UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SIENA
a.a. 2007-08
curriculum: molecolare
ciclo: XXIII
dottorando/a: Cecilia Pozzi
docente tutor: Prof. Stefano Mangani
Dipartimento di afferenza: Dipartimento di Chimica
Titolo del progetto di ricerca: Studi strutturali e funzionali delle interazioni fra enzimi di eucarioti e proteine accessorie o peptidi
RELAZIONE 1° ANNO di DOTTORATO
La timidilato sintasi è un’enzima dimerico conivolto nella biosintesi del DNA in
quanto catalizza la metilazione riduttiva del 2’-desossiuridina-5’-monofosfato
(dUMP)
a
2’-desossitimidina-5’-
monofosfato
(dTMP),
usando
N5,N10-
metilenetetraidrofolato come cofattore. A causa della loro funzione questi enzimi
sono importanti target nella chemioterapia antitumorale (TS umana) e
antibatterica (TS batterica).
Gli studi strutturali in corso sull’enzima timidilato sintasi umana (hTS) hanno
come finalità la progettazione di nuove molecole che impediscano la formazione
della struttura quaternaria di hTS, dato che esso è in grado di esplicare la sua
funzione solo in forma di dimero stabile. Analizzando la struttura all’interfaccia
del monomero di hTS è stata progettata una libreria di peptidi di varia lunghezza
che potessero legarsi in tale regione rendendo impossibile la formazione
dell’oloenzima attivo.
Dai saggi d’inibizione dell’attività enzimatica è risultato che alcuni peptidi hanno
attività inibitorie incoraggianti; si è cercato quindi di determinare la struttura dei
complessi enzima-peptide al fine di dare una conferma strutturale all’attività
inibitoria osservata.
Gli studi strutturali in corso su hTS sono rivolti inoltre alla progettazione di
molecole ad attività inibitoria aventi struttura analoga ai substrati naturali
dell’enzima. Si è cercato quindi di determinare la struttura di complessi hTSinibitori folato analoghi e dUMP analoghi.
Effettuata la determinazione della struttura cristallografica si è evidenziato un
problema conformazionale dell’enzima dovuto allo switch del loop catalitico in
una posizione non esposta nel sito catalitico quindi ritenuta inattiva. Tale
cambiamento conformazionale
sembra
essere
dovuto alle
condizioni di
cristallizzazione che prevedono la presenza di elevata quantità di sale nella
soluzione precipitante; questa considerazione è sostenuta anche da dati riportati
in letteratura secondo cui la presenza di alte concentrazioni da sale stabilizza la
forma inattiva di hTS. L’esposizione della cisteina catalitica sulla superficie del
sito catalitico è fondamentale per poter osservare interazioni con gli inibitori che
ci si proponeva di co-cristallizzare e per i quali non è stato quindi possibile
valutare la regione di binding con l’enzima.
Sono stati quindi effettuati studi di dicroismo circolare per valutare eventuali
effetti di tale sale sulla struttura secondaria dell’enzima.
Parallelamente
a
ciò
si
è
cominciato
a
cercare
nuove
condizioni
di
cristallizzazione che prevedano la presenza, nella soluzione precipitante, di
basse concentrazioni saline al fine di evitare l’induzione di una conformazione
inattiva dell’enzima.
Target del nostro progetto di ricerca sono anche le timidilato sintasi batteriche e
la loro inibizione attraverso molecole ad attività antibiotica. A tale proposito si
sta
procedendo alla
determinazione della
struttura
cristallografica
delle
timidilato sintasi di Enterococcus faecalis (EfTS) e di Pneumocystis carinii (PcTS)
nella loro forma APO e in complessi con inibitori.
Gli inibitori attualmente oggetto di studio sono strutture folato analoghe che
hanno presentato buone attività inibitorie verso gli enzimi di interesse. Per tali
molecole si cerca quindi di determinare la struttura cristallografica del complesso
termario TS-dUMP-inibitore al fine di valutare i principali punti di interazione con
l’enzima.
Le informazioni ricavabili dall’analisi delle strutture cristalline costituiranno la
base per una successiva ottimizzazione dei lead ottenuti, per giungere quindi
alla progettazione di molecole ad attività inibitoria crescente.
Presenze a Congressi e Scuole:
•
International school of crystallography - 40th course: “From molecules to
medicines: interacting crystallography in drug discovery” 29 May - 8 June
2008, Erice, Italy
•
1st SIMP-AIC Joint meeting “Learning from and for the Planet Earth –
Structures and models in Earth, Materials and Life Sciences” 7-12
September 2008, Sestri Levante, Italy