TUTTI GLI ENZIMI POSSONO
ESSERE
A N A L I Z Z AT I I N M O D O D A P O T E R
QUANTIFICARE SIA LA VELOCITA’ DI
REAZIONE CHE LA LORO
EFFICIENZA ENZIMATICA
Lo studio della cinetica enzimatica inizia nel
1909 con ADRIAN BROWN e i sui studi
sulla velocità di IDROLISI del SACCAROSIO
catalizzata dall’enzima β-fruttofuranosidasi
SACCAROSIO + H2O
GLUCOSIO + FRUTTOSIO
Quando la concentrazione del saccarosio
è molto più elevata dell’enzima, la
velocità di reazione diventa indipendente
dalla concentrazione del saccarosio
1
2
1
[E]
0
V
V00 == NUMERO
NUMERO
DI MOLIDI
DI O
M
SUBSTRATO
LI DI PRO
CHE
D O SI
T TO
CONSUMANO
CHE SI IN
FORMANO
UN
IN UN SECONDO
SECONDO
AD UNA
AD UNA
CONCENTRAZIONE
CONCENTRAZIONE
FISSA DI
FISSA
DI ENZIMA
ENZIMA
1
2
3
Leonor Michaelis
e Maud Menten
nel 1913
proposero un
semplice
modello
matematico per
spiegare queste
caratteristiche
cinetiche
4
Velocità a
differenti
3
concentrazioni
di S
Il punto focale
dell’ipotesi di
Michaelis e Menten sta
nella formazione di un
COMPLESSO ES
SPECIFICO
come intermedio
essenziale per la
catalisi
COMPLESSO
ENZIMASUBSTRATO
Michaelis e
Menten
proposero che
la REAZIONE
E+S
ENZIMATICA
COMPLESSIVA
La
fosse
reazione
costituita da
raggiunge
due REAZIONI velocemen
ELEMENTARI
te
K
1
K
K2
ES
P+E
3
4
l’equilibrio
2
Questi scienziati attraverso una serie di
assunzioni logiche vogliono determinare
un equazione della velocità che metta in
relazione la velocità di reazione alla
concentrazione del substrato in una
reazione catalizzata da un enzima.
Vogliono cioè
ricavare
l’equazione della
velocità che sia
valida per una
qualsiasi reazione
catalizzata da un
LA PRIMA ASSUNZIONE ( assunzione dell'
"equilibrio rapido")
dice che il complesso ES è in equilibrio
con l’E libero e il S e che questa
situazione di equilibrio non è disturbata
dalla formazione del P. In altre parole la
velocità di formazione del prodotto a
partire da ES è molto piccola rispetto alla
velocità con cui ES si scinde per dare E+S
( k3 << k2 ).
La velocità di
catalisi è data
dalla
formazione
del prodotto
(reazione più
lenta)
qualsiasi enzima
5
V=
d[P]
dt
=K3[ES]
6
3
LA SECONDA ASSUNZIONE (assunzione
della velocità iniziale V0 )
la velocità della reazione viene valutata per
un periodo di tempo durante il quale la
reazione inversa è fisicamente trascurabile
in quanto poco è il prodotto formatosi: la
velocità iniziale che può così essere
determinata sarà la massima velocità
ottenibile.
In condizioni di velocità iniziale la reazione
è di fatto irreversibile (k4=0) e deve essere
scritta nel seguente modo:
7
Stato Prestazionario
e Stato Stazionario
8
4
Stato Prestazionario
e Stato Stazionario
LA TERZA ASSUNZIONE
(assunzione dello "stato
stazionario“)
Dice che il complesso ES si
mantiene in uno stato stazionario
durante tutto il periodo di tempo in
cui si possono misurare le velocità
iniziali.
[ES] rimane costante
per cui la velocità con
cui il complesso ES si
forma a partire da E+S
è uguale alla somma
delle velocità con cui
si scinde per dare E+P
ed E+S.
9
10
5
ASSUNZIONE
DELLO STATO
STAZIONARIO
[S] >> [E]
V0 =K3[ES]
Velocità di
sintesi di ES
rimane
COSTANTE
equazione di
conservazione di
massa per l'enzima:
v di SINTESI = v di CONSUMO
C O M E S I
A R R I V A
ALL’EQUAZIO
NE DELLA
VELOCITA’
11
La concentrazione di ES deve
essere scritta in termini di
concentrazioni note
12
6
Svolgiamo l’equazione
portando le costanti
tutte dalla stessa parte
K1 [E] [S] = K3 [ES] + K2 [ES]
[E] [S] (K3 + K2)
=
[ES]
K1
Velocità
di
formazio
ne di ES
Velocità di
formazione di ES
Velocità di
scissione di ES
d[ES]
dt
=0
Velocità di
scissione
di ES
(K3 + K2)
=
K1
[ES]= K1[E] [S]
[ES]= (K2+K3) [ES]
K1 [E] [S] = K3 [ES] + K2 [ES]
13
=
KM
COSTANTE
DI
MICHAELIS
KM
=
[E] [S]
[ES]
Per poter essere utilizzate le
espressioni CINETICHE devono essere
formulate in quantità note
Poiché [E]T = [E] + [ES] [E] = [E]T - [ES]
([E]T –
sostituendo KM =[ES])[S]
[ES]
14
7
([E]T –
KM =[ES])[S]
[ES]
Risolvendo rispetto a ES
[ES] KM = [E]T [S]–
[ES][S]
[ES] KM + [ES][S] = [E]T [S]
[ES] (KM + [S]) = [E]T [S]
[E]T[S]
[ES] =
KM + [S]
Poiché la velocità iniziale è data da
V0 =
d[P]
dt
= K3[ES]
Sostituendo a [ES]
l’equazione diventa:
[ES] = V0 /
K3
V0=
QUANDO
V0=
K3[E]T[S] [S]>> [E]
KM + [S]
VMAX
TUTTO L’ENZIMA E’
SATURATO
[ES]
[ET]
V0= K3[ES]
[S] K3[ET]
V 0=
v0 =
KM + [S]VMAX = K3[ET]
Equazione di una iperbole
K3[E]T[S]
KM + [S]
15
16
8
VMAX [S]
Equazione di
MichaelisMenten
v0 =
KM + [S]
quan
do
VMAX [S]
VMAX
v0 =
KM + [S]
2
Se VMAX è il valore
dell’asintoto a cui tende
l’iperbole, a che valore
corrisponde la KM ?
V0 = VMAX/2
=
VMAX [S]
KM + [S]
VMAX (KM + [S]) = 2 VMAX [S]
VMAX diventa l’
asintoto a cui
tende l’iperbole
e
KM ?
KM + [S] = 2
[S]
17
KM = [S]
La KM equivale alla concentrazione
del substrato quando la velocità è
uguale a VMAX/2
18
9
Per concentrazioni di
substrato basse
[S]<<Km
l'equazione di
Michaelis-Menten
diviene l'equazione
della retta:
VMAX [S]
v0 =
KM + [S]
ANALISI DEI DATI
CINETICI
L' equazione di MichaelisMenten può però essere
manipolata per ottenere l'
equazione di una retta in cui
Vmax e Km siano delle
intercette e non più degli
asintoti.
Grafico di Lineweaver e Burk o Grafico dei
doppi reciproci
Per concentrazioni di
substrato [S]>>Km
Trasforma l’equazione di un iperbole
nell’equazione di una retta
VMAX [S]
v0 =
KM + [S]
l'equazione di
Míchaelis-Menten si
semplifica nella
relazione:
1
V0
19
=
KM
+
[S]
VMAX [S] VMAX [S]
Equazione lineare rispetto a
1/v0 e 1/S
1
V0
=
KM + [S]
VMAX [S]
1
1 = KM 1
+
S V
V0 V
MAX
MAX
Y=mX+
c
20
10
Equazio
ne di
una
retta
SVANTAGGI:
1)
la maggior parte delle misure
sperimentali
di [S] sono concentrate
nella parte sinistra
del grafico.
2)
La KM ha un
valore unico
per ciascuna
coppia
ENZIMASUBSTRATO
piccoli valori di [S]
piccoli errori in v0
Grandi errori in
KM e VMAX
Grandi errori 1/v0
21
CORRISPONDE ALLA
CONCENTRAZIONE DI SUBSTRATO IN
CUI LA VELOCITA’ DI REAZIONE E’ 22
META’ DELLA VELOCITA’ MASSIMA
11
quando
KM
=
K3 << K1
(K3 + K2)
K1
KM =
K2
K
= KS
Costante di
EQUILIBRIO
1
Capacità di incontrare
substrato
il
KM = KS
Quando K1>
K2
KM bassa
alta affinità
Quando K1<K2
KM alta
affinità
23
bassa
Rappresent
a la
capacità
dell’enzima
di legare il
substrato
A più alta
(Km2) o più
bassa (Km1)
concentrazion
e di substrato
ottengo la
stessa V0 =
V
La KM ha un valore unico per MAX/2
ciascuna
coppia enzima-substrato
24
12
Significato pratico della Km.
Il valore della Km è importante per varie
ragioni:
q  La Km rappresenta
approssimativamente il valore della
concentrazione intracellulare del
substrato.
25
q  La Km è una costante specifica per ogni
enzima, il suo valore numerico ci fornisce
un mezzo per comparare enzimi
provenienti da organismi diversi, da
differenti tessuti dello stesso organismo o
dallo stesso tessuto a differenti stadi di
sviluppo: se due enzimi hanno valori
differenti di Km è probabile che siano due
ISOENZIMI.
q  c) Spesso ligandi differenti dal substrato
provocano modificazioni del valore della
Km. Se la Km determinata in vitro sembra
essere troppo alta, allora è pensabile che
in vivo sia presente un inibitore che ne
abbassi il valore ad una livello
'fisiologico'.
q  d) Se si conosce il valore della Km di un
enzima, allora è possibile misurarne la
velocità di reazione in condizioni di [S] di
26
saturanti.
13
In realtà il valore della
VMAX non è una costante
ma dipende dalla
quantità di enzima che è
stata messa per
calcolare l’equazione di
Michaelis-Menten. MA
poichè:
VMAX = K3[E]T
Vmax
K 3=
E
K
M
= K catmoli/sec
moli
T
è anche
chiamata:
Misura la velocità di un
processo catalitico ( a
carico di una molecola
enzimatica) ed ha le
dimensioni: sec-1
NUMERO DI TURNOVER
Numero di molecole di substrato
trasformate da una molecola enzimatica
27
in un secondo
Nella cellula la maggior parte degli enzimi non si
trova mai a concentrazione di substrato saturante
ma a concentrazioni che determinano una velocità
che varia tra il 10-50% di quella massima
Quando
KM
[S] <<
Vmax
V0 = [S]
KM + [S]
Vmax
Kcat =
ET
Vmax
V0 =[S]
KM
Vmax = Kcat
[ET]
V0 =
[E] ≅ [E]T
[ES]molto piccolo
La velocità
d i v e n t a l a
probabilità
dell’enzima di
t r o v a r e i l
substrato e il
valore
Kcat[E][S]
KM
Misura l’efficienza
catalitica di un
Kcat KM enzima
28
/
14
A bassa
concentrazione
di substrato
V0 =
Kcat
KM
[E][S]
La TEORIA DELLA DIFFUSIONE dice
che esiste un valore teorico della
capacità di incontro di due molecole e
questo valore è di 108 - 109 (moli/l)-1 s-1
La trioso isomerasi che catalizza la
reazione di isomerizzazione della G3P a
DHAP possiede un valore di Kcat/KM = 2,4
x 108 (mol/L)-1 sec-1.
Efficienza che si avvicina a quella 29
massima
La maggior parte delle reazioni enzimatiche
ha più substrati per ognuno possiamo
calcolare la l’efficienza catalitica
Da questi dati è abbastanza evidente
che la chimotripsina ha una
predilezione ad operare l’idrolisi in
prossimità dei residui maggiormente
idrofobici
30
15
La velocità di reazione è limitata solo
dalla velocità con cui riescono ad
incontrare il substrato in
soluzione.
I limiti imposti
dalla velocità di
diffusione
possono essere
s u p e r a t i
m e d i a n t e
s t r u t t u r e
polienzimatiche
Complesso
multienzima
tico
31
Possono essere divise in due classi :
reazioni sequenziali e reazioni a doppio
spostamento
+
+
+
+
+
+
32
16
MECCANISMO
ORDINATO
A
B
Prima tutti i
substrati si
combinano con
l’enzima poi
vengono rilasciati
come prodotti
P Q
MECCANIS
MO
CASUALE
E
A
EA
E
P
B
A
E
Q
P
Creatina
chinasi
+
EAB —EPQ
+
+
creatinaAT
Creatin
aP
P
piruv NADH+H+
ato
E
Q
EAB—EPQ
+
E
EQ
B
E piruvato NADH —E
lattato NAD+
lattat NAD+
o
33
E
E creatina ATP — E
ADPcreatina P
E
AT
P
creatina
ADP
E
34
ADP Creatina
P
17
Reazioni a doppio spostamento
Reazioni a
ping-pong
Uno o più prodotti vengono rilasciati dal
complesso prima che tutti i substrati si
siano legati
P
A
B
Q
+
Α-chetoglutarato
glutammato
E
EA—FP
F
FB—
EQ
E
In queste reazioni i reagenti non si incontrano
mai sulla superficie dell’enzima
+
+
35
+
aspartato
ossalacetato
E
E
Eglut-Fchetoglut
F
Fossal-Easpart
I meccanismi a due substrati, molto più
complicate di quelli a singolo, possono
essere studiati con le misure di
cinetiche allo stato stazionario,
contengono però 4 costanti cinetiche e
possono essere utilizzate per
36
distinguere i vari meccanismi.
18
Gli studi di CINETICA STAZIONARIA non
danno informazioni sulla velocità di
formazione o quella di scissione né sulla
natura del complesso ES né se esistano
uno o più complessi.
E + S D ES D EX D EP D E + P
OPPURE
EX
E + S D ES
EP D E + P
Unità di attività enzimatica e
dosaggio degli Enzimi
Catal (kat): è la quantità di enzima che
converte 1 mole di reagente nel
prodotto in 1 secondo nelle condizioni
di reazione standard (ottimali).
L’Unità internazionale (U): corrisponde
alla quantità di enzima che converte 1
µmole di reagente nel prodotto in 1
minuto. Poiché 1 µmole /min = 1.67
×10-8 moli /s quindi U = 1.67 ×10-8 kat.
EY
Tuttavia se i DATI CINETICI non sono
compatibili con un certo meccanismo
molecolare allora
quel meccanismo deve essere
scartato
37
L’attività specifica: è il rapporto tra il
numero di U o di Kcat e la quantità
totale di proteina espressa in
milligrammi.
38
19
Effetto del pH
L’attività enzimatica è influenzata dal pH. Ciò può derivare
dai valori di pKa del substrato e/o dell’enzima. Perciò il pH
scelto e la selezione di un tampone appropriato sono
fondamentali per i saggi di attività enzimatica.
L’attività specifica è una misura del grado di
purificazione dell’enzima e il suo valore tende
a raggiungere un massimo e rimane poi
costante quando tutte le molecole del
campione in esame sono molecole di enzima39
attivo.
40
20
Effetto della
temperatura
Le reazioni enzimatiche, come le reazioni chimiche,
temperatura
dipendono dalla
temperatura, inoltre se la temperatura
diventa troppo alta l’enzima può denaturarsi e si avrà
perdita di attività.
Misure sperimentali e Analisi dei
dati cinetici
Per misurare la velocità di reazione abbiamo bisogno di
un sistema per seguire la formazione del prodotto o il
consumo di substrato.
Via via che il substrato viene consumato la velocità
diminuisce fino a quando alla fine viene raggiunto
l’equilibrio.
Di regola si preferisce predisporre una serie di
esperimenti tutti alla stessa concentrazione di enzima,
ma a diverse concentrazioni di substrato e misurare la
velocità iniziale (V).
41
42
21
Esempio: misura dell’attività
enzimatica della fosfatasi alcalina
PNPP
Poiché la variazione di [S] rispetto a t è pressoché
lineare nelle fasi iniziali è possibile eseguire analisi
accurate di V in funzione di [S].
PNP
La fosfatasi alcalina catalizza l’idrolisi di tutti I
fosfomonoesteri. Si esegue il saggio enzimatico con un
composto non naturale sistetizzato chimicamente: il pnitrofenilfosfato (PNPP) che viene idrolizzato a pnitrofenolo (PNP) e Pi. La forma ionica del PNP è colorata
(410 nm) quindi la reazione può essere misurata
spettrofotometricamente.
43
44
22
Le sostanze che alterano l’attività di
un enzima legandosi ad esso, sono
chiamate INIBITORI
INIBIZIONE
Ogni sostanza che
riduca la velocità di una
reazione enzimatica è da
considerarsi un inibitore.
La formazione reversibile di un legame non
covalente con una molecola diversa dal
substrato porta alla formazione di
complessi anomali, che non fanno parte del
normale processo catalitico.
Nella trattazione cinetica della inibizione
enzimatica si applicano le assunzioni di
Michaelis-Menten anche all'inibitore.45Ci
sono almeno tre tipi principali di inibizione.
REVERSIBILE
Legame non
covalente tra
inibitore e enzima
IRREVERSIBILE
Legame covalente
tra inibitore e enzima
INATTIVATORI
Azione di tossine e
veleni specifici, molti
46
dei quali provocano
la morte inattivando degli enzimi chiave.
23
INIBIZIONE
COMPETITIVA
Sostanza che
compete con il
substrato per il
SITO ATTIVO
INIBIZIONE
NON COMPETITIVA
INIBIZIONE
INCOMPETITIVA
L’inibitore che somiglia al substrato lega
l ’ e n z i m a n e l S I T O AT T I V O , m a
diversamente dal substrato non è capace
di reagire per dare un prodotto di
reazione.
K1
K3
E + S D ES " E + P
K2
+
I
Sostanza che si lega
ad un SITO DIVERSO
dal sito attivo
INIBITORE
COMPETITIVO
INIBITORE
NON COMPETITIVO
INIBITORE
INCOMPETITIVO
47
In presenza dell’INIBITORE
l’enzima non può legare il
E I substrato come di consueto.
L’Enzima opera come se la
sua KM per il substrato fosse
aumentata
KI E
[E]t = [E] + [ES] + [EI]
Enzima
totale
Enzima
libero
Enzima Enzima legato
legato
all’inibitore
al
substrato
48
24
UN INIBITORE
COMPETITIVO
R I D U C E
L A
CONCENTRAZIONE
DI ENZIMA LIBERO
DISPONIBILE PER
L E G A R E
I L
SUBSTRATO
STESSA
Vmax
DIVERSA
KM
49
aumenta la KM
Per tutto il tempo che
l’inibitore occupa il
sito attivo, l’enzima
non è disponibile per
50
la catalisi
25
Un inibítore competitivo è una
sostanza che si lega all'enzíma libero,
impedendo così la formazione del
complesso enzima-substrato. Esso può
essere un analogo non metabolizzabile del
substrato, un substrato alternativo per
l'enzima o un prodotto di reazione.
L'inibizione della succinico deidrogenasi da
parte dell'acido maloníco è un classico
esempio di inibizione competitiva da
analogo non metabolízzabile:
51
52
26
Quando
l’inibitore si
lega ad un
SECONDO
SITO sulla
superficie
dell’enzima
diverso dal
SITO
ATTIVO
modificando
la Kcat
L’inibitore si lega tanto
ad E che a ES e che S si
lega sia ad E che a EI.
La presenza di uno di
essi non ha alcun
effetto sulla costante di
dissociazione
dell'altro, ma il complesso ESI è inattivo,
non è in grado cioè di liberare il prodotto.
L’inibitore non competitivo si comporta
come se determinasse una rimozione di
molecole enzimatiche attive dalla soluzione
INIBITORE NON COMPETITIVO
molecola che non somiglia al substrato
53
KM uguale
VMAX VARIA
54
27
L’inibitore si lega direttamente al
complesso ES ma non all’enzima libero
K1
K2
E + S KD ES " E + P
+
L’inibitore incompetitivo,
che non deve
I
-1
necessariamente
somigliare al substrato
provoca una distorsione
nel sito attivo, rendendo
l’enzima cataliticamente
inattivo
KI
ESI
Nessuna
reazione
L’inibitore influenza la
funzione catalitica
dell’enzima, ma non il suo
legame con il substrato.
Importante solo per gli enzimi
a substrati multipli.
Varia sia
VMAX che KM
55
56
28
E' interessante notare che per
l’inibizione incompetitiva, il grado di
inibizione aumenta all'aumentare della
concentrazione del substrato. Ciò è
comprensibile in quanto l'inibitore
incompetitivo si lega al solo
complesso ES, e la [ES] cresce al
crescere di [ S ].
L'inibitore incompetitívo è inibitore per
il suo effetto sulla Vmax, ma è
virtualmente un attivatore per quanto
riguarda la Km.
57
29