ENZIMI
CATALISI ENZIMATICA. Meccanismo d’azione degli
enzimi; Energia dl attivazione; Componenti strutturali e
funzionali; Nomenclatura e classificazione; Specificità dl
substrato ed azione; Modello Lock and Key; Coenzimi
principali; Principio di additività dell’energia libera in
reazioni accoppiate.
ενζυµον (“nel lievito”): un po’ di storia...
•  Nell’antichità, denominati fermenti
–  Diastasi del malto idrolizza l’amido più velocemente dell’acido solforico
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
1835: Prima teoria della catalisi chimica (Berzelius)
1860: Fermentazione causata da sostanze termolabili (Pasteur)
1877: Primo uso del termine “enzima”
1897: Estrazione dal lievito degli enzimi della fermentazione alcolica,
dimostrazione che può avvenire in assenza di cellule integre (Buchner)
1913: Equazione di Michaelis-Menten, primo modello matematico del
funzionamento degli enzimi
1926: Cristallizzazione di ureasi (Sumner)
1930: Cristallizzazione di pepsina, tripsina e chimotripsina: tutti gli
enzimi sono proteine (Northrop)
1965: Teoria dell’allosterismo (Jacob, Monod, Changeaux)
1992: L’attività degli enzimi può essere regolata con modificazioni
covalenti (Fischer, Krebs)
1997: Anche RNA può agire come catalizzatore: non tutti gli enzimi sono
proteine
2004: Ruolo dell’ubiquitina nella distruzione degli enzimi (Ciechanover,
Hershko, Rose)
1
Alcune caratteristiche della materia vivente
•  Composta da molecole non viventi, vale più della somma delle
sue parti (1+1=3)
•  Si presenta con poche differenze in specie diverse
•  Ogni componente con funzione specifica e insostituibile, più
funzioni per ciascun componente
•  Trasforma l’energia derivata dall’ambiente costruendo strutture
ordinate e complesse da materiale disordinato e semplice
•  Abilità di autoriprodursi in modo preciso utilizzando le
informazioni contenute nel proprio interno
•  Capacità evolutiva, irritabilità ed adattamento all’ambiente
•  Resa ottimale:
–  Svolge solo le reazioni necessarie minimizzando la produzione di
prodotti di scarto
–  Impedisce reazioni indesiderate prevenendo il dispendio energetico
–  Porta a termine le reazioni in tempi brevi
–  E’ indipendente dalle condizioni ambientali (temperatura, pressione)
–  Può riutilizzare la stessa “macchina” per molte volte
Energia di attivazione
•  Y si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a X
–  Conversione X→Y termodinamicamente favorevole
•  Ma la reazione non può avvenire se X non acquisisce
sufficiente energia per superare la barriera dell’energia di
attivazione
2
Numero di molecole
Distribuzione delle molecole a vari livelli di energia
Energia di attivazione
Molecole con energia
maggiore dell’energia di
attivazione
Energia
Aumento di temperatura
Presenza di un catalizzatore
Energia
Energia di attivazione
A
Energia di
attivazione
senza
catalizzatore
Stato
iniziale
Riduzione dell’energia di
attivazione del substrato
mediante:
 Combinazione transitoria
col substrato
 Stabilizzazione dello stato di
transizione
 Inserimento di numerosi
stati di transizione con livello
energetico inferiore
Energia di
attivazione
con
catalizzatore
Energia liberata
dalla reazione
P
Stato finale
3
Un enzima immaginario: la metallasi
•  La barretta deve
essere piegata
prima di essere
rotta (stato di
transizione)
•  Enzima con alta
affinità per il
substrato:
stabilizza il
substrato
•  Enzima con alta
affinità per lo
stato di
transizione:
stabilizza lo stato
di transizione e
accelera la
reaziuione
Enzimi: catalizzatori biologici
•  Non modificano
l’equilibrio della
reazione, ma solo la
velocità con la quale
l’equilibrio viene
raggiunto
•  Non vengono
modificati nella
reazione, e al
termine della
reazione sono subito
disponibili per
catalizzare una
nuova reazione
4
H2O2 e catalasi
2 H2O2 ⇐⇒ 2 H2O + O2
Catalizzata da catalasi
Reazione spostata a destra (Keq alta)
ma molto lenta (k velocità bassa)
DNA
RNA
ribosomi
Struttura generale degli enzimi
Zimogeno
(precursore)
Substrato
Apoenzima
Prodotto
Sito attivo
ENZIMA
ATTIVO
Ubiquitina
Lisosomi
degradazione
Parte non-proteica
ione metallico o
coenzima
Sito allosterico
Effettore
allosterico
5
Nomenclatura degli enzimi
•  Denominazione classica costituita da 3 parti:
–  Nome del substrato
–  Nome del coenzima
–  Nome della reazione catalizzata + “asi”
Esempio: Lattico-NAD-deidrogenasi
•  International Enzyme Commission, fondata nel 1956 da Prof. M.
Florkin:
–  77 membri, presidente attuale Angelo Azzi
–  Classificazione degli enzimi secondo il sistema delle classi EC Esempi:
Creatin kinasi: EC 2.7.3.2, adenosintrifosfato : creatin N-fosfo trasferasi
Lattato deidrogenasi: EC 1.1.1.27, lattato : NAD+ ossidoreduttasi
–  Ha funzionato bene fino agli anni ‘90 (circa 3200 enzimi)
•  Progetto genoma umano (HUGO):
–  Esistono circa 20,000 geni, in buona parte enzimi
Classificazione internazionale degli enzimi
•  1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
1.1 agisce sul gruppo CHOH del donatore
1.2 agisce sul gruppo aldeidico o chetonico del donatore
1.3 agisce sul gruppo CH-CH del donatore
1.4 agisce sul gruppo CH-NH2 del donatore
1.5 agisce sul gruppo C-NH del donatore
1.6 agisce su NADH2 o NADPH2
1.7 agisce su altri composti azotati
1.8 agisce su gruppi solforati
1.9 agisce sui gruppi eme
6
Classificazione internazionale degli enzimi
•  1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione
•  2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una
molecola ad un'altra
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
2.1 gruppi ad una unità di carbonio
2.2 gruppi chetonici o aldeidici
2.3 gruppi acilici
2.4 gruppi glicosidici
2.5 gruppi alchilici
2.6 gruppi azotati
2.7 gruppi fosforici
2.8 gruppi contenenti zolfo
Classificazione internazionale degli enzimi
•  1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione
•  2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una
molecola ad un'altra
•  3 - idrolasi: reazioni di idrolisi
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
3.1 legami esterei
3.2 legami glicosidici
3.3 altri legami
3.4 legami peptidici
3.5 legami C-N non peptidici
3.6 legami anidridici
3.7 legami C-C
7
Classificazione internazionale degli enzimi
•  1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione
•  2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una
molecola ad un'altra
•  3 - idrolasi: reazioni di idrolisi
•  4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami
– 
– 
– 
– 
4.1 legami C = C
4.2 legami C = O
4.3 legami C = N
4.4 legami C = S
Classificazione internazionale degli enzimi
•  1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione
•  2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una
molecola ad un'altra
•  3 - idrolasi: reazioni di idrolisi
•  4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami
•  5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola
nel suo isomero
–  5.1 racemasi
–  5.2 cis-trans isomerasi
8
Classificazione internazionale degli enzimi
•  1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione
•  2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola
ad un'altra
•  3 - idrolasi: reazioni di idrolisi
•  4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami
•  5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo
isomero
•  6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura di
ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi
– 
– 
– 
– 
6.1 legami C-O
6.2 legami C-S
6.3 legami C-N
6.4 legami C-C
Classificazione internazionale degli enzimi
•  1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione
•  2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una
molecola ad un'altra
•  3 - idrolasi: reazioni di idrolisi
•  4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami
•  5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola
nel suo isomero
•  6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con
rottura di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi
9
Modello Lock and Key: l’enzima si
combina chimicamente col substrato
•  Emil Fisher 1894
•  Il sito attivo è costituito dal
“negativo” del substrato
–  Si formano legami “esatti” fra
enzima e substrato
•  Riconoscimento anche
tridimensionale
–  Esempio: glicerol kinasi (lega
solo il glicerolo in forma alfa)
–  Può distinguere stereoisomeri
D- e L- degli aminoacidi
•  Spiega la specificità, ma NON
spiega la stabilizzazione dello
stato intermedio
Un modello più sofisticato:
induced fit + substrate strain
•  Daniel Koshland 1958 (University of California Berkeley)
•  Sito di legame non completamente pre-formato
•  L’interazione fra substrato e enzima induce un
cambiamento conformazionale nell’enzima che prelude ad
un legame più stabile col substrato (induced fit)
•  Il substrato è forzato verso la formazione dei prodotti
(substrate strain)
10
Il legame enzima-substrato avviene tramite
l’interazione delle cariche del substrato con alcuni
aminoacidi del sito attivo
•  Esempio: proteasi a serina
•  Alterazioni della struttura primaria di un enzima possono
mutarne l’attività causando malattie genetiche
Il legame enzima-substrato induce un cambiamento
conformazionale nell’enzima
Esempio: esochinasi senza e con glucosio
11
Il cambiamento conformazionale forza il substrato ad
assumere una nuova struttura o conformazione
Esempio: lisozima, che idrolizza i
polisaccaridi
Dalla sequenza degli aminoacidi alla struttura delle
proteine
•  Struttura primaria (sequenza degli aminoacidi)
–  Sempre lineare
•  Struttura secondaria (conformazione della catena)
–  α-elica o β-a pieghe
•  Struttura terziaria (tridimensionalità della catena)
–  Relazioni locali o remote dei gruppi R
–  Proteine globulari o fibrose
•  Struttura quaternaria (interazioni fra più catene)
12
Struttura primaria e mutazioni genetiche
•  Tutte le funzioni delle proteine necessitano del riconoscimento fra zone o
domini della proteina con altre molecole o parti di molecola:
–  Enzima-substrato, molecole di adesione-membrane, anticorpo-antigene…
•  Il dominio preposto al riconoscimento e la molecola da riconoscere
devono essere complementari in termini di struttura e di carica
•  Il riconoscimento dipende dalla distribuzione dei gruppi R e dalla
sequenza degli aminoacidi
•  Una mutazione della struttura primaria può impedire o rendere difficile
il riconoscimento, causando disfunzioni più o meno gravi
–  Se ne deriva uno stato patologico, quella mutazione interessa il dominio di
riconoscimento
–  Se la mutazione è silente (non genera malattie o disfunzioni), è possibile che
l'aminoacido mutato non sia nel dominio di riconoscimento
•  Spesso è sufficiente la mutazione di un solo aminoacido
•  Tutte le malattie causate da tali mutazioni sono genetiche
•  Tutte le malattie genetiche originano una mutazione della struttura
primaria delle proteine
Di tutte le reazioni possibili per un substrato, l’enzima
ne favorisce una sola
•  Gli enzimi forzano le vie metaboliche
attraverso reazioni selezionate (ad es:
A > B > H > K > N > T > Z) favorendo
il flusso unidirezionale di materiale
13
Coenzimi
•  Piccole molecole
organiche, spesso
derivate da vitamine
•  Si legano all’enzima
–  Spesso fungono da
“secondo substrato”
•  Determinano la
specificità della
reazione catalizzata
Adenosin trifosfato (ATP)
•  Coenzima delle chinasi, trasferisce un gruppo Pi al
substrato
•  Esempio: Glucosio + ATP ⇒ Glucosio-6-fosfato + ADP
•  In molte chinasi, il substrato vero è Mg-ATP
14
Nicotinamide Adenina Dinucleotide (NAD+)
•  Coenzima di
deidrogenasi
•  Derivato da niacina
•  Trasferisce un
protone da/a
substrati:
–  lattato + NAD+ ⇐⇒
piruvato + NADH +
H+
•  Esiste una forma
fosforilata NADP+
Flavina adenina dinucleotide (FAD)
•  Coenzima di
deidrogenasi
•  Derivato da
riboflavina (vit.
B6)
•  Trasferisce due
protoni da/a
substrati
–  Succinato + FAD
⇐⇒ Fumarato +
FADH2
15
Coenzima A
•  Trasportatore
e attivatore di
gruppi acilici
(acidi grassi) e
di acetato
Metalli di transizione (Fe, Zn, Cu, Mn…)
•  Cofattori più che coenzimi
•  Presenti in 2/3 degli enzimi
•  Agiscono come stabilizzatori della proteina e come
donatori/accettori di elettroni (acidi di Lewis), per esempio
i citocromi
16
CINETICHE CHIMICHE E ENZIMATICHE
Ordine di reazione; Ipotesi per l’azione degli enzimi;
Equazione di Michaelis-Menten; Velocità massima e KM;
Trasformazione di Lineweaver-Burk; Rappresentazione
grafica delle reazioni enzimatiche.
Cinetiche chimiche (A⇒P)
17
Effetto della concentrazione di A (A ⇒ P)
A4 > A3 > A2 > A1
[prodotto]
Velocità iniziale
A4
A3
A2
A1
Tempo
A1 A2 A3
A4
[A]
Cinetiche chimiche vs cinetiche enzimatiche
Velocità iniziale
Cinetica enzimatica
Cinetica chimica
[A]
18
Ipotesi per l’azione degli enzimi
[S] >> [E]
E + S ⇐⇒ ES ⇒ EP ⇒ E + P
•  L’enzima si lega col substrato per formare ES: reazione
reversibile
•  Il complesso ES subisce il cambiamento conformazionale che
induce la formazione di P (reazione relativamente lenta)
•  L’enzima rilascia P e torna nello stato iniziale
•  La velocità globale è regolata da [ES]
Ordine di reazione
•  Primo ordine
A⇒P
v=k[A]1, n=1
•  Secondo ordine
A+B⇒P
v=k[A]1[B]1, n=2
•  Pseudo primo ordine
A+B⇒P
v=k[A]1[B]1, n=2
ma se [B]»[A], v=k[A]1, n=1
•  Ordine zero
v=k, n=0
v dipende dalla concentrazione del catalizzatore
19
Interazione enzima-substrato
v0
Se [S] è molto alto, v0 non cambia
all’aumentare di [S]
Vmax
Ordine 0
Ordine misto
1° ordine
Se [S] è alto, v0 è
controllata da [E]
Se [S] è intermedio, v0 è
controllata sia da [S], sia
da [E]
Se [S] è basso, v0 è
controllata da [S]
[substrato]
Commission on Enzyme Nomenclature of the
International Union of Biochemistry
•  Attività enzimatica: moli di substrato convertito per unità
di tempo in condizioni standard di temperatura, pH e forza
ionica:
–  1 katal = 1 mol/s
–  1 IU = 1 micromole/min
•  Attività specifica: attività enzimatica per mg di proteina
(moli/tempo/mg proteina)
–  Espressione di purezza
•  Costante catalitica o numero di turnover: attività
enzimatica per mole di enzima (moli/tempo/mole enzima)
20
Equazione di Michaelis-Menten (1913)
v0 =
Vmax ⋅[S]
K M + [S]
Leonor Michaelis & Maud Menten
Leonor Michaelis (Berlin, January 16, 1875 – New York, October 8, 1949).
Maud Leonora Menten (Ontario, March 20, 1879 – July 26, 1960), among the
first women in Canada to earn a medical doctorate. At that time women were not
allowed to do research in Canada, therefore she decided to do research in other
countries such as the United States and Germany. Accomplished musician and
painter.
Assunzioni di Michaelis-Menten
•  E + S ⇐⇒ ES ⇒ E + P
•  1 solo substrato
•  Fattore limitante:
formazione di ES
•  Tutto E ⇒ ES
–  Non esiste E libero
–  E saturo di S
•  ES stazionario
21
Ipotesi v0=Vmax/2
•  KM = [S] quando v0=Vmax/2
•  E’ una concentrazione
(dimensioni moli/litro)
•  E’ indipendente da [E]
v0 =
Vmax ⋅[ S]
K M + [S]
Vmax Vmax ⋅ [S]
=
2
K M + [S]
1
[S]
=
2 K M + [S]
K M + [S] = 2 ⋅[ S]
K M = [S]
Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche
v0
Vmax
Vmax/2
KM
[S]
22
Trasformazione di Lineweaver-Burk
v0 =
Vmax ⋅[S]
K M + [S]
Y
1 K M + [S]
=
v 0 Vmax ⋅ [S]
1
KM
[S]
=
+
v 0 Vmax ⋅ [S] Vmax ⋅ [S]
1 KM 1
1
=
⋅
+
v 0 Vmax [S] Vmax
X
€
Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche
1
KM 1
1
=
⋅
+
v0 Vmax [S] Vmax
1/v0
1/Vmax
-1/KM
1/[S]
23
Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche
Grafico di Lineweaver-Burk
V0
1/V0
Vmax
Vmax/2
1/Vmax
KM
[S]
-1/KM
1/[S]
Esochinasi (HK) e glucochinasi (GK)
Glucosio + ATP → Glucosio-6-fosfato + ADP
•  [glucosio] in sangue: 5 mM
•  [glucosio] intracellulare: 0.2-2 mM
•  Muscolo: HK
–  Inibita da Glucosio-6-fosfato
–  Utilizzo di glucosio indipendente da
[glucosio] in sangue
•  Epatociti: GK
–  Non inibita da Glucosio-6-fosfato
–  Trasformazione di glucosio in glicogeno
dipendente da [glucosio] in sangue
•  Pancreas: GK
–  Non inibita da Glucosio-6-fosfato
–  Sensore di [glucosio] in sangue per la
produzione di insulina
24
Metabolismo dell’alcool
Alcool deidrogenasi
Aldeide deidrogenasi
CH3-CH2OH ⎯⎯⎯⎯⎯→ CH3-CHO ⎯⎯⎯⎯⎯→ CH3-COO
Etanolo
Acetaldeide
Acetato
• 
KM di alcool deidrogenasi per etanolo: 1 mM (46 mg/l)
–  Enzima saturo dopo pochi drinks (anche uno)
–  Metabolizzazione segue una cinetica di ordine zero
• 
• 
• 
–  3 varianti con poche differenze in termini di KM e Vmax
KM di aldeide deidrogenasi per acetaldeide: 0.01 mM
–  Livello di acetaldeide 1/1000 di quello di etanolo
–  In presenza di isoforma con KM=1 mM, accumulo di acetaldeide
–  “Oriental flush”
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0
60
50
[aldeide], µM
[alcool] in sangue, g/l
• 
Velocità: 10 g/h
Diminuzione del tasso nel sangue: 0.15 g/l
Indipendente dal tasso iniziale
40
30
KM=1 mM
20
KM=0.01 mM
10
1
2
3
4
5
6
7
8
Tempo, ore dopo 0.6 g/kg
9
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tempo, ore dopo 0.6 g/kg
REGOLAZIONE DELL’ATTIVITÀ ENZIMATICA
Necessità fisiologica; Catene enzìmatiche; Controllo del
livello di enzima; Ubiquitina; Fattori fisici e chimici di
modulazione dell’attività; Inibizione competitiva e non
competitiva; Compartimentalizzazione intracellulare;
Modificazioni allosteriche e covalenti; Allosterismo e
cooperatività; Cinetica degli enzimi allosterici e cooperativi.
25
Il buon funzionamento della cellula richiede che le
varie attività enzimatiche siano regolate
•  In condizioni di stato stazionario, i processi cellulari non
funzionano mai al massimo delle loro capacità, ma possono
anche venire completamente disattivati:
–  Non produrre prodotti inutili
–  Economizzare energia
–  Aumentare rapidamente l’attività se necessario
Reversibilità delle reazioni enzimatiche
•  L’enzima favorisce il raggiungimento dell’equilibrio, quindi in teoria
potrebbe catalizzare anche la reazione inversa
A ⇐⇒ B
•  Ma, se B è substrato di una reazione successiva, la prima reazione
diventa praticamente irreversibile
A→B→C
•  Ciò vale per catene anche molto lunghe di reazioni (catene
enzimatiche)
A→B→C→D→E
•  Anche se le singole reazioni enzimatiche sono reversibili, in pratica il
flusso è unidirezionale perché il prodotto di una reazione funge da
substrato per la reazione successiva
•  Spesso il prodotto terminale di una sequenza di reazioni (E) inibisce il
deflusso della stessa catena a livello della prima reazione A → B
–  L’accumulo di E “chiude il rubinetto”
–  La mancanza di E “riapre il rubinetto”
A→B→C→D→E
26
Caratteristiche generali delle reazioni regolatorie
• 
• 
• 
• 
ΔG<<0 (maggior efficacia)
Precoci nella catena enzimatica
Inibizione o regolazione da parte del prodotto finale
Gli enzimi coinvolti sono spesso multimerici
–  Capacità catalitica = (concentrazione di enzima) x (efficienza
catalitica)
Controllo della concentrazione di enzima
(regolazione lenta)
Regola generale: Tutte le strutture cellulari ed extracellulari
(ad eccezione dell’eritrocita umano) sono sottoposte a
ricambio ed equilibrio dinamico
Quindi, ad ogni istante, il livello di un enzima dipende da:
•  Velocità di sintesi della proteina
•  Velocità di trasformazione da zimogeno in enzima attivo
•  Velocità di degradazione
27
Velocità di sintesi
•  Può aumentare in seguito all’accumulo intracellulare del
substrato (es: operon del lattosio)
•  Può aumentare in presenza di induttori gratuiti senza
relazione col substrato
•  Può essere repressa dai prodotti terminali della catena
enzimatica (es: alcuni aminoacidi (His, Leu), effetto
glucosio in E.coli)
Trasformazione da zimogeno (pro-enzima) in
enzima attivo
proinsulina → insulina
28
Chimotripsinogeno → chimotripsina
Attivazione degli zimogeni pancreatici mediante
taglio proteolitico
29
Velocità di degradazione
Dipende da:
•  Lisosomi, pinocitosi, endocitosi
•  Ormoni (insulina, glucagone, glucocorticoidi…)
•  Ubiquitina (The kiss of death), Nobel Prize 2004
–  Aaron Ciechanover, Avram Hershko e Irwin Rose,
Medical Sciences, Technion in Haifa and UC Irvine
College of Medicine in California)
–  Proteina altamente conservata (76 aa) e ubiquitaria
–  Attivata da ATP
•  Gli altri enzimi proteolitici non dipendono da ATP
–  Si lega covalentemente alla proteina-bersaglio (Lys)
–  Il complesso proteina-ubiquitina marcato per la
distruzione
Funzioni biologiche della proteolisi ubiquitinadipendente
•  Regolazione del ciclo cellulare
–  Essenziale per uscire dalla fase mitotica e separare i cromosomi
durante mitosi e meiosi
–  Malfunzionamenti causano formazione di cellule con numero anomalo
di cromosomi (Down e tumori solidi)
•  Riparazione del DNA, cancro e apoptosi
–  Essenziale per mantenere il livello di p53 (il “guardiano del genoma”)
•  Risposte immunologiche e infiammatorie
–  Regolazione di NF-kB (fattori di trascrizione) per attivare
l’espressione genica
–  Generazione di peptidi MHC (difesa contro le infezioni virali)
•  Fibrosi cistica
–  Coinvolta nella mutazione di CFTR (transmembrane conductance
regulator)
30
Compartimentalizzazione
•  Si può ottenere un forte aumento di concentrazione di
molecole compartimentalizzandole in una zona delimitata
da una membrana
•  Esempio: GLUcose Transporter (GLUT)
–  GLUT1, costitutivo
–  GLUT4, inducibile da insulina
Modulazione dell’attività dell’enzima
(regolazione veloce)
•  pH
•  Temperatura
•  Inibizione reversibile ed irreversibile:
–  Competitiva
–  Non-competitiva
–  Uncompetitiva
•  Modificazioni allosteriche
•  Modificazioni covalenti
31
pH, temperatura e attività enzimatica
• 
Ogni enzima ha il suo pH ottimale
Il pH ottimale può non corrispondere
col pH in cui si trova l’enzima
• 
Per ogni enzima, esiste una temperatura
ottimale
La temperatura ottimale può non
corrispondere con la temperatura in cui
si trova l’enzima (37°C)
Aumento dovuto alla
temperatura
(1.7-2.5 ogni 10°C)
Velocità
• 
• 
Diminuzione dovuta
alla denaturazione
della proteina
Risultato
0
10
20
30
40
50
Temperatura
Inibizione competitiva e non-competitiva
Competitiva:
Substrato e inibitore si legano al sito
attivo dell’enzima
Il complesso enzima+substrato è
inattivo
Non-competitiva:
Quando l’enzima lega l’inibitore,
l’enzima cambia la conformazione e
diventa inattivo
32
Inibizione competitiva
•  I simile a S, compete con S per il sito attivo di E
•  Inibizione reversibile all’aumentare di [S]
•  Vmax non cambia, KM aumenta
v0
1/v0
Vmax
↑ inibitore
→ inibitore
Vmax/2
1/Vmax
→ KM
[S]
→ 1/KM
1/[S]
Esempi di inibizione enzimatica competitiva
CH3OH
CH3-CH2OH
Metanolo
Etanolo
33
Esempi di inibizione enzimatica competitiva
Metotrexato o antifolato, antileucemico che rallenta la
biosintesi di purine e pirimidine
Esempi di inibizione enzimatica competitiva
Fluorouracile, analogo della mercaptopurina
34
Esempi di inibizione enzimatica competitiva
Substrati suicidi o antimetaboliti, prevengono la reazione col
substrato e/o disattivano l’enzima
Penicillina inibisce transpeptidasi che stabilizza le membrane
batteriche
Inibizione non competitiva
• 
• 
• 
• 
I reagisce su un sito diverso dal sito attivo
Tende a disattivare E
Inibizione non reversibile all’aumentare di [S]
KM non cambia, Vmax diminuisce
v0
1/v0
↓ inibitore
↑ inibitore
↓Vmax
↑ 1/Vmax
↓Vmax/2
KM
[S]
1/KM
1/[S]
35
Esempi di inibizione non-competitiva
•  Degradazione proteica (temperatura, estremi di pH)
•  Molti veleni e composti mercuriali (reagiscono con -SH dei
residui di Cys)
•  Cianuro, reagisce con gli ioni metallici degli enzimi della
catena respiratoria
•  Diisopropil fluorofosfato (Sarin), gas nervino, inibisce gli
enzimi contenenti Ser (acetilcolinesterasi)
Inibizione uncompetitiva
I si lega al complesso ES
36
Inibizione uncompetitiva
•  L’inibitore reagisce con il complesso ES
•  Cambiamenti simultanei di KM e Vmax
V0
1/V0
+ inibitore
Vmax
+ inibitore
1/Vmax
KM
[S]
1/KM
1/[S]
Modificazioni covalenti degli enzimi
•  La fosforilazione AUMENTA l’attività
di alcuni enzimi
–  Glicogeno fosforilasi, citrato liasi, fosforilasi
b chinasi, HMG-CoA reduttasi chinasi e
altri...
•  La fosforilazione DIMINUISCE
l’attività di altri enzimi
–  Acetil-CoA carbossilasi, glicogeno sintasi,
piruvato deidrogenasi, HMG-CoA reduttasi
e altri...
•  The Nobel Prize in Physiology or
Medicine 1992
–  Edmond H. Fischer and Edwin G. Krebs,
Professors Emeritus, University of
Washington, Seattle, USA
–  … for their discoveries concerning reversible
protein phosphorylation as a biological
regulatory mechanism
37
cAMP
Ormone
cAMP come secondo messaggero
Proteina
G
Recettore
Adenilato
ciclasi
ATP
cAMP
R
R
R C
R C
Protein chinasi A
inattiva
C
C
Protein chinasi A
attiva
38
Allosterismo
allo = l’altro
• 
• 
• 
• 
Attività enzimatica sotto il controllo di un modulatore
Classe K o V: altera KM o Vmax
Inibitore o stimolatore
Interazione eterotropica: il modulatore è diverso dal
substrato
•  Interazione omotropica: il modulatore funge anche da
substrato
Jacques Monod
Nobel Prize 1965
Quando due leganti si legano alla stessa proteina,
possono influenzare l’uno il legame dell’altro
•  Esochinasi (HK)
Glucosio + ATP ⇐⇒ glucosio-6-fosfato + ADP
•  Quando HK lega glucosio, l’affinità per ATP
aumenta
•  Quando HK lega ATP, l’affinità per glucosio
aumenta
39
Allosterismo
•  Effetto reciproco di due leganti quando i siti di legame
sono separati
•  Se i due leganti si legano alla STESSA conformazione di un
enzima, ne risulta un’interazione POSITIVA
•  Se i due leganti si legano a conformazioni DIVERSE , ne
risulta un’interazione NEGATIVA
Modello di enzima allosterico multimerico
A provoca un cambiamento conformazionale che facilita il legame con S
Il cambiamento conformazionale è trasmesso alla subunità adiacente
Allosterismo e cooperatività:
–  Allosterismo: cambiamenti conformazionali di una subunità in risposta ad un effettore
allosterico
–  Cooperatività: cambiamenti conformazionali di una subunità in risposta al cambiamento
conformazionale della subunità adiacente
–  Conformazione privilegiata nell’evoluzione naturale: il destino di una molecola è associato alla
presenza/assenza di un’altra
A
S
A
S
• 
• 
• 
A
40
Cinetiche degli enzimi allosterici e cooperativi
•  Sigmoide, non iperbolico
•  NON-Michaelis-Menten
•  Sempre più efficaci all’aumentare del numero di subunità
v0
4 subunità
1 subunità
2 subunità
[S]
41