150, punto in cui gli ovociti possono
essere immessi in azoto liquido
Il congelamento lento
- Poco efficiente (sopravvivenza degli ovociti nella
percentuale del 40-60%
- Embrioni poco vitali (implantation rate 5%)
- Deludente e costoso (15% di gravidanze sui transfer
effettuati)
La Vitrificazione
La '''vitrificazione''' basa il suo principio sul fatto che l'acqua
non fa in tempo a formare cristalli di ghiaccio, grazie alla
viscosità di agenti crioprotettivi ad alta concentrazione e
portati a bassa temperatura con velocità altissima.
vitrification of 3rd day embryo
thawing of 3rd day embryo
Modello ovodonazione (Cobo et al)
Of 693 oocytes, 666 (96.1%) survived.
A total of 487 (73.1%) were normally fertilized.
Nº Embryo transfers
Embryos transferred (mean ± SD)
Pregnancy rate/transfer
Implantation rate (Nºsacs/ Nº embryos transferred)
Multiple pregnancy rate (twin)
Miscarriage rate
Biochemical pregnancy
Ongoing pregnancy rate
57
117 (1,99 ± 3,7)
36 (63.2)
45 (38.5)
11 (30.5)
6 (16.6)
5 (13.9)
25 (69.4)
Embryo Development of fresh versus vitrified metaphase II oocytes after ICSI
Rienzi et al
Patients included (N = 40)
Number of warmed oocytes (mean ± SD)
Number of embryos transferred (mean ± SD)
Number of embryo transfer performed (%)
Clinical pregnancy rate per cycle (%)
Clinical pregnancy rate per transfer (%)
Ongoing pregnancy rate per cycle (%)
Ongoing pregnancy rate per transfer (%)
Implantation rate (%)
Ongoing implantation rate (%)
3.1 ± 0.30
2.3 ± 0.88
39/40 (97.5)
15/40 (37.5)
15/39 (38.5)
12/40 (30.0)
12/39 (30.8)
19/93 (20.4)
16/93 (17.2)
Fresh ICSI
Fertilization (2PN) per sibling 100/120 (83.3)b
oocyte
Fertilization (2PN) per injected 100/120 (83.3)b
oocyte
Normal 2PN morphology
96/100 (96.0)c
Vitrified/Warmed ICSI
(%)
Absolute
difference (%)
(95% CI)
OR (95% CI)
95/124 (76.6)a
–6.73 (–16.6 to
3.39)
–4.17 (–14.0 to
5.7)
–5.47 (–13.4 to
1.84)
2.5 (–2.82 to
8.22)
0.83 (–3.09 to
5.1)
2.51 (–1.75 to
7.47)
–2,11 (–7.3 to
1.9)
–0.43 (–14.2 to
13.3)
5.16 (–8.49 to
18.6)
–6.84 (–14.6 to
0.42)
0.65 (0.33 to
1.29)
0.76 (0.37 to
1.53)
0.39 (0.08 to
1.49)
2.05 (0.42 to
12.9)
2.01 (0.10 to
119.9)
4.08 (0.39 to
203.5)
0.0 (0.00 to
0.23)
0.98 (0.53 to
1.79)
1.24 (0.67 to
2.28)
0.29 (0.05 to
1.19)
95/120 (79.2)b
86/95 (90.5)c
1PN oocytes
3/120 (2.5)b
6/120 (5.0)b
3PN
1/120 (0.83)b
2/120 (1.66)b
Degenerated oocytes post-ICSI 1/120 (0.83)b
4/120 (3.34)b
Day 2 embryo development
100/100 (100)c
93/95 (97.9)c
Excellent quality embryos
52/100 (52.0)d
49/95 (51.6)d
Good quality embryos
38/100 (38.0)d
41/95 (43.2)d
Fair/poor quality embryos
10/100 (10.0)d
3/95 (3.16)d
a
Percentages, expressed per warmed oocyte.
Percentages, expressed per inseminated oocyte.
c
Percentages, expressed per 2PN fertilized oocyte
b
0.
20
0.
50
0.
16
0.
50
1
0.
37
0.
24
0.
90
0.
47
0.
10
La vitrificazione
-Comune pratica clinica della IVF
- Preservazione delle fertilità in pazienti
oncologiche
- Preservazione della fertilità
Crioconservazione di ovociti
Il congelamento ovocitario di ovociti maturi è una
procedura che può essere eseguita con congelamento lento
o vitrificazione.
Prevede però che ci sia il tempo di effettuare una
stimolazione ovarica prima dell’inizio della chemioterapia
(Yang et al 2007)
Crioconservazione di ovociti
La crioconservazione mediante vitrificazione può essere
eseguita anche su ovociti da follicoli non stimolati,
maturati a metafase II in vitro (Elizur et al 2007, Huang et
al 2008)
Crioconservazione di ovociti
Gli ovociti allo stadio di vescicola germinale
sopravvivono meglio al congelamento di quelli
in metafase II (Boiso et al 2002) e sviluppano
meno anomalie nello spindle meiotico (Baka et
al, 2005)
La loro maturazione in vitro è però molto poco
efficiente, probabilmente per la perdita del
cumulo, che è fondamentale per la maturazione
(Oktay et al 2002)
Fertility preservation in cancer
IVM/EV
Patients
IVF/EV
IVM/OV
IVF/OV
44
45
20
70
Mean age (± SD)
32 ± 5.1
29.9 ± 5.0
28.2 ± 6.3
27.8 ± 6.1
GV retrieved
399 (6;0–27)
44 (4;1–13)
667 (7;1–39)
114 (3;0–17)
Maturation %
63.1; ± 3.78
65.74; ± 11.55 67.38; ± 2.73
57.89; ± 7.21
MII retrieved
82 (2;0–7)
159 (10;4–20) 117 (1;0–12)
479 (7;0–32)
Fertilization rate
79.9 ± 2.6
70.79 ± 4.59
–
_
EF -
4;1–16
7;1–23
–
–
OV -
–
–
6;0-40
9;0–37
IVM, In vitro maturation; EV, embryo vitrification; IVF, In vitro fertilization; OV, oocyte vitrification;.
(Ata et al, Reproduction and Fertility, 2010)
Metodiche miste
Nel 2010 è stato pubblicato un lavoro da Sanchez
-Serrano et al (Fertil. Steril) in cui tessuto
ovarico precedentemente criopreservato è stato
trapiantato. Dopo 60 giorni si sono ripresentate le
mestruazioni, per cui la donna è stata sottoposta
ad induzione dell’ovulazione e prelievo
ovocitario. Gli ovociti sono stati vitrificati e,
dopo adeguata preparazione endometriale,
scongelati , fertilizzati e tre embrioni trasferiti. E’
insorta una gravidanza gemellare
Preparazione endometriale
per scongelamento ovociti / embrioni