Indice INTRODUZIONE: • Traslocazioni nell’uomo CAP.1 IL CROMOSOMA Y E LE TRASLOCAZIONI CHE LO COINVOLGONO 1.1 Il cromosoma Y 1.1.1 Regione AZFa 1.1.2 Regione AZFb 1.1.3 Regione AZFc 1.2 Traslocazioni X/Y 1.3 Traslocazioni Y/autosomi CAP.2 SCOPO DEL LAVORO CAP.3 MATERIALI E METODI 3.1 Caso clinico 3.2 Analisi citogenetica CAP.4 RISULTATI CAP.5 DISCUSSIONE E CONCLUSIONE CAP.6 BIBLIOGRAFIA 1 INTRODUZIONE I riarrangiamenti cromosomici ed in particolare quelli “sbilanciati” de novo, con i loro punti di rottura, rappresentano, nella ricerca, una risorsa fondamentale per quanto riguarda il mappaggio e l’identificazione dei genimalattia. Il presupposto da cui si parte è che, se si è verificato un effetto fenotipico a seguito di un riarrangiamento anche apparentemente bilanciato, a livello dei punti di rottura, deve esistere un gene (o più geni), una sequenza di regolazione, essenziale per il normale sviluppo psicofisico e che il riarrangiamento cromosomico (traslocazione, inversione, cromosoma ad anello, etc), interrompendo o spostando il locus, provochi una mancata, ridotta o alterata sintesi di un prodotto genico, con gravi, se non letali, effetti fenotipici. Di conseguenza, trovare un’alterazione di questo tipo nell’assetto cromosomico di un individuo affetto da una patologia o da un quadro sindromico, significa riuscire a reperire informazioni sulla loro eziopatogenesi. Le traslocazioni nell’uomo Tra le anomalie cromosomiche di struttura più frequenti nella specie umana sono da annoverare le traslocazioni sia reciproche che Robertsoniane, sia che esse siano bilanciate che sbilanciate. Un riarrangiamento di struttura viene definito bilanciato quando non provoca effetti fenotipici nel portatore, indipendentemente dal fatto che vi sia o meno una perdita o acquisto di DNA, viene invece definito sbilanciato quando in seguito a perdita o acquisto di DNA nel portatore se ne evidenziano gli effetti fenotipici. 2 Le traslocazioni così come altri riarrangiamenti strutturali bilanciati possono però essere causa di infertilità. Sono infatti legate ad un aumentato rischio riproduttivo in quanto possono essere causa di abortività ripetuta, di prole giunta a nascita con aneusomia cromosomica, dovuto alla particolarità degli eventi della profase meiotica Fig 1 e Fig2. Fig.1 Segregazione della struttura a croce *Molto più rare sono invece le segregazioni 3:1 o 4:0 3 Alternata Adiacente 1 Adiacente 2 Fig.2 Traslocazioni Robertsoniane 4 Nel maschio, inoltre, nel 2,2- 8,6 % dei casi, le traslocazioni, così come altri riarrangiamenti cromosomici, possono causare infertilità, nel 5% questa è rappresentata da una riduzione della produzione di gameti (oligospermia), mentre nel 16% dalla loro totale mancata produzione (azoospermia) . In particolare anche le traslocazioni Robertsoniane bilanciate possono causare oligospermia nel sesso maschile si riscontrano infatti nell’1,6% dei maschi oligospermici, contro lo 0,1% della popolazione generale. Numerose sono quindi le evidenze che nel sesso maschile i riarrangiamenti cromosomici, in particolare quando questi coinvolgono gli acrocentrici, provocano un disturbo negli eventi meiotici e di conseguenza un arresto della spermatogenesi processo che sembra quindi molto più vulnerabile dell’oogenesi a queste alterazioni cromosomiche strutturali. Con una bassa frequenza tuttavia questi riarrangiamenti pur “bilanciati” o apparentemente tali, secondo le metodiche tradizionali, sono associati ad effetti fenotipici che vanno al di là della fertilità dei soggetti portatori e che si possono configurare a volte come patologie monogeniche mentre altre come patologie genomiche, dovute o a deregolazione genica da effetto di posizione o a mutazione genica o, infine, a microdelezione/microduplicazione. 5 1. IL CROMOSOMA Y E LE TRASLOCAZIONI CHE LO COINVOLGONO A carico del cromosoma Y sono stati descritti tutti i tipi di riarrangiamento cromosomico sia bilanciati che sbilanciati. Le traslocazioni che lo coinvolgono sembrano però eventi poco frequenti sia per quanto concerne le traslocazioni con il cromosoma X ma, soprattutto, le traslocazioni Y/autosoma. Gli studi di questi riarrangiamenti strutturali ed in particolare gli studi di correlazione genotipo – fenotipo e genetico – clinici hanno contribuito nel tempo al sequenziamento dei geni di questo cromosoma ed a comprenderne la storia evolutiva, la loro funzione fino alla determinazione dei meccanismi alla base dei quadri clinici correlati. 1.1 Il Cromosoma Y Il cromosoma Y è un piccolo cromosoma acrocentrico, privo di satelliti che conta oltre 57 milioni di paia di basi e rappresenta circa lo 0,38% del DNA nelle cellule del maschio, mentre è assente nelle cellule della femmina. Esso è caratterizzato da una piccola porzione eucromatica che comprende il braccio corto (Yp) di circa 8 Mb e la porzione prossimale del braccio lungo (Yq) di circa 14,5 Mb, in cui si trovano i pochi geni deputati al differenziamento delle caratteristiche sessuali maschili ed al controllo della spermatogenesi, mentre i 2/3 distali dell'Yq sono costituiti da un'ampia porzione eterocromatica . Malgrado la diversa morfologia e la divergenza di sequenze dell’Y rispetto al cromosoma X, tra i due cromosomi sono presenti brevi regioni sub - telomeriche, tra le quali può avvenire crossing over nel corso della meiosi. Tali regioni, fondamentali per una corretta 6 meiosi e note come regioni pseudoautosomiche, sono PAR 1, mappata sul braccio corto e regione nota come regione di crossing obbligato, ha un’estensione di 2,6 Mb, contiene 12 geni e la sua perdita è generalmente associata ad infertilità; e PAR 2 mappata sul braccio lungo, ha un’estensione di circa 320 bp e non è sempre coinvolta nel crossing over. Le due suddette regioni fanno da cornice al restante 95% del cromosoma noto come NRY (non recombining region) o attualmente rinominata MSY (male specific Y) proprio perché caratteristica del cromosoma Y maschile. L’MSY risulta essere un mosaico di sequenze di etero cromatina (Yq12) e di 3 classi di eucromatina (Yq11) che sono: • X-transposta: presenta il 99% di affinità con la sequenza di DNA Xq21 ed è così denominata perché derivante da una consistente trasposizione dalla X all’Y avvenuta oltre 3-4 milioni di anni fa. All’interno di tale regione, che consta di circa 3,4 Mb, sono stati identificati solo due geni che hanno entrambi omologhi in Xq21 : TGIF2LY (TGF beta-induced transcription factor 2-like Y) e PCDH11Y (Protocadherin 11 Y). • X-degenerata: tale regione è costellata di geni in singola copia o di pseudo geni omologhi a ben 27 localizzati sul cromosoma X. Questi geni mostrano tra il 60% ed il 96% di identità di sequenze nucleotidiche con i loro omologhi X-linked e sembrano essere reliquie di antichi autosomi da cui i cromosomi X e Y si sarebbero co-evoluti. Inoltre tutti i 12 geni MSY ubiquitariamente espressi risiedono nella regione X-degenerata a differenza degli 11 geni MSY espressi prevalentemente nel testicolo di cui uno solo, il gene SRY, appartiene a tale regione. 7 • Ampliconi: sono lunghe sequenze ripetute (dirette o inverse) che costituiscono la maggior parte dell’eucromatina con una lunghezza complessiva di circa 10,2 Mb. Tale regione presenta di gran lunga la più alta densità di geni, sia codificanti che non-codificanti, tra tutte e tre le regini di eucromatina. Sono state identificate nove diverse famiglie geniche MSY specifiche con numero di copie che vanno da 2 (VCY, XKRY, HSFY, PRY) a 3 (BPY2) a 4 (CDY, DAZ) a 6 (RBMY) a circa 35 (TSPY). In contrasto con l’espressione ubiquitaria dei geni della regione X-degenerata, i geni e le unità trascrizionali degli ampliconi mostrano un’espressione molto più ristretta: tutte le nove famiglie geniche sono prevalentemente o esclusivamente espresse nel testicolo. Fig.3 A: Rappresentazione schematica dell’intero cromosoma Y. B: visualizzazione ingrandita della regione eucromatica (Zheng Li, 2008). 8 Tabella 1. Skaletsky et al. (Giugno 2003) 9 La mappa cromosomica dell’Y è stata proposta per la prima volta da Vergnaud che ha diviso il cromosoma Y in 7 intervalli; gli intervalli da 1 a 4 vanno dalla regione telomerica del braccio corto al centromero; gli intervalli 5 e 6 si trovano nella parte eucromatica Yq, mentre l’intervallo 7 corrisponde alla regione eterocromatica. A livello dell’intervallo 5, si trovano le sub-regioni Yq11.21 e metà dell’Yq11.22, mentre l’intervallo 6 si trova a metà di Yq11.22-Yq11.23. Paragonato con gli autosomi, il cromosoma Y ha un numero di gran lunga minore di geni: circa 220 di cui 104 geni codificanti, 111 pseudogeni e altri 5 non ancora classificati. I 104 geni codificano per un totale di circa 48 proteine, di cui 16 scoperte nella regione AZF correlata con la spermatogenesi. L’associazione tra azoospermia e microdelezione del braccio lungo del cromosoma Y fu per la prima volta osservata da Tiepolo e Zuffardi; successivamente invece Vogt e i suoi collaboratori, studiando 370 uomini con oligospermia idiopatica, suggerirono che la regione AZF fosse suddivisa in 3 sottoregioni denominate AZFa, AZFb e AZFc e che queste fossero coinvolte per la spermatogenesi. (Vogt et al 1999). Kent-First ed i suoi collaboratori recentemente hanno avanzato l’ipotesi di una quarta sottoregioni AZFd, presente tra AZFb e AZFc. 1.1.1 Regione AZFa: La regione AZFa differisce dalle altre due in quanto non contiene sequenze ripetute e soprattutto per la sua bassa frequenza di delezione, descritta solo in pochi pazienti. AZFa è localizzata nei pressi del centromero e consta di 1-3 Mb e contiene 4 geni funzionali in singola copia: DFFRY (Drosophila fats facets related Y), DBY (Dead box Y), Tβ4Y (Thymosin β4 Y) e UTY (Ubiquitous TPR motif on Y). Il primo, adesso rinominato USP9Y (Ubiquitin-specific protease 9, Y chromosome), è localizzato in posizione 10 Yq11.21 e codifica per una proteina facente parte della famiglia C19 (cistein peptidasi) che esplica un’azione tipo un’idrolasi C-terminale dell’ubiquitina. Tale proteina non è però specifica del testicolo visto che è espresso anche in altri tessuti. Il gene DBY (DDX3Y) invece ha un omologo strutturale sul braccio corto del cromosoma X denominato DBX (DDX3X) (Xp11.4). Entrambe le proteine DBY e DBX appartengono alla famiglia altamente conservata delle DEAD box, che sono elicasi ATPdipendenti dell’RNA . Queste si ritrovano espresse in quasi tutti gli organismi associate a processi di sintesi e di degradazione delle molecole di RNA. Inoltre, anche se entrambe i geni sono trascritti in molti tessuti e nei leucociti, la proteina DBY è stata osservata solo nel tessuto testicolare mentre la proteina DBX è stata trovata nel cervello e nel rene maschile così come nel tessuto ovarico femminile. USP9Y occupa una piccola porzione di AZFa di circa 170 Kb, consta di 46 esoni e codifica per una proteina che funziona come un’ubiquitina idrolasi C-terminale. Inizialmente si ipotizzava che la sua delezione fosse associata ad azoospermia e grave oligospermia; studi successivi, effettuati su eiaculato, hanno invece dimostrato che abbia un ruolo marginale nella spermatogenesi e che possa essere considerato più che altro un “fine tuner” della spermatogenesi umana migliorandone l’efficienza. 1.1.2 Regione AZFb: La regione misura 1-3 Mb e contiene i geni RBMY, elF-1Y, HSFY, PRY, SMCY, XKRY, RPS4Y2, CDY1 e DAZ (condiviso anche con la regione AZFc). In realtà esistono oltre 30 geni e pseudogeni RBMY largamente diffusi in tutto il cromosoma Y e suddivisi in diverse sottofamiglie. La sottofamiglia RBMY1 consta di 7 membri tutti raggruppati nella regione AZFb. Tali geni codificano per specifiche proteine nucleari che contengono 11 un RBM (RNA-binding motif) e 4 copie di un motivo ripetuto SRGY (serina-arginina-glicina-tirosina). Negli spermatociti RBMY1 si localizza con un componente dello splicing del pre-mRNA in una zona ristretta del nucleo; mentre nella fase tardiva della meiosi si localizza in tutto il citoplasma degli spermatidi. Proprio per tale ragione è stato ipotizzato un suo coinvolgimento, con ruli distinti, in tutte le fasi della meiosi (Elliot et al 1997). Il suo omologo sul cromosoma X è noto come RBMX. Il gene CDY (chromodomain on Y chromosome) si trova localizzato nel subintervallo 5 dell’Yq; è un gene multicopia che si esprime in maniera specifica nel testicolo e dovrebbe essere coinvolto nella modificazione dei cromatidi durante la spermatogenesi. 1.1.3 Regione AZFc: La regione maggiormente deleta e perciò più studiata del cromosoma Y è la regione AZFc. La sua delezione è stata riscontrata nel 12% di maschi azoospermici e nel 6% di quelli con grave oligospermia. AZFc, localizzato nella porzione distale dell’intervallo 6, misura 3,5 Mb e contiene 7 famiglie diverse di geni per un totale di circa 19 geni tutti espressi nel tessuto testicolare. Il primo gene identificato in tale regione è stato il gene DAZ che in un primo momento si pensava fosse in singola copia e che fosse il solo gene a funzionare nell’intervallo AZFc. Studi successivi hanno invece portato alla luce il fatto che il gene DAZ sia il membro di una famiglia multigenica, disposta a cluster e che ogni membro della famiglia presenti delle sequenze altamente ripetitive. Le copie geniche, omologhe tra loro per il 99%, localizzate nella regione Yq11, sono organizzati in due cluster, che presentano un orientamento invertito (testa-testa). Queste sono DAZ1e DAZ2 nella regione palindromica P2 e DAZ3 e DAZ4 nella regione palindromica P1. Il DAZ presenta un omologo autosomico detto DAZLA 12 localizzato sul cromosoma 3p24. Si ritiene che il DAZ derivi dalla trasposizione del gene DAZLA dal cromosoma 3 al cromosoma Y, seguito da duplicazioni e inversioni, che hanno dato luogo ad una famiglia di geni multicopia. La famiglia genica DAZ codifica proteine espresse esclusivamente nel testicolo, nei diversi stadi della spermatogenesi, dagli spermatogoni agli spermatidi allungati e in ultimo anche nella coda degli spermatozoi. Il DAZ presenta un omologo autosomico detto DAZL (DAZlike) localizzato sul cromosoma 3p24 e BOULE sul cromosoma 2. Quest’ultimo codifica per un fattore chiave della meiosi delle cellule germinali maschili che regola l’espressione della fosfatasi cdc25 coinvolta nella promozione dello sviluppo nel corso della meiosi. Un altro gene di cui è importante fare menzione è il gene SRY (sexreversal-Y-”Regione determinante il Sesso sul cromosoma Y”) che produce il “fattore di differenziazione testicolare (TDF)”, in grado di guidare lo sviluppo della gonade maschile nell’embrione. Il gene è formato da un singolo esone che codifica per una proteina di circa 204 amminoacidi contenente un dominio di legame al DNA altamente conservato che consta di 79 amminoacidi, denominato HMG box. L’SRY appartiene alla famiglia dei geni SOX (ha omologia con SOX3), molti dei quali sono coinvolti nei processi di sviluppo durante l’embriogenesi. Uno di questi è il gene SOX9 che codifica per una proteina contenente una HMG box simile a quella di SRY e che è stato individuato sul braccio lungo del cromosoma 17 clonando il punto di rottura cromosomico delle traslocazioni presenti in pazienti affetti da displasia campomelica, una malattia invalidante delle ossa associata ad un'elevata incidenza di reversione di sesso da maschio a femmina. E' evidente quindi che questo gene, oltre al ruolo nella morfogenesi della ossa, è associato con lo sviluppo del testicolo. A riprova di ciò, nella gonade di embrioni XY l'espressione di questo gene aumenta 13 subito dopo l'inizio dell'espressione di SRY ed è osservata durante la formazione del testicolo non solo nel topo e in altri mammiferi. Il fatto inoltre che pazienti femmine con displasia campomelica non presentino alterazioni nello sviluppo delle gonadi fa pensare che SOX9 agisca insieme a SRY nel determinare lo sviluppo in senso maschile degli embrioni XY, e che SRY e SOX9 possano far parte della stessa sequenza di controllo dello sviluppo embrionale. Da quanto fin qui detto si evince che la maggior parte delle sequenze codificanti di questo cromosoma sono deputate, nell’uomo, direttamente o indirettamente, al differenziamento della gonade ed al controllo della spermatogenesi, mentre veramente esiguo è il numero dei geni che controllano altri caratteri. Il mappaggio di molti di questi geni è stato possibile, come prima detto, dall’analisi dei riarrangiamenti sia intra che inter cromosomici a carico dell’Y 1.2 Traslocazioni X/Y Le traslocazioni X/Y non sono frequenti nell’uomo e la maggior parte dei casi descritti sono eventi sporadici, mentre in minore misura sono descritti casi in cui il riarrangiamento è ereditato. Più frequentemente le traslocazioni X/Y coinvolgono punti di rottura in Xp22 e Yq11 ritenuti “hot spots” per appaiamento di porzioni non alleliche tra Xp e Yq durante la prima divisione meiotica paterna; il conseguente crossing-over con scambio reciproco di sequenze di DNA può portare o alla formazione di due cromosomi monocentrici o ad un cromosoma dicentrico e frammento acentrico. 14 I soggetti con cariotipo 46,Y,der (X)t(X;Y) sono di sesso maschile mentre quelli con cariotipo 46,X,der(X)t(X;Y) possono essere sia di sesso maschile che femminile a seconda della porzione del cromosoma Y coinvolta nella traslocazione e cioè se il gene SRY è contenuto o no nel cromosoma X derivato dal riarrangiamento. In tutti i casi consegnati alla letteratura è stata riscontrata contemporaneamente la perdita della regione Xp22.3→pter e presenza del braccio lungo del cromosoma Y (Yq11→qter). Il reciproco prodotto della traslocazione e cioè il cromosoma Y che risulta costituito da una porzione di Xp su Yq viene riferito meno in letteratura. Gli individui con cariotipo 46,X,-Y,+der(Y) t(X;Y)(p22;q11) hanno due copie dei geni di Xpter e sono nullisomici per una porzione di Yq. Dal momento che questa condizione non dovrebbe essere letale, la rarità del suo fenotipo o le sue lievi conseguenze cliniche, potrebbero essere alla base del suo mancato riscontro. In quei rari casi descritti in letteratura, il quadro clinico di pazienti maschi caratterizzato da ritardo mentale, dismorfismi e ambiguità dei genitali sarebbe imputabile alla parziale duplicazione della regione Xp coinvolta nella traslocazione. Alla base degli scambi aberranti X/Y ci sarebbero le omologie di sequenza tanto nella regione PAR dei cromosomi X e Y quanto al di fuori di tale regione, con sequenze omologhe riscontrate su Xq e sul braccio corto o sulla regione prossimale del braccio lungo del cromosoma Y, che arrivano fino al 95% di somiglianza; altri loci nella regione Xpter→Xp22 mostrano una omologia dell’85-95% con sequenze in Xq11 o nella regione pericentromerica del cromosoma Y. E’ possibile pertanto, seppure non così 15 frequentemente, che durante la meiosi maschile il braccio corto del cromosoma X si appai in maniera aberrante con il braccio lungo del cromosoma Y, con successiva ricombinazione tra queste regioni. In alternativa i cromosomi X ed Y si potrebbero appaiare casualmente senza il contemporaneo coinvolgimento della regione PAR. A differenza di altre traslocazioni germ-line, caratterizzate a livello molecolare e descritte in letteratura, le traslocazioni X/Y sono le uniche ad essere favorite dalla estesa omologia di sequenza mostrata dai due cromosomi. La perdita della parte terminale del braccio corto del cromosoma X, sia dovuta a delezione che ad una traslocazione, può produrre un fenotipo la cui complessità del quadro clinico dipende sia dalla posizione dei punti di rottura, sia dal numero di geni deleti, che dal sesso dell’individuo affetto. Gli aspetti clinici principali che si accompagnano comunque più frequentemente alle traslocazioni X/Y comprendono soprattutto la bassa statura, dismorfismi facciali, eventualmente ritardo mentale e nei maschi possibile ittiosi, parziale o generalizzata, ipogonadismo con azoospermia. Le femmine possono anche essere fenotipicamente normali e fertili. I maschi infatti, particolarmente quelli con delezioni in Xp22.3, sono nullisomici per questa regione e conseguentemente possono manifestare sindromi da geni contigui caratterizzate da differenti combinazioni di fenotipi in base alla lunghezza della delezione. Queste sindromi, caratterizzate e studiate negli ultimi anni, possono comprendere l’associazione delle seguenti malattie mendeliane: - bassa statura (SS;MIM 312865) - condrodisplasia punctata X-linked recessiva (CDPX;MIM 302950) 16 - ritardo mentale (MRX;MIM 309530) - ittiosi X-linked dovuta alla mancanza di STS (XLI;MIM 308100) - sindrome di Kallman (KAL;MIM 308700) Sono state descritte in letteratura anche femmine con delezioni terminali o traslocazioni che coinvolgono la regione Xp22, che possono manifestare alcune caratteristiche cliniche che appartengono a due malattie mendeliane: - la sindrome di Aicardi (MIM 30 4050) - la sindrome di Goltz (MIM 305600) In alcuni casi la presenza di entrambi i geni malattia associati alle due sindromi è stata ipotizzata essere dovuta a sindrome da geni contigui, in altri la somiglianza del fenotipo alle due sindromi, senza però rispondere ai criteri stretti di diagnosi, ha fatto supporre una eterogeneità genetica delle due sindromi. La bassa statura quindi è l’aspetto clinico più frequentemente riscontrato sia nelle femmine che nei maschi che presentano delezioni terminali del braccio corto dei cromosomi X e Y. Le delezioni terminali della regione Xp invariabilmente comportano la bassa statura, indipendentemente dai siti cromosomici coinvolti nel breakpoint. Piccole delezioni terminali della regione Yp si accompagnano anch’esse alla bassa statura per cui da tempo si supponeva che un gene (o più geni) della crescita risiedesse nella regione PAR1 e che la sua aploinsufficienza potesse causare come fenotipo dominante una ridotta altezza. 17 Nella parte distale della PAR 1 (Xp22.3 e Yp11.3) è stato mappato un gene denominato Short stature HOmeoboX (SHOX)- cointaining gene. E’un gene che appartiene alla grande famiglia dei geni omeotici; questi sono considerati “architetti molecolari universali del design del corpo”, agendo come regolatori nello sviluppo della struttura somatica, dalla determinazione dell’asse del corpo, alla formazione di strutture complesse. Il gene SHOX è composto da 7 esoni ed ha almeno due prodotti di espressione di 1870 bp (SHOXa) e 1349 bp (SHOXb), che codificano rispettivamente per due proteine di 292 e 225 AA; queste sono il risultato di splicing alternativo e condividono i primi 724 nucleotidi esonici. Mentre SHOXa si esprime a livello di muscolo scheletrico, placenta, cuore e fibroblasti di midollo osseo, mRNA di SHOXb si ritrovano soltanto nel rene fetale, nel muscolo scheletrico e nei fibroblasti di midollo osseo, nei quali l’espressione del gene è massima. SHOX sfugge all’inattivazione e quindi è espresso in doppia copia in entrambi i sessi, confermando che per questo gene si verifica un effetto dose nelle aberrazioni cromosomiche che lo coinvolgono. Il ruolo fondamentale che il dosaggio del gene SHOX riveste nella determinazione del fenotipo altezza è ulteriormente comprovato dall’osservazione che casi con copie soprannumerarie di tale gene risultano in genere alti. Nella sindrome di Klinefelter (47,XXY), ad esempio, in cui si ha la contemporanea presenza di una copia in più di SHOX e ipogonadismo, l’alta statura è determinata dall’allungamento degli arti. Parimenti, in casi nei quali si ha duplicazione di Xp o Yp, senza compromissione dei valori degli ormoni gonadici, è frequente riscontrare una crescita maggiore soprattutto delle porzioni distali degli arti. 18 1.3 Traslocazioni Y/Autosoma Se le traslocazioni X/Y sono poco frequenti ancora più rare sono le traslocazioni Y/autosoma dato che, complessivamente, in letteratura ne sono state descritte una trentina di cui solo due o tre sono riportati come casi familiari (Tab. 2 e 3) Fenotipicamente sono essenzialmente maschi tranne il caso descritto da de Ravel T.J.L. (2004) che mostra un fenotipo di sesso femminile, in una situazione di traslocazione complessa coinvolgente il cromosoma 9 ed associata alla perdita della regione contenente il sex reversal gene, DMRT1. In relazione al quadro clinico è utile distinguere, oltre al punto di rottura sull’Y, le traslocazioni che coinvolgono uno qualsiasi degli autosomi da quelle che interessano i cromosomi acrocentrici. Infatti, i casi di traslocazione Y/autosoma (non acrocentrico) descritti in letteratura, mentre mostrano sostanzialmente il mantenimento del braccio corto del cromosoma Y e parti più o meno estese della regione eucromatica del lungo, determinando quindi il differenziamento sessuale in senso maschile, per quanto riguarda invece l’autosoma, in base al punto di rottura, si producono monosomie parziali, più o meno consistenti, delle regioni terminali del braccio corto o lungo del cromosoma interessato. E’ pertanto ovvio che il fenotipo patologico che ne scaturisce, con ritardo mentale ed anomalie congenite è dovuto all’aneusomia autosomica che si è determinata. Nel caso in cui, invece, l’autosoma è un cromosoma acrocentrico questo perde sostanzialmente il braccio corto, mantenendo o meno il centromero, pertanto l’effetto fenotipico che si determina, per lo più infertilità da oligoazoospermia, è dato, per quanto fino ad oggi descritto, dal punto di rottura 19 sul cromosoma Y e dall’estensione, essenzialmente del braccio lungo, della regione eucromatica legata alla spermatogenesi, che va perduta. Nella descrizione di questi casi, per altro veramente esigui, gli autori tentano di comprendere se fra gli altri segni clinici si possa contemplare una diminuzione della statura, in almeno alcuni di questi soggetti, per cercare di circoscrivere la regione in cui si suppone essere una sequenza, un gene non ancora identificato, denominato CGY, che si ritiene contribuisca a controllare l’altezza nel sesso maschile. 20 21 22 Tabella 2 e 3. Chen et al. (Ottobre 2008) 23 2. SCOPO DEL LAVORO Con questo studio citogenetico-clinico si è voluto contribuire alla casistica, per altro veramente esigua, dei casi descritti in letteratura di traslocazione Y/autosoma ed in particolare Y/acrocentrici. Sono state applicate le metodologie citogenetiche classiche ad alta risoluzione in combinazione con le tecniche di biologia molecolare ad un caso di traslocazione Y/21. Lo scopo prefissato è stato quello di restringere il più possibile le regioni in cui sono avvenuti i breakpoints della traslocazione e contemporaneamente anche di individuare i geni coinvolti nello sbilanciamento genomico per una corretta correlazione genotipo-fenotipo, al fine ultimo di contribuire al mappaggio di geni o sequenze ad oggi non noti nella regione Yq11 prossimale. 24 3. MATERIALE E METODI 3.1 Caso clinico Il probando, un ragazzo di 14.6 anni di età, è giunto all’osservazione dell’U.O.C. Laboratorio di Genetica Medica della ASL dell’Aquila, per effettuare approfondimenti circa la natura di un importante ritardo di crescita e di pubertà con sospetto di ipogonadismo ipogonadotropo. Il paziente era stato precedentemente sottoposto a visita pediatrica dalla quale si evidenziava una statura inferiore al 1° centile (- 2.8 DS, 143 cm) con stadio puberale P1G1. Dall’esame ematocitochimico si è rilevato un deficit parziale di GH e basse concentrazioni di FSH, LH e Testosterone dopo stimolo con omologo LHRH. 3.2 Analisi Citogenetica L’analisi citogenetica del paziente è stata eseguita mediante le tecniche standard su linfociti di sangue periferico coltivati in RPMI 1640 con FCS (10%) e stimolati con PHA. Le colorazioni differenziali utilizzate sono state i bandeggi GTG e CBG. Allo scopo di ottenere preparati cromosomici prometafasici che forniscono una migliore risoluzione, sono state altresì allestite colture di linfociti periferici sincronizzate secondo un protocollo modificato del metodo di Yunis et al. del 1981. Alle metodiche di citogenetica classica sono state affiancate le tecniche di biologia molecolare di ibridazione in situ fluorescente (FISH) utilizzando le seguenti sonde commerciali di DNA (tab. 4): 25 Nome Sonda Tipo Di Sonda Mappa Sts SHOX cosmide Xp22.33/Yp11.32 DXYS28 SRY cosmide Yp11.31 SY14 CENY alfoide Centromero Y DYZ1 KAL cosmide Xp22.32 DXS1223 DXS1138 CEN 21 alfoide Centromero 21 D21Z1 CEN X alfoide Centromero X DXZ1 WCP Y painting Tabella 4. La FISH di tutte le sonde è stata eseguita secondo i protocolli suggeriti dalle ditte fornitrici delle stesse. 26 4. RISULTATI Lo studio citogenetico ad alta risoluzione sul probando ha permesso di determinare il seguente cariotipo: 45,X,der(21)t(21;?) (Fig.4 cariotipo completo). Una più precisa definizione della traslocazione cromosomica, riscontrata nel paziente, è stata ottenuta dal confronto dei dati di citogenetica classica con quelli dell’analisi di FISH (figure A-F) riportati nella seguente tabella 5: Presenza sul Presenza Sul Nome Sonda Mappa der(21) Cromosoma X SHOX Xp22.33/Yp11.32 + + SRY Yp11.31 + - CENY Centromero Y + - KAL Xp22.32 - + CEN 21 Centromero 21 + - WCP Y Y + - CEN X Centromero X - + Tabella 5. 27 Fig. 4 Cariotipo del probando. 28 Fig. A: FISH con sonda per il gene SHOX (in rosso) e per il centromero del cromosoma X (in acqua). 29 Fig. B: FISH con sonda per il gene SRY (in rosso). 30 Fig. C: FISH con sonda per il centromero del cromosoma X (in verde) e per il centromero del cromosoma Y (in rosso). 31 Fig. D: FISH con sonda per il centromero del cromosoma X (in verde) e per il gene KAL (in rosso). 32 Fig. E: FISH con sonda per il centromero del cromosoma 21 (in rosso). 33 Fig. F: FISH con sonda per il centromero del cromosoma X (in verde), per il centromero del cromosoma Y (in verde) e painting del cromosoma Y (in rosso). 34 Da tale analisi risulta che il cromosoma marker è il cromosoma dicentrico derivativo della traslocazione Y/21 con punti di rottura in q11.1 e p11; in esso è assente tutta la regione del braccio lungo del cromosoma Y (Figure 5a e 5b). Y 21 Fig.5a: Parziale del cromosoma 21 Dic(Y;21) Fig.5b:Punti di rottura del cromosoma Y e 21 Il cariotipo pertanto risulta essere : 45,X,dic(Y;21)(q11.1;p11) 45,X,dic(Y;21)(pter q11.1::p11 qter) 35 5. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI Come premesso nel capitolo introduttivo, fino ad oggi in letteratura sono stati descritti in tutto circa trenta casi di traslocazioni Y/autosoma che possono essere distinti, sia dal punto di vista genetico che clinico, sostanzialmente in due tipi, in relazione all’autosoma coinvolto se questo è o meno un cromosoma acrocentrico. Infatti, quando l’autosoma non è un acrocentrico la traslocazione dà luogo, dal punto di vista clinico, ad un quadro sindromico, essenzialmente per monosomia parziale, relativo alla regione sbilanciata dell’autosoma interessato. Allorché invece la traslocazione riguarda un cromosoma acrocentrico, come per altro precedentemente detto, il fenotipo associato dipende essenzialmente dal tratto del cromosoma Y perduto. Entrambi i gruppi degli acrocentrici sono comunque parimenti coinvolti e non sembra emergere un cromosoma preferenziale. Il caso qui riportato, coinvolge il cromosoma 21e, ad oggi, sembrerebbe essere il terzo caso descritto di traslocazione Y/21. Se si analizzano i fenotipi dei casi riportati in letteratura delle traslocazioni Y/autosoma (tab. 2 e 3) si può notare che due articoli riportano casi familiari, pertanto i punti di rottura a carico del cromosoma Y sono avvenuti a valle della regione DAZ, preservando la spermatogenesi e quindi le capacità riproduttive dei soggetti. Due casi sono, invece, associati ad un quadro clinico con malformazioni minori e ritardo mentale, ma, a parte il fatto che uno dei due è descritto come un caso di mosaicismo con la linea 45,X senza il derivato della traslocazione, gli stessi autori attribuiscono l’effetto fenotipico riscontrato ad altra causa, presupponendo 36 una concomitanza di eventi non correlati. I casi rimanenti, esclusi quelli in età prepubere, sono stati accertati in quanto soggetti infertili/sterili con oligo/azoospermia con un punto di rottura sull’Y che è a monte o coinvolge la regione di controllo della spermatogenesi. E’ interessante, però, notare che da osservazioni fatte sui casi riportati in letteratura con perdita del braccio lungo del cromosoma Y, la cui frequenza popolazionistica è stimata in circa 1/1000 maschi, l’aberrazione è spesso legata, oltre che all’infertilità anche alla bassa statura, tanto che negli anni è stato ipotizzato che nella parte prossimale della regione eucromatica del braccio lungo del cromosoma Y sia presente un gene di controllo della crescita denominato GCY. La crescita lineare nell’uomo è un processo dinamico, regolato da una moltitudine di differenti eventi molecolari che insieme determinano l’altezza di una persona e che, pertanto, questo carattere è un complesso carattere multifattoriale. Nell’uomo, tuttavia, gli individui di sesso maschile sono generalmente più alti di quelli di sesso femminile e quindi sul cromosoma Y deve essere presente un gene che controlla o comunque influenza l’altezza. L’ipotesi è anche supportata dal fatto che donne XY sono più alte delle donne XX, che maschi XY sono a loro volta più alti dei maschi XX, che maschi XYY siano più alti di quelli XY . Ulteriori conferme vengono dalla letteratura, come il caso descritto da Spranger S. et al 1997, di una donna con delezione della regione PAR1 a seguito di una traslocazione X/Y, e quindi con perdita del gene SHOX, che però mostrava, contrariamente all’attesa, un’altezza normale. L’autore in base al punto di rottura del cromosoma Y in q11.2 ipotizza una compensazione della perdita di SHOX con il mantenimento GCY. Si ritiene che almeno tre parametri influenzino l’altezza finale di un soggetto che abbia una aberrazione del cromosoma Y, il numero di copie del gene 37 SHOX, il mosaicismo con la linea cellulare 45,X e la presenza/assenza della regione Yq11 Il gene GCY che, così come del resto il gene SHOX sarebbe in grado di modificare l’espressione dell’altezza di 7 – 10 cm, non è ancora stato mappato con precisione, anche se sempre più si sta restringendo l’intervallo della regione cromosomica interessata. Il problema nasce dal fatto che i casi descritti di delezione del braccio lungo del cromosoma Y presentano punti di rottura molto diversi fra loro e che quelli che riguardano la regione prossimale, che è la regione in cui il gene sarebbe presente, sono pochi e spesso il fenotipo è influenzato da altro, inoltre non sempre è semplice identificare la diminuzione di 7-10 cm in uomini ai limiti bassi della curva di crescita in relazione alla popolazione di appartenenza. Infatti fino al 2000, quando Kirsch S., restrinse la regione interessata ad un intervallo di 2Mb molto prossima al centromero fig. 6, poi (2002) ulteriormente circoscritta dallo stesso autore ad un intervallo di 700 kb fig. 7, la regione candidata aveva una estensione di 4,5 Mb. La precisa localizzazione potrà venire solo dallo studio dei casi che presentano una delezione della parte molto prossima al centromero, ancor meglio se interstiziale, casi purtroppo che in letteratura sono molto rari, ad oggi nel mondo ne sono noti solo due, tre. 38 Fig. 6: Possibile localizzazione del gene GCY nella regione prossimale Yq11 (S.Spranger, 1997). 39 40 La regione circoscritta nell’intervallo dei marker SKY8 e sY83 (Kirsch S. et al 2002) non contiene nessun gene noto né alcun ESTs specifico dell’Y, pertanto viene ipotizzata per questo gene una struttura inusuale ad esempio un gene formato da un unico esone o un gene la cui espressione sia estremamente ristretta nel tempo o nello spazio o possa rappresentare una regione di controllo trascrizionale . Il caso di delezione del braccio lungo del cromosoma Y da noi riportato, presenta un apparente ipogonadismo, che andrà valutato nel tempo, così come la sua fertilità, presenta però associato un importante ritardo di crescita 1° centile (- 2.8 DS, 143 cm), dovuto a nostro avviso al punto di rottura in Yq11.1, molto prossimo al centromero come dimostrato dallo studio citogenetico in FISH. Il nostro caso, oltre che essere la terza traslocazione descritta di Y/21, rappresenta quindi uno di quei rari eventi che, da una parte confermano i dati di Kirsch ma permetteranno anche una migliore definizione della regione di intervallo critico per il mappaggio del gene GCY o della regione di controllo trascrizionale . Le review effettuate ci inducono, comunque, ad azzardare un’ulteriore ipotesi circa la natura della regione di controllo della statura, e che potrebbe essere un tratto di DNA regolativo piuttosto che un gene 41 Bibliografia 1. 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