Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile Prisca Cima Formazione tecnica in analisi biomediche Scuola superiore medico tecnica, Locarno 2008/2009 Lavoro di diploma svolto presso l’Istituto Cantonale di Microbiologia, Bellinzona Responsabili: Antonella Demarta AnnaPaola Caminada Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile Indice 1.0 2.0 3.0 3.1 3.2 3.2.1 3.3 3.4 3.5 3.5.1 3.6 4. 4.1 4.2 4.3 4.4 4.4.1 4.5 4.5.1 4.6 4.6.1 4.7 4.7.1 4.8 4.8.1 4.8.2 4.8.3 4.8.4 4.9 5. 6. 7. 8. 9. RIASSUNTO /ABSTRACT .............................................................................................4 ABBREVIAZIONI..........................................................................................................5 INTRODUZIONE..........................................................................................................6 Il Clostridium difficile...................................................................................... 6 Patogenicità ................................................................................................... 6 Fattori di virulenza ................................................................................ 7 Manifestazioni cliniche e prevenzione .......................................................... 7 Resistenza ...................................................................................................... 8 Tipizzazioni molecolari ................................................................................... 8 Tipizzazione tramite MALDO TOF ......................................................... 8 Scopo del lavoro............................................................................................. 8 MATERIALE E METODI................................................................................................9 Ceppi Batterici................................................................................................ 9 Terreni di coltura ........................................................................................... 9 Estrazione DNA .............................................................................................. 9 PCR ribotyping 16S‐23S................................................................................ 10 Migrazione in gel d’Agarosio per ribotipo .......................................... 10 Multiplex PCR tossine .................................................................................. 12 Migrazione in gel d’Agarosio per tossinotipo ..................................... 12 Ricerca geni tossina A .................................................................................. 13 Migrazione in gel d’Agarosio per ricerca gene tossina A.................... 14 PCR 16S ........................................................................................................ 14 Migrazione in gel d’Agarosio per PCR 16s .......................................... 16 Sequenziamento .......................................................................................... 16 Purificazione prodotto PCR................................................................. 16 Reazione di sequenza.......................................................................... 17 Purificazione con Sephadex G‐50 ....................................................... 17 Sequenziamento ................................................................................. 17 MALDI‐TOF ................................................................................................... 17 RISULTATI E DISCUSSIONE........................................................................................18 CONCLUSIONI ..........................................................................................................25 RINGRAZIAMENTI ....................................................................................................26 BIBLIOGRAFIA ..........................................................................................................27 ALLEGATI .................................................................................................................29 Prisca Cima TAB3/SSMT 2 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 9.10 9.11 9.12 9.13 Allegato 1‐ ceppi analizzati .......................................................................... 29 Allegato 2‐ Thio ............................................................................................ 30 Allegato 3‐ Agar Sangue ............................................................................... 30 Allegato 4‐ Skim Milk ................................................................................... 30 Allegato 5‐ Master mix................................................................................. 30 Allegato 6‐ Agarosio ..................................................................................... 31 Allegato 7‐ TBE ............................................................................................. 31 Allegato 8‐ GelRed ....................................................................................... 31 Allegato 9‐ Peso molecolare ........................................................................ 31 Allegato 10‐ Loading buffer ......................................................................... 31 Allegato 11‐ BigDye kit................................................................................. 32 Allegato 12‐ Sephadex G‐50......................................................................... 32 Allegato 13‐ DHB .......................................................................................... 32 Prisca Cima TAB3/SSMT 3 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile 1.Riassunto 1.Abstract Il C. difficile è un bacillo gram positivo, anaerobico e sporigeno, con una temperatura ottimale di crescita di 36°C. E’ molto diffuso nel suolo, nei sedimenti marini, nelle acque luride e nelle feci di esseri umani e di animali grazie alle sue spore molto resistenti anche in ambiente aerobico. Causa infezioni del tratto gastro‐intestinale, può colpire persone immunocompromesse o che hanno iniziato una cura antibiotica. L’infezione da C.difficile si manifesta con febbre, perdita di appetito, nausea e dolori addominali. Di particolare importanza è il ribotipo 027, in quanto ritenuto un ceppo molto virulento, che si sta propagando in tutto il mondo, ed è già stato isolato anche in Svizzera (Basilea). Lo scopo di questo lavoro è caratterizzare stipiti di C. difficile isolati in Ticino, valutando le eventuali correlazioni tra le varie infezioni occorse negli ospedali e verificando l’eventuale presenza del ribotipo 027. Sono stati inoltre testati i campioni per quanto riguarda il profilo tossigenico, in quanto la produzione di tossine è ritenuto un ulteriore fattore di virulenza. Attualmente dalle analisi svolte all’ICM in routine è unicamente possibile capire se il ceppo è produttore di tossine o meno senza poterle però differenziare. Sono stati analizzati 52 campioni, ma ne sono stati presi in considerazione 46. L’estrazione del DNA è stata effettuata tramite il kit InstaGene Matrix (Bio‐Rad). Per la tipizzazione è stata utilizzata la PCR ribotyping. Per la determinazione delle tossine è stata utilizzata una multiplex PCR. I campioni sono stati inoltre sottoposti ad analisi MALDI‐TOF, che è uno spettrometro di massa. Come risultato abbiamo ottenuto due dendrogrammi, uno dalla PCR ribotyping, al quale è poi associato ospedale di provenienza dei campioni e profilo tossigenico ed un altro dendrogramma ottenuto dall’analisi di spettrometria di massa. Paragonando i risultati della PCR ribotyping con il ceppo di riferimento (ribotipo 027) si è esclusa la presenza di questo ribotipo virulento in Ticino. Analizzando i dendrogrammi si sono potuti discutere molti punti. Comparando i due dendrogrammi non si notano similitudine nella disposizione dei campioni. Clostridium difficile is a bacillus gram positive, anaerobic and sporogenic which has an optimal growth temperature of 36°C. It is very diffuse in soil, marine sediment, sewage and in human and animal faeces, due to a very resistant spore that also lives in an aerobic environment. It causes intestinal infections and affects the elderly, immunocompromised people, and those who have begun an antibiotic therapy. The infection is characterized by fever, appetite lost, nausea and abdominal pain. The most important strain belongs to the ribotype 027, a very virulent type, which is spreading all over the world and has already been isolated in Switzerland (Basel). The aim of this work is to characterize C. difficile stains isolated in Ticino, evaluating the relations among the infections occurred in hospitals and verifying whether the ribotype 027 is present. At present in routine analysis carried out at ICM is only possible to understand if a strain can produce toxins or not but the method in use can not differentiate them. In our study, the toxigenic profile of each strain has been established. In this study 52 samples were analysed, but were taken into account only 46. DNA extraction was performed using the kit InstaGene Matrix (Bio‐Rad). Typings were made trough the PCR ribotyping. A multiplex PCR has been carried on for the determination of the toxins. The samples were also analysed with MALDI‐TOF, which is a mass spectrometer. As a result, we have obtained two dendrograms, one from the PCR ribotyping, to which hospital origin of the samples and toxinotype were associated, and the second from mass‐spectrometry. Comparing the results of PCR ribotyping with the reference strain for the ribotype 027, the presence of this virulent ribotype in Ticino was excluded. Analyzing the dendrograms many discussion points were emerged. Comparing the two dendrograms no similitarity appears in the disposition of sample. Prisca Cima TAB3/SSMT 4 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile 2. Abbreviazioni ICM C. difficile CDAD PCR TNFα IL‐1 bp agarosio LE PFGE MLVA AFLP REA MLST slpAST MALDI‐TOF TBE DHB OCL ACQ OBV ODL OIL IOSI OSG Istituto cantonale di microbiologia Clostridium difficile Clostridium difficile‐assaociated diseases Polymerase chain reaction Tumor Necrosis Factor Interleuchina proinfiammatoria Paio di basi agarosio Low Electroendosmosis Pulsed‐field gel electrophoresis Multilocus variable‐number tandem‐repeat Amplified fragment length polymorphism Restriction endonuclease analysis Multilocus sequence typing Surface layer protein A gene sequence typing Matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐ flight Tris‐borato EDTA Dihydroxybenzoic acid Ospedale Civico Lugano Ospedale di Acquarossa Ospedale Beata Vergine Mendrisio Ospedale la Carità Locarno Ospedale Italiano Lugano Istituto oncologico Svizzera Italiana Ospedale San Giovanni Bellinzona Prisca Cima TAB3/SSMT 5 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile 3. Introduzione 3.1 Il Clostridium difficile Il C. difficile è un bacillo gram positivo, anaerobico e sporigeno, ha una temperatura ottimale di crescita di 36°C. Grazie alle sue spore, che possono resistere molto a lungo anche in ambienti aerobici, il C. difficile è diffuso nel suolo, nei sedimenti, nelle acque luride e nelle feci di esseri umani e di animali. Il C. difficile è infatti normalmente presente nel loro tratto intestinale. [1] Le colture su agar sangue si presentano solitamente con colonie lucenti, grigie o giallognole, rotondeggianti, dal margine frastagliato ed un odore simile al cavallo. [1] All’Istituto cantonale di microbiologia di Bellinzona il C. difficile viene isolato tramite una piastra selettiva chiamata Brazier’s C. difficile selective medium. Nel caso di una crescita sospetta, vengono inseminate altre due piastre Agar sangue, una viene incubata in ambiente aerobico e una in ambiente anaerobico. In caso di crescita solo sulla piastra incubata in ambiente anaerobico, viene fatto un test di agglutinazione come conferma. Se la presenza di C. difficile viene confermata, si effettua il test delle tossine sia partendo dalla colonia isolata sia dal campione di feci iniziale. Con questo test è possibile unicamente sapere se il patogeno è produttore di tossine oppure no, ma non è possibile distinguere il tipo di tossina prodotta. 3.2 Patogenicità Questo patogeno è sempre più frequentemente riconosciuto come il responsabile di infezioni ospedaliere e di diarrea da antibiotico. Fu identificato come agente patogeno per la prima volta nel 1978 [2]. Grazie ad una capsula polisaccaridica che impedisce la sua fagocitosi, fa in modo che il parogeno può legarsi alla parete gastrica dove poi prolifera causando infiammazione del colon. In pazienti sani, la flora batterica dell’intestino, composta da numerosi microorganismi, non riesce ad esercitare alcun effetto patogeno, in quanto il nostro organismo è in grado di contrastarne un eventuale sopravvento mantenendo però il minimo indispensabile di flora batterica per il corretto funzionamento dell’intestino. Nel caso di assunzione di antibiotici o persone immunocompromesse, avviene uno squilibrio della flora batterica dove il patogeno prende il sopravvento e prolifera indisturbato, causando la tipica manifestazione clinica da infezione di C. difficile: CDAD (= Clostridium difficile associated disease). Il suo insediamento nel tratto gastrointestinale causa patologie che per severità vanno dalla colonizzazione asintomatica, alla diarrea, alla colite pseudomembranosa, al megacolon tossico fino alla perforazione dell’intestino e portare addirittura, anche se raramente, alla morte del paziente. Sono a rischio di infezione da C. difficile specialmente gli anziani, le persone ricoverate in ospedale o in case anziani, le persone sottoposte ad una cura antibiotica, gli immunocompromessi e pazienti che hanno subito interventi chirurgici gastrointestinali. Nel caso di CDAD che insorge dopo trattamento con antibiotici. Ampicillina, amoxicillina, cefalosporine e clindamicina sono i farmici più comunemente associati a questa patlogia, anche se, teoricamente, tutti gli antibiotici sono in grado di provocare una CDAD [3]. Prisca Cima TAB3/SSMT 6 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile Il contagio avviene tramite bocca, mucose, feci (vasche da bagno, servizi igienici, termometri rettali) e tramite operatori sanitari, i quali fungono da vettore manipolando i pazienti. 3.2.1 Fattori di virulenza I principali fattore di virulenza legati a questo patogeno sono l’enterotossina (tossina TcdA) e una citotossina (tossina TcdB). Ci sono ceppi di C. difficile che non sono produttori di tossine, altri che producono una singola tossina (gene TcdA o TcdB) e altri ancora che producono entrambe le tossine. Solamente i ceppi produttori di tossina sono stati identificati come responsabili di CDAD [1]. Alcuni ceppi producono un’ulteriore tossina, chiamata tossina binaria, che li rende particolarmente patogeni [4]. Questa tossina non è relazionata con la tossina A e la tossina B [5]. Nel 1990 è stato descritto un ceppo produttore unicamente di tossina B con una delezione del gene che produce la tossina A [1]. In questo caso il gene TcdA è presente nel genoma del batterio ma a causa di una mutazione vi è una delezione all’interno del gene, rendendolo così incapace di produrre la tossina A. PaLoc
Figura1 Genoma PaLoc: Insieme dei geni tcdR, tcdB, tcdE, tcdA, tcdC [5]. I geni TcdB, TcdA codificano per la produzione delle tossine A e B [5]. I geni tcdR, tcdE e tcdC sono geni accessori [5]. Le nomenclature H, N, Hc, R, Ec, P, Ha, S, E, Nc mostrano i siti di restrizione. Le tossine prodotte entrano nelle cellule epiteliali intestinali tramite endocitosi, distruggono l’actina del citoscheletro, causandonene la morte della cellula. Esse inducono inoltre la produzione di TNFα e IL‐1 [3]. La tossina A causa una necrosi delle cellule intestinali, ne aumenta la permeabilità, inibisce la sintesi delle proteine, e infine porta ad un erosione della mucosa gastrica [3]. La tossina B non ha evidenti attività enterotossiche, ed è efficace solo dopo che la parete intestinale è stata distrutta [3]. 3.3 Manifestazioni cliniche e prevenzione L’infezione da C. difficile è caratterizzata da diarrea acquosa, febbre, perdita di appetito, nausea e dolori addominali [3]. Prisca Cima TAB3/SSMT 7 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile Si manifesta nei 4‐10 giorni che seguono l’inizio di assunzione di antibiotici, ma può anche insorgere settimane dopo la fine della terapia [3]. Le infezioni da C. difficile costituiscono un ruolo molto importante delle infezioni ospedaliere; infatti, sempre più spesso sono riconosciute causare epidemie nosocomiali [3]. Il miglior modo per prevenire l’infezione di questo batterio è di evitare l’assunzione di antibiotici se non è strettamente necessario. Per operatori sanitari si dovrebbe ridurre al minimo la possibile trasmissione tra un paziente e l’altro tramite materiale, superfici e manipolazioni; tenendo il tutto il più asettico possibile. 3.4 Resistenza Come molti altri batteri, anche il C. difficile mostra delle resistenze verso degli antibiotici. Alcuni ceppi sono resistenti a tetraciclina, cloramfenicolo o eritromicina mentre tutti i C. difficile sono sensibili a metronidazolo e vancomicina [1]. Nei casi più gravi, come ultimo rimedio, può essere necessario asportare parte dell’intestino infettato [3]. 3.5 Tipizzazioni molecolari Per la tipizzazione di questo battere esistono diversi metodi, i più importanti sono la PCR ribotyping, la PFGE, ma ne esistono altri meno usati come la MLVA, AFLP, REA, MLST, slpAST [7]. Per il mio lavoro di diploma è stato deciso di utilizzare come metodo per la tipizzazione, la PCR ribotyping [9]. La scelta è stata orientata verso questo metodo in quanto in Europa è il metodo più utilizzato, è di facile esecuzione e interpretazione rispetto alla PFGE [7] Per la determinazione delle tossine è stata scelta questa metodica perché necessitavamo di un metodo per la determinazione delle tossine rapido e funzionale, così da avere una differenziazione delle eventuali tossine prodotte dal patogeno [8]. 3.5.1 Tipizzazione tramite MALDI‐TOF I campioni testati sono stati sottoposti ad analisi tramite lo spettrometro di massa MALDI‐TOF. Lo spettrometro di massa, viene utilizzato in svariati campi, uno di questi è la microbiologia per l’identificazione delle famiglie e dei ceppi batterici. La classificazione si basa sulla massa molecolare o atomica e alla loro carica elettrica. Lo spettrometro di massa può essere diviso in quattro grandi parti distinte: 1. L’introduzione dei campioni sottoforma di gas, liquido o solido. 2. Ionizzazione dei campioni sotto vuoto. 3. Separazione delle particelle in base alla carica elettrica. 4. Analisi informatica. Si ottiene così uno spettro di massa (rapporto tra massa e carica elettrica) così da poter identificare le colonie sottoposte a quest’analisi [10]. 3.6 Scopo del lavoro In Europa, si sta diffondendo un ceppo particolarmente virulento di C. difficile caratterizzato dal ribotipo 027. Questo ribotipo è stato isolato anche in Svizzera (Basilea). Prisca Cima TAB3/SSMT 8 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile Lo scopo del mio lavoro è di riuscire a caratterizzare a livello molecolare dei ceppi di C. difficile isolati in diversi ospedali e studi medici del Canton Ticino. Tutti i risultati ottenuti dalla PCR ribotipo vengono analizzati utilizzando il programma informatico BioNumerics versione 5.1 (Applied Maths, Belgio). Questo programma permette di parificare i vari gel, per poter così confrontare le varie bande che costituiscono i patterns, inoltre è in grado di trovare le eventuali similitudini tra patterns riuscendo a costruire un dendrogramma. Questo ha permesso di verificare se le varie infezioni accorse negli ospedali ticinesi hanno una correlazione fra loro, e di capire se ci fosse traccia del ribotipo 027 anche in Ticino. Infine ogni ceppo analizzato è stato sottoposto ad analisi con MALDI‐TOF per valutare se i risultati ottenuti da PCR ribotyping e della multiplex PCR per il profilo tossigenico, sono confrontabili e di conseguenza se in futuro sarà possibile passare alla spettromettria di massa per l’identificazione del C. difficile. 4. Materiale e metodi 4.1 Ceppi Batterici Ho analizzato 52 ceppi di C. difficile che sono stati isolati nel corso del 2008 ed inizio del 2009 dal reparto di microbiologia dell’ICM (allegato 1). I ceppi sono stati conservati nei tamponi di trasporto a ‐20°C. Il ceppo di riferimento (ribotipo 027) è stato gentilmente messo a disposizione dal Dr. Med R. Frei dell’Ospedale Universitario di Basilea. 4.2 Terreni di coltura Terreno di coltura liquido: Thio (thioglicolato) (allegato 2) Terreno di coltura solido: Agar Sangue (allegato 3) Terreno di conservazione a ‐80°C: Skim Milk (allegato 4) Ogni campione è stato scongelato, coltivato in brodo Thio in camera anaerobica per 24 ore a 36°C ed inseminato su Agar Sangue in camera anaerobica per 24 ore a 36°C. Per l’ottenimento di una colonia pura si è ripiastrato su Agar Sangue. Ogni ceppo è stato poi ricongelato in Skim Milk a ‐80°C direttamente dal terreno Agar Sangue. 4.3 Estrazione del DNA Per l’estrazione del DNA è stato usato il kit InstaGene Matrix (Bio‐Rad, Svizzera) secondo la metodologia fornita. In breve, si lisano le cellule batteriche ottenute da una coltura pura su piastra Agar Sangue, si aggiunge una matrice che assorbe i resti della lisi batterica (membrana batterica, polisaccaridi, proteine) e che tramite centrifugazione li trascina sul fondo, lasciando il DNA purificato, in soluzione nel sovranatante. Metodica InstaGene Matrix • prendere un ansata sulla piastra e risospendere in 1 ml di acqua MilliQ (Millipore, NOIONAQUA Sagl, Svizzera) autoclavata, filtrata e sterilizzata. • Centrifugare per un minuto a 10’000‐12’000 rpm. Rimuovere il sovranatante. Prisca Cima TAB3/SSMT 9 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile •
Aggiungere 200 μl di InstaGene matrix nella provetta eppendorf e incubare a 56°C per un tempo che può variare tra i 15 e 30 minuti. • Vortexare ad alta velocità per 10 secondi. Mettere la provetta eppendorf a 100°C per 8 minuti. • Vortexare ad alta velocità per 10 secondi. Centrifugare a 10’000‐12'000 rpm per 2‐3 minuti. • Usare il necessario per la reazione PCR, il rimanente conservare a ‐20°C. In caso di un seguente uso scongelare l’estratto, vortexare ad alta velocità per 10 secondi e centrifugare a 10’000‐12'000 rpm per 2‐3 minuti. 4.4 PCR ribotyping 16S‐23S I cicli di amplificazione del DNA vengono effettuati con il thermal Cycler “Applied Biosystem VERITI Termal Cycler” (Applied Biosystems, USA). Il Master Mix (QIAGEN) (allegato 5) utilizzato contiene già tutto il necessario per la reazione PCR esclusi i primer (Mycrosinth) ed il DNA. Tabella 1 Volume per il mix di reazione PCR ribotyping [9] Mix di PCR per 1 campione Master Mix Primer 16S 10 μM Primer 23S 10 μM H2O RNAse free DNA 25 μl 1.5 μl 1.5 μl 17 μl 5 μl Tabella 2 Primer utilizzati nella reazione PCR ribotyping [9] 16S 5’‐GTG CGG CTG GAT CAC CTC CT‐3’ 23S 5’‐CCC TGC ACC CTT AAT AAC TTG ACC‐3’ Il programma con il cycler è composto da: 6 minuti a 94°C (ciclo di denaturazione iniziale), seguito da 35 cicli composti da: 1 minuto a 94°C (denaturazione), 1 minuto a 57°C (annealing) e 1 minuto a 72°C (elongazione), per finire un estensione finale a 72°C per 7 minuti [9]. 4.4.1 Migrazione in gel d’agarosio per PCR ribotyping Questo prodotto PCR, per ottenere un risultato ottimale, necessita di una migrazione su gel d’agarosio ad alta risoluzione (allegato 6) al 3%. Essendo un gel ad alta concentrazione e avendo bisogno una risoluzione molto elevata (bande ben visibili e ben separate), la preparazione del gel è molto importante. Per far in modo di mantenere la concentrazione del gel costante anche dopo aver sciolto l’agarosio ho seguito il seguente metodo [11]. • Pesare l’agarosio • Aggiungere la quantità necessaria di tampone TBE 1X (allegato 7), in seguito pesare (beuta, agarosio, tampone). • Aggiungere in eccesso il 10/20% del peso di acqua MilliQ (Millipore, NOIONAQUA Sagl, Svizzera). Prisca Cima TAB3/SSMT 10 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile •
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Far bollire tenendo controllato il punto in cui, tramite evaporazione, il peso torna equivalente a quello di partenza. Nel caso in cui il peso dovesse scendere al di sotto di quello iniziare, si può aggiustare aggiungendo acqua distillata bollente. Aggiungere 10 μl di GelRed (colorante) (allegato 8), per 100 ml di TBE. Versare il gel nello stampo. In questa migrazione vengono caricati due marcatori di taglia da 100 bp (allegato 9) il controllo negativo, il ceppo di riferimento (ribotipo 027) ed i campioni. Tabella 3 Volume da caricare su gel per elettroforesi Campioni e controlli Marcatore di taglia Campione/controllo 10 μl Loading buffer 6X (allegato 10) 4 μl Marcatore di taglia 100 bp 9 μl Nel primo e nell’ultimo pozzetto vengono caricati i marcatori di taglia, nei pozzetti centrali i campioni il controllo ed il ceppo di riferimento. Devono migrare per 3 ore a 25 V su di un gel al 3% di dimensioni 10 cm per 6 cm, tenendo il tampone raffreddato con del ghiaccio posto sotto la vaschetta elettroforetica. Si ottiene un profilo di ribotipo con più bande in quanto all’interno del genoma circolare del C. difficile le regioni 16S e 23S sono ripetute più volte, con uno spazio intergenico che varia in lunghezza da un operone all’altro. Primer 16S 16S Primer 23S 23S Spazio intergenico Figura 2 Rappresentazione schematica dell’operone contenente le regioni conservate 16S‐23S. Nella PCR ribotyping viene amplificato lo spazio intergenico variabile, utilizzando i primer 16S e 23S. Figura 3 Risultato PCR ribotyping. Nel primo e nell’ultimo pozzetto sono caricati i marcatori di taglia, nel secondo pozzetto si trova il controllo negativo, seguito dai campioni. Prisca Cima TAB3/SSMT 11 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile 4.5 Multiplex PCR tossine I cicli di amplificazione del DNA vengono effettuati con il thermal Cycler “Applied Biosystem VERITI Termal Cycler” (Applied Biosystems, USA). Il Multiplex Master Mix (QIAGEN) (allegato 5) contiene già tutto il necessario per la reazione PCR esclusi i primer (Mycrosinth) ed il DNA. Per i primer viene fatto un mix contenente i sei primer ad una concentrazione di 2 μM; 10 μl di ogni primer a 100 µM (tcdA‐R, tcdA‐F, tcdB‐R, tcdB‐F, tpi‐R, tpi‐F), e 440 μl di acqua RNAse free. I primer tcdA‐R tcdA‐F vanno a ricercare il gene che codifica per la produzione di tossina A, i primer tcdB‐R e tcdB‐F per la tossina B e i primer tpi‐R e tpi‐F si legano ad una regione costante presente in tutti i C. difficile, serve da conferma che il patogeno analizzato è effettivamente un C. difficile. Tabella 4 Volume per il mix di reazione per la multiplex PCR tossine [8] Multiplex Master Mix Mix dei primer (tcdA‐R, tcdA‐F, tcdB‐R, tcdB‐F, tpi‐R, tpi‐F) H2O RNAse free DNA Mix di PCR per 1 campione 25 μl 5 μl 15 μl 5 μl Tabella 5 Primer utilizzati nella reazione [8] TcdA‐R 5’‐GTA TCA GGC ATA AAG TAA TAT ACT TT‐3’ TcdA‐F 5’‐AGA TTC CTA TAT TTA CAT GAC AAT AT‐3’ TcdB‐R 5’‐ATC TTT AGT TAT AAC TTT GAC ATC TTT‐3’ TcdB‐F 5’‐GGA AAA GAG AAT GGT TTT ATT AA‐3’ Tpi‐R 5’‐CAT AAT ATT GGG TCT ATT CCT AC‐3’ Tpi‐F 5’‐AAA GAA GCT ACT AAG GGT ACA AA‐3’ Il programma del cycler è composto da: 15 minuti a 95°C seguito da 11 cicli dove la temperatura di annealing diminuisce di 1°C ogni ciclo, parte dai 65°C per terminare ai 55°C. Questi 11 cicli sono composti da: 30 secondi a 95°C (denaturazione), 30 secondi a 65‐55°C (annealing) e 30 secondi a 72°C (elongazione). A questi 11 cicli seguono altri 29 cicli composti da: 30 secondi a 95°C (denaturazione) 30 secondi a 55°C (annealing) e 30 secondi a 72°C (elongazione) ed un estensione finale a 72°C per 7 minuti [8]: 4.5.1 Migrazione in gel d’agarosio per multiplex PCR tossinotipo Per questo prodotto PCR viene fatta un’elettroforesi in gel d’agarosio LE (allegato 6) all’1,5% Viene preparato facendo sciogliere l’agarosio nel tampone TBE 1X facendolo bollire ed in seguito vengono aggiunti 10 μl di GelRed per 100 ml di TBE. Quando è solidificato nell’apposito supporto, vengono caricati i campioni. Prisca Cima TAB3/SSMT 12 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile Tabella 6 Volume da caricare su gel per elettroforesi Campione/controllo Loading buffer 6X Marcatore di taglia 100 bp Campioni e controlli 10 μl 4 μl Marcatore di taglia 9 μl Migrazione per 1 ora e 45 a 100 V su di un gel di dimensioni 10 cm per 15 cm. Dal risultato si può avere la conferma se si tratta effettivamente di un C. difficile, se è produttore di tossine e in tal caso di differenziarle. Di questo prodotto PCR si possono ottenere sei varianti, 1. non si tratta di un C. difficile (nessuna banda) 2. è un C. difficile ma non produce tossine (una banda a 230 bp) 3. C. difficile produttore di tossina A (una banda a 230 bp e una a 369 bp) 4. C. difficile produttore di tossina B (una banda a 230 bp e una a 160 bp) 5. C.difficle produttore di tossina binaria (una banda a 230 bp, una a 369 bp e una a 160 pb) 6. C. difficile produttore di tossina B con delezione del gene A (una banda a 230 bp, una a 160 bp e una a 110 bp 1.
Negativo 2. Non tossigenico 1 2 3 4 5 3. Tossina A e tossina B 4. Tossina A e tossina B 5. Tossina A deleta tossina B negativo
tcdA non deleto (369bp)
Tpi (230bp) tcdB (160bp) tcdA deleto (110bp)
Figura 4 Risultato elettroforesi PCR multiplex. [8] 4.6 Ricerca geni tossina A Questa PCR è stata fatta per verificare se i campioni nei quali ho ottenuto un profilo tossigenico solo B+ ha comunque il gene tcdA ma non è in grado di produrne la tossina. I cicli di amplificazione del DNA vengono effettuati con il Cycler “Appled Biosystem VERITI Termal Cycler”(Applied Biosystems, USA). Il Master Mix utilizzato contiene già tutto il necessario per la reazione PCR esclusi i primer ed il DNA. Prisca Cima TAB3/SSMT 13 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile Tabella 7 Volume per il mix di reazione per la ricerca del gene tcdA [12] Mix di PCR per 1 campione Master Mix (QIAGEN) Primer yt28 10 μM (Mycrosinth) Primer yt29 10 μM (Mycrosinth) H2O RNAse free DNA 25 μl 1.5 μl 1.5 μl 17 μl 5 μl Tabella 8 Primer utilizzati nella reazione [12] Yt28 5’‐GCA TGA TAA GGC AAC TTC AGT GG‐3’ Yt29 5’‐GAG TAA GTT CCT CCT GCT CCA TCA A ‐3’ Il programma del cycler è composto da una denaturazione iniziale da 94°C per 10 minuti, seguita da 35 cicli, ognuno composto da 50 secondi a 94°C per la denaturazione, 40 secondi a 54°C per l’annealing e 50 secondi a 72°C per l’elongazione, mentre l’estensione finale è di 10 minuti a 72°C. 4.6.1 Migrazione in gel d’agarosio per ricerca gene tossina A Per questo prodotto PCR viene fatta un’elettroforesi in gel d’agarosio LE all’1,5% Viene preparato facendo sciogliere l’agarosio nel tampone TBE 1X facendolo bollire ed in seguito vengono aggiunti 10 μl di GelRed per 100 ml di TBE. Quando è solidificato nell’apposito supporto, vengono caricati i campioni. Tabella 9 Volume da caricare su gel per elettroforesi Campioni e controlli Marcatore di taglia Campione/controllo 10 μl Loading buffer 6X 4 μl Marcatore di taglia 9 μl Viene fatto migrare a 100 V per 1 ora e 15 minuti su di un gel di dimensioni 10 cm per 15 cm. Se il campione analizzato possiede il gene tcdA, si ottiene una banda a 602 bp. 4.7 PCR 16S Dei 52 campioni che ho analizzato, alcuni tramite PCR multiplex non confermavano essere C. difficile, così è stata fatta una PCR 16S per verificare se il risultato della multiplex è stato negativo perché la concentrazione di DNA contenuta nell’estratto è troppo bassa oppure se si tratta di un altro battere. Per questa PCR vengono usati dei primer universali, i quali vanno a legarsi alla sequenza 16S in una regione costante e uguale in tutti i batteri, così da amplificare poi il contenuto della regione, che è diversa per ogni specie batterica. Prisca Cima TAB3/SSMT 14 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile OPERONE
5S 16S
23S Primer universale Sequenza conservata
Primer universale
Sequenza variabile
Sequenza conservata
Figura 5 Regione amplificata della regione conservata 16S Se la PCR 16S risulta positiva, con una banda a 1500‐1600bp, partendo dallo stesso materiale utilizzato per l’analisi del profilo tossigenico, si conferma il risultato negativo ottenuto con i primer per il gene specifico di C. difficile tpi e cioè che non si tratta effettivamente di un C.difficile. Al contrario se la PCR 16S risulta negativa significa che la concentrazione di DNA nell’estratto non è sufficiente. I cicli di amplificazione del DNA vengono effettuati con il Cycler “Applied Biosystem VERITI Termal Cycler” (Applied Biosystems, USA). Il Master Mix (QIAGEN) utilizzato contiene già tutto il necessario per la reazione PCR esclusi i primer (Mycrosinth) ed il DNA. Tabella 10 Volume per il mix di reazione per la PCR 16S Mix di PCR per 1 campione Master Mix Primer UniL 10 μM Primer UniR 10 μM H2O RNAse free DNA 25 μl 1.5 μl 1.5 μl 17 μl 5 μl Tabella 11 primer utilizzati per la reazione UniL UniR 5’‐AGA GTT TGA TCA TGG CTC A‐3’ 5’‐GTG TGA CGG GCG GTG TGT A ‐3’ Prisca Cima TAB3/SSMT 15 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile Il programma cycler è composto da una denaturazione iniziale a 95°C per 5 minuti, seguita da 35 cicli composti da 30 secondi a 94°C per la denaturazione, 30 secondi a 52°C per l’annealing e 1 minuto a 72°C per l’elongazione, con un estensione finale a 72°C per 7 minuti, alla fine dei cicli. 4.7.1 Migrazione in gel d’agarosio per PCR 16S Per questa migrazione è necessario un gel d’agarosio LE allo 0.8%, viene preparato facendo sciogliere l’agarosio LE (allegato 6) nel tampone TBE 1X facendolo bollire, quando l’agarosio è ben sciolto vengono aggiunti 10 μl di GelRed per 100 ml di TBE. Quando il gel è solidificato vengono aggiunti i campioni. Tabella 12 Volume da caricare su gel per elettroforesi Campioni e controlli Marcatore di taglia Campione/controllo 10 μl Loading buffer 6X 4 μl Marcatore di taglia 100 bp 9 μl Far migrare a 100 V per 25 minuti su di un gel di grandezza 6 cm per 4 cm. Il programma cycler è composto da una denaturazione iniziale a 94°C per 5 minuti, seguita da 35 cicli, ognuno composto da: 30 secondi a 94°C per la denaturazione, 30 secondi a 52°C per l’annealing e 60 secondi a 72°C l’elongazione. L’estensione finale viene effettuata a 72°C per 7 minuti. 4.8 Sequenziamento Per poter capire di che battere si tratta è stato necessario fare un sequenziamento. Il sequenziamento consiste nel stabilire la sequenza nucleotidica, in questo caso della regione 16S. Siccome ogni battere all’interno della regione 16S ha una sequenza specifica per la sua specie, eseguendo questa tecnica è possibile stabilire l’esatta specie batterica. Dopo la PCR 16S per poter proseguire con il sequenziamento è stato purificato l’amplificato, per eliminare i primer e i nucleotidi in eccesso. 4.8.1 Purificazione del prodotto PCR La purificazione viene fatta tramite il kit NucleoSpin Extract II (Macherey‐Nagel, Germania). •
•
•
•
•
Per purificare bisogna unire 100 μl di campione e 200 μl di Buffer NT, se i campioni sono inferiori a 100 μl aggiustare il volume con acqua distillata o Buffer NT. Mettere una colonnina NucleoSpin Extract II in una provetta da 2ml, depositarvi il campione e centrifugare 1 minuto a 11'000 g. Il DNA rimane legato sulla membrana. Aggiungere 600μl di Buffer NT3. Centrifugare per 1 minuto a 11'000 g. Per eliminare completamente il Buffer NT3, centrifugare per 2 minuti a 11'000 g. Cambiare la provetta e metterne una pulita, aggiungere 15‐50 μl di Elution Buffer NE, incubare a temperatura ambiente per 1 minuto e centrifugare 1 minuto a 11'000 g. Prisca Cima TAB3/SSMT 16 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile 4.8.2 Reazione di sequenza Partendo dagli amplificati purificati è stata fatta la reazione di sequenza. Tabella 13 Volume per mix di reazione di sequenza Mix per 1 campione BigDye Terminator (applied biosystem) (allegato 11) 3.0 μl Buffer BigDye 5x (allegato 11) 1.5 μl Primer UniL 1 μM 2.4 μl H2O RNAse free 7.1 μl Amplicon purificato 1 μl I campioni sono stati caricato sul cycler con una denaturazione iniziale a 96°C per 1 minuto, seguito da 25 cicli ognuno composto da: 10 secondi a 96°C per la denaturazione, 5 secondi a 50°C per l’annealing e 4 minuti a 60°C per l’elongazione. 4.8.3 Purificazione con Sephadex G‐50 Per poter proseguire con il sequenziamento è necessario purificare la reazione di sequenza per eliminare gli elementi in eccesso. Questa procedura è stata fatta utilizzando il Sephadex G‐50 (allegato 12). Il Sephadex è una matrice solida che viene sospesa in acqua per poter essere pipettata. Dopo centrifugazione si ottiene un disco che serve da filtro. • Mettere una colonnina in un epperndorf tube da 1.5 ml • Nella colonnina aggiungere 900 μl di Sephadex • Centrifugare 3 minuti a 770 g • Gettare l’acqua che si è depositata sul fondo dell’eppendrof • Pipettare 15‐20 μl di reazione di sequenza nella colonnina • Centrifugare per 3 minuti a 770 g • Nella eppendorf si ottiene il risultato della reazione di sequenza purificato 4.8.4 Sequenziamento Al prodotto reazione di sequenza sono stati aggiunti 10 μl di HI‐DI Formamide (evita l’evaporazione del campione) a 10 μl di reazione di sequenza purificata. Le provette di reazione sono state caricate sull’apparecchio ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) per determinarne la sequenza. Il risultato ottenuto dall’apparecchio è stato confrontato con la banca dati (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) per determinare la specie batterica. 4.9 MALDI‐TOF L’apparecchio utilizzato per l’analisi MALDI‐TOF, è il modello AXIMA confidence (Schimatzu biotech, Giappone). Per quest’analisi è necessario isolare una colonia batterica su Agar Sangue, la deposizione dei campioni deve avvenire dopo incubazione di 24 ore in camera anaerobica. Prisca Cima TAB3/SSMT 17 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile Questa colonia viene poi spottata su di un’apposita lama e aggiunto 0.5 μl di matrice DHB 2,5. (allegato 13) Questa lama viene posta nell’apparecchio il quale procede con l’analisi. 5. Risultati e discussione Dei 52 campioni analizzati ne sono stati presi in considerazione 46; 45 stipiti confermati ed un ceppo di riferimento (ribotipo 27) per la PCR ribotyping. (Allegato 1) 10 dei 52 campioni analizzati tramite multiplex PCR per il tossinotipo, non confermavano essere C. difficile. Per valutare se effettivamente si trattava di un altro battere, è stata fatta una PCR 16S seguita da sequenziamento. Tre campioni, dal sequenziamento risultavano essere C. difficile. Infatti facendo nuovamente una multiplex PCR tossinotipo è stato confermato il risultato. Gli altri sette campioni con il sequenziamento sono stati identificati come batteri non C. difficile, per questo motivo sono stati eliminati. Figura 6 ospedale di provenienza dei campioni utilizzati, si nota che l’ospedale OCL. I risultati ottenuti dalla PCR ribotyping sono stati analizzati con il programma informatico bioNumerics versione 5.1 (Applied maths, Belgio) e si è ottenuto un dendrogramma, che ha raggruppato i vari campioni basandosi sul numero di bande visibili dopo elettroforesi. I profili che il programma ha ritenuto identici sono stati raggruppati vicini, più si differenziano più sono posti lontani uno dall’altro sul dendrogramma. Al dendrogramma ottenuto dall’analisi della PCR ribotyping, ad ogni campione, è stato associata la data di raccolta del materiale, l’ospedale di provenienza e il tossinotipo ottenuto dalla multiplex PCR tossinotipo. Prisca Cima TAB3/SSMT 18 Campione
100
90
80
70
60
Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile 1
2
3
4
5
6
7
8
Data di raccolta Ospedale
Tossinotipo 40816
01.12.2008
OCL
A- DEL B+
43678
24.12.2008
OCL
A- DEL B+
43673
24.12.2008
OCL
A- B+
32187
23.09.2008
OBV
Non tossigenico
25303
30.07.2008
ACQ
A+ B+
25566
05.08.2008
ACQ
A+ B+
34379
10.10.2008
Studio medico
A+ B+
34366
06.10.2008
OCL
A- B+
43559
24.12.2008
ODL
A- B+
30246
08.09.2008
OCL
A- B+
39077
17.11.2008
Studio medico
A- B+
182
02.01.2009
ODL
A+ B+
36190
24.10.2008
Studio medico
A- B+
10727
28.03.2009
IOSI
A- B+
33825
06.10.2008
Studio medico
A- B+
44222
31.12.2008
OCL
Non tossigenico
39510
21.11.2008
Studio medico
A- B+
33506
06.10.2008
Studio medico
A- DEL B+
28683
25.08.2008
OCL
A+ B+
41349
0.12.2008
ACQ (Casa anziani) A+ B+
19673
12.06.2008
OSG
A+ B+
39043
14.11.2008
ACQ
A+ B+
39040
17.11.2008
OBV
A+ B+
43244
22.12.2008
ACQ
A+ B+
43114
19.12.2008
ACQ
A+ B+
37253
05.11.2008
OCL
A+ B+
44221
31.12.2008
OCL
A+ B+
38806
14.11.2008
OCL
A+ B+
39604
19.11.2008
ODL
A+ B+
33335
01.10.2008
OSG
A+ B+
34368
10.10.2008
OCL
A+ B+
34839
10.10.2008
OIL
A+ B+
35213
10.10.2008
OCL
A+ B+
PCR
ribotipo
027
14221
25.04.2008
ACQ
A+ B+
41488
08.12.2008
OCL
A+ B+
37814
05.11.2008
OSG
A+ B+
42514
15.12.2008
OCL
A+ B+
40069
26.11.2008
OCL
Non tossigenico
42958
17.12.2008
OCL
A+ B+
30669
12.09.2008
OCL
A+ B+
41754
08.12.2008
OCL
A+ B+
35
02.01.2009
OSG
A+ B+
35539
20.10.2008
OCL
A+ B+
43371
24.12.2008
Studio medico
A+ B+
41709
08.12.2008
OCL
A+ B+
Cluster 1
Cluster 2
Cluster 3
Figura 7 Dendrogramma ribotipo, basato sul numero delle bande, correlazione con ospedale di provenienza e tossinotipo. Prisca Cima TAB3/SSMT 19 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile I campioni sono stati analizzati tramite spettrometro di massa MALDI‐TOF per verificare se la disposizione del dendrogramma è paragonabile alla disposizione del tossinotipo. Campione Tossinotipo Figura 8 Dendrogramma MALDI‐TOF Prisca Cima TAB3/SSMT 20 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile Al giorno d’oggi, siccome ceppi sempre più virulenti di C. difficile si stanno diffondendo in tutto il mondo, è determinante poter stabilire la patogenicità del battere e sapere a che ceppo ci si trova di fronte. È soprattutto di fondamentale importanza capire tempestivamente se il patogeno riscontrato fa parte del ribotipo 027, al quale appartengono ceppi di C. difficile molto virulenti. Analizzando il dendrogramma ottenuto tramite programma bioNumerics (Applied Maths, Belgio), che confronta le bande ottenute dalla PCR ribotyping, si osserva che i ceppi analizzati sono stati suddivisi in 30 diversi ribotipi che abbiamo raggruppato in tre cluster (vedi figura 7). In letteratura sono stati descritti 116 ribotipi differenti [13]; tenendo conto del numero di ceppi analizzati in questo lavoro, si può affermare che il metodo è discriminante e che in Ticino circolano molti ribotipi differenti. L’analisi effettuata ha messo in evidenza 8 gruppi di stipiti che presentavano un profilo di PCR ribotyping identico (figura 7). Il gruppo 1 è composto da tre campioni che provengono dallo stesso paziente, il secondo ed il terzo campione sono stati prelevati lo stesso giorno, a 23 giorni di distanza dal primo. Possono esserci più motivi per i quali questo paziente ha avuto due infezioni di C.difficile a distanza di un mese: o il batterio ha sviluppato una resistenza all’antibiotico utilizzato per la prima infezione oppure le spore della prima infezione sono rimaste latenti all’interno dell’intestino, causando una seconda infezione. I profili di PCR ribotyping sono molto simili (il primo ed il secondo campione hanno profili identici). E’ quindi molto probabile che lo stipite causa della prima infezione non sia stato eradicato. Al secondo gruppo appartengono tre campioni. In questo caso si tratta di tre pazienti diversi, due ricoverati presso l’ospedale Civico di Lugano nello stesso reparto e periodo, ed uno all’Ospedale Distrettuale di Locarno. Al gruppo 3 appartengono tre campioni, provenienti tutti da medici e ospedali diversi, mentre al gruppo numero quattro appartengono due campioni che provengono da ospedali diversi. Del quinto gruppo fanno parte quattro campioni, due appartenenti allo stesso paziente. Tre di questi campioni provengono dall’ospedale di Acquarossa; questi campioni sono stati prelevati nel corso di un mese. Il gruppo sei è il raggruppamento più grande e comprende sette campioni, provenienti tutti da pazienti diversi. Il settimo campione di questo raggruppamento è stato trattato come appartenente a questo gruppo in quanto si differenzia per un'unica banda. Quattro di questi campioni provengono dall’ospedale Civico di Lugano, mentre i tre rimanenti provengono da altri nosocomi del Cantone Ticino. I campioni provenienti dall’OCL sono stati prelevati nel corso di due mesi e mezzo. Gli ultimi due gruppi, il 7 e l’8 sono composti da due campioni provenienti da pazienti ed ospedali diversi. Si può dunque affermare che all’interno dei nosocomi ticinesi si sono verificate due piccole epidemie da C.difficile, una all’ospedale di Acquarossa, e la seconda leggermente più estesa all’OCL. Le infezioni causate da ceppi con lo stesso ribotipo ripetute all’interno degli ospedali hanno toccato più reparti, questo indica la difficoltà a circoscrivere le piccole epidemie all’interno di un singolo reparto. Per poter risalire al motivo per il quale lo stesso ceppo è stato riscontrato in più reparti, bisognerebbe fare una ricostruzione del movimento dei pazienti e degli operatori sanitari all’interno dell’ospedale, ciò che esula dal contesto di questo lavoro. Prisca Cima TAB3/SSMT 21 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile E’ importante notare che il ribotipo che costituisce il sesto gruppo, oltre ad essere fonte di varie infezioni all’interno dell’OCL, è un profilo molto comune in tutto il cantone Ticino. Esso è stato infatti riscontrato almeno una volta in quasi tutti i nosocomi ticinesi. Siccome il ceppo di riferimento per il ribotipo 027risulta essere molto simile ai ceppi che formano i gruppi 5 e 6, è stata fatta nuovamente una PCR ribotyping e un elettroforesi, così da avere le identiche condizioni di preparazione dei campioni, e da poterli confrontare meglio. Questa procedura è stata ritenuta necessaria per escludere con piena sicurezza che nessuno dei campioni fosse di ribotipo 027. Figura 9 Gel di PCR ribotyping per confermare l’assenza di un ribotipo 027. Da sinistra: Marcatore di tagli, controllo negativo, ceppo di riferimento ribotipo 027 seguito dai campioni posti nelle vicinanze del ribotipo 027 sul dendrogramma della PCR ribotyping ( campioni da sinistr a destra: 14221, 35213, 34839, 34638, 33335,39604). Dalla foto si nota che nessuno dei campioni testati presenta lo stesso profilo di questo particolare ribotipo. Dopo aver ottenuto il dendrogramma, per ogni campione è stato aggiunto il risultato ottenuto dalla multiplex PCR tossinotipo, per verificare se vi fosse un’eventuale correlazione con il tossinotipo/ribotipo. Come atteso, poiché i campioni inviati all’Istituto provengono tutti da pazienti sintomatici, nella maggior parte dei ceppi entrambe le tossine sono state positive (A+B+), in numero elevato è stato riscontrato anche la positività solamente della tossina B (A‐B+). La combinazione A+B‐ è stata riscontrata solamente nel ribotipo 027, mentre la combinazione (Adeleto B+) è stata trovata in tre campioni. Anche tramite il profilo tossigenico è quindi possibile suddividere il dendrogramma in tre cluster che ricoprono le stesse suddivisioni principali del ribotipo. Nel primo cluster si raggruppano quattro campioni: il campione dall’Ospedale Beata Vergine che presenta un profilo con poche bande è risultato essere non tossigenico mentre gli altri tre presentano tutti un profilo tossigenico A‐B+. Nel secondo cluster, composto da 14 campioni, troviamo tutti i profili A‐B+, tranne alcune eccezioni, mentre nel terzo cluster troviamo tutti gli A+B+ tranne un campione non tossigenico. Si può quindi affermare che il profilo tossigenico è separato in modo netto e segue le separazioni ottenute dall’analisi dei ribotipi. Prisca Cima TAB3/SSMT 22 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile Il profilo tossigenico A‐B+ raggruppa ceppi particolarmente virulenti che si stanno diffondendo sempre più [14]. Anche nella collezione che abbiamo analizzato questo profilo è molto rappresentato. Per i campioni A‐B+ è stata fatta una PCR supplementare, per capire se questi ceppi hanno il gene per la tossina A o meno, tutti i campioni sono risultati avere il gene che codifica per la tossina A. Per il gene A esistono 28 tossinotipi diversi [14]. Alcuni di questi tossinotipi sono caratterizzati da delezioni, inserzioni, o siti di restrizione polimorfi all’interno della zona PaLoc, che fanno in modo che non vi sia la produzione della tossina A, malgrado il gene sia presente [14]. Siccome la PCR utilizzata per determinare il profilo tossigenico prende in considerazione un solo tipo di delezione nel gene tcdA (vedi figura 10) che corrisponde al tossinotipo A‐B+ più frequentemente ritrovato in Europa, si presume che gli altri campioni A‐B+ siano mutati in altre localizzazioni del gene che fanno in modo che la tossina non venga prodotta. Figura 10 Sito di amplificazione del gene tcdA. Se c’è la delezione all’interno del gene tcdA verrà amplificato un frammento di 110bp, se non c’è nessuna delezione il frammento amplificato è di 369bp [8]. Con la multiplex PCR tossine utilizzato è possibile risalire unicamente a questo tipo di delezione, ma ne esistono altre. Si ritiene inoltre che ceppi di tossinotipo A+B+ abbiano una capacità di resistenza agli antibiotici maggiore rispetto a ceppi A‐B+ [14]. Nel caso di pazienti dai quali sono stati isolati ceppi con ribotipo identico in diversi periodi di tempo, l’analisi del profilo tossigenico indicava il profilo A+B+, ciò che permette di ipotizzare che il trattamento antibiotico seguito da questi pazienti non abbia dato l’esito sperato forse grazie alla maggior resistenza dei Clostridi A+B+. Solamente in un caso un paziente è stato colpito da una reinfezione con un tossinotipo A‐B+. Da studi recenti sembrerebbe che alcuni ceppi A‐B+ siano riusciti a sviluppare una resistenza ad alcuni antibiotici come clindamicina, eritromicina, tetraciclina, ciprofloxacina, ofloxacina, levofloxacina, mixifloxacina e gatifloxacina [14]. Si può quindi affermare che anche questo batterio sta sviluppando delle pericolose e sempre più numerose resistenze agli antibiotici. Prisca Cima TAB3/SSMT 23 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile I ceppi del ribotipo 027 dovrebbero avere un profilo tossigenico A+B+ [15]. Dalle nostre analisi il ceppo utilizzato come referenza risulta essere di tipo A+B‐. Riteniamo che questo fenotipo sia frutto di una mutazione avvenuta nel ceppo utilizzato come riferimento per la PCR ribotyping. E’ d’altronde risaputo che il tossinotipo è soggetto a facili mutazioni [14]. Purtroppo non ci è stato possibile ottenere altri ceppi appartenenti al ribotipo 027. Per capire se in futuro sarà possibile identificare questo patogeno più rapidamente, si è voluto analizzare tutti i campioni tramite spettrometro di massa Maldi‐Tof. Dai profili ottenuti si è costruito un dendrogramma. Analizzando il dendrogramma ottenuto dallo spettrometro di massa si conta una suddivisione, anche in questo caso di 30 differenti ceppi di C.difficile. Essendo le tossine delle proteine, ci aspettavamo un raggruppamento dal Maldi‐Tof in funzione del profilo tossigenico. Questo non si è però verificato. Una separazione simile a quella ottenuta per il ribotipo si era già esclusa in quanto tramite spettrometro di massa vengono analizzate delle proteine; siccome con la PCR ribotyping vengono amplificati degli spazi intergenici, che non codificano per nessuna proteina, non ci si aspettava di avere una separazione paragonabile. L’ICM intende indagare ulteriormente questo risultato inserendo nell’analisi anche ceppi non tossigenici e caratterizzando meglio il gruppo di ceppi che comunque viene differenziato dagli altri nel dendrogramma MALDI‐TOF. Prisca Cima TAB3/SSMT 24 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile 6. Conclusioni Concludendo si può affermare che in Ticino non si è ancora diffuso il ribotipo 027. D’altra parte si è notata la presenza di un ribotipo molto comune e diffuso nei nostri ospedali che è stato il responsabile di una piccola epidemia all’ospedale OCL. I metodi utilizzati per la determinazione del ribotipo e del profilo tossigenico del C. difficile sono dei metodi molto validi, precisi e non estremamente laboriosi. Si può quindi pensare all’identificazione di questo patogeno tramite biologia molecolare anche nel laboratorio di routine. Attualmente si sta ancora lavorando sull’analisi MALDI‐TOF per capire se sarà possibile identificare il patogeno tramite spettrometria di massa, che rispetto alla biologia molecolare è un metodo ancora più rapido, riducendo ulteriormente i tempi di attesa per il risultato. In futuro sarebbe interessante poter testare i campioni per quanto riguarda le resistenze agli antibiotici in quanto sempre più frequentemente si riscontrano dei ceppi resistenti ad alcuni antibiotici [14]. Prisca Cima TAB3/SSMT 25 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile 7.Ringraziamenti Ringrazio tutti coloro che mi hanno aiutata nello svolgere il mio lavoro di diploma. Innanzitutto grazie al direttore dell’Istituto Cantonale di Microbiologia Dr.Orlando Pettrini per avermi permesso di svolgere il mio lavoro presso l’istituto. Ringrazio la Dr.ssa Antonella Demarta e la Tecnica in analisi biomediche AnnaPaola Caminada per avermi seguita e consigliata durante lo svolgimento del lavoro. Voglio inoltre ringraziare Dr.ssa Cinzia Benagli per il sostegno tecnico con lo spettrometro di massa MALDI‐TOF e alla Tecnica in analisi biomediche Nadia Ruggeri per i preziosi consigli. Ringrazio il direttore della Scuola Superiore Medico Tecnica di Locarno Andrea Boffini e i docenti Giovanni Togni e Claudio Naiaretti per i consigli metodologici. Inoltre un grazie va alle docenti Susan Gilbert, Sonja Marci e Daniela Marcacci. Grazie anche ai miei zii, Sonia e Giancarlo per aver creduto in me, e a Simon per il sostegno.
Prisca Cima TAB3/SSMT 26 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile 8. Bibliografia [1] Murray P., Baron E., Jorgensen J.H., Landry M.L., Pfraller M.A., Manual of clinical microbiology. 9th edition. Volume 1. [2] Sunenshine R.H., Clifford McDonald L. 2006. clostridium difficile‐associated disease: New challenges from an establisched pathogen. Cleveland clinic journal of medicine. 73: 187‐197 [3] Wu E. clostridium difficile as a nosocomial pathogen. 2007. power point http://bioinfo.bact.wisc.edu/Bact330/EW%20Clostridium%20difficile.ppt ultima visita 01.06.2009 [4] Terhes G., Urbàn E., Sóki J., Abdul Hamid K., Nagy E. 2004. Community‐Acquired Clostridium difficile Diarrea Caused by Binary Toxin, Toxin A, and Toxin B Gene‐Positive Isolates in Hungry. Journal of clinical microbiology. 42: 4316‐4318. [5] Runpnik M., Dupuy B., Fairweather N.F., Gerding N.D., Johnson S., Just I., Lyverly D.M., Popoff M.R., Rood J.I., Sonenshein A.L., Thelestam M., Wren B.W., Wilkins T.D., Eichel‐Streiber C. 2005. Revised nomenclature of Clostiridium difficile toxins and associated genes. Journal of Medical Microbiology. 54: 113‐117 [6] Dupuy B., Govind R., Antunes A., Matamouros S. 2008. Clostridium difficile toxin syntesis is negatively regulated by TcdC. Journal of Medical Microbiology. 57: 685‐689 [7] Killgore G., Thompson A., Johnson S., Brazier J., Kuijper E., Pepin J., Frost E.H., Savelkoul P., Nicholson B., van den Berg R.J., Kato H., Sambol S.P., Zukowski W., Woods C., Limbago B., Gerdin D.N., McDonald C. 2008. Comparison of Seven Techniques for Typing International Epidemic Strains of Clostridium difficile: Restriction Endonuclease Analysis, Pulsed‐Field Gel Electrophoresis, PCR‐Ribotyping, Multilocus Sequence Targeting, Multilocus Variable‐Number Tandem‐Repeat Analysis, Amplified Fragment Lenght Polymorphism, and Surface Layer Protein A Gene Sequence Typing. Journal of clinical microbiology. 46: 431‐437. [8] Lamee L., Dhalluin A., Testelin S., Mattrat M.‐A., Maillard K., Lemeland J.‐F., Pons J.‐L. 2004. Multiplex PCR Targeting tpi (Triose Phosfate Isomerase), tcdA (Toxin A), and tcdB (Toxin B) Genes for Toxigenic Culture of Clostridium Difficile. Journal of clinical Microbiology. 42: 5710‐5714. [9] Bidet P., Barbut F., Lalande V., Burghoffer B., Petit J.C. 1999. Development of a new PCR‐
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ospedale San Giovanni Bellinzona istituto oncologico Svizzera Italiana 29 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile 35539 41709 27 OCL 20.10.2008 A+B+ OCL 08.12.2008 A+B+ CEPPO DI RIFERIMENTO RIBOTIPO 027 9.2 Allegato 2 Thio‐ terreno liquido per la coltivazione di batteri 30 g 0.1 ml 1’000 ml Thioglycolate Medium Vitamina K1 1% Acqua demineralizzata 9.3 Allegato 3 Agar Sangue‐ terreno solido per la coltivazione di batteri 312 g 7600 ml 400 ml Columbia Agar Base (Oxoid) Acqua demineralizzata Sangue di montone (Mischler) 9.4 Allegato 4 Skim Milk‐ terreno per il mantenimento a lungo termine 10 g 70 ml 10 ml 20 ml Skim Milk BBL Acqua demineralizzata Calf serum (sigma) Glicerolo (Fluka) 9.5 Allegato 5 Taq PCR Master Mix 1000 units cat. No 201445 (QIAGEN) Taq DNA Polymerase QIAGEN PCR Buffer dNTPs Multiplex PCR Master Mix cat.No 206143 (QIAGEN) HotStarTaq DNA Polimerase Multiplex PCR buffer dNTP mix Prisca Cima TAB3/SSMT 30 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile 9.6 Allegato 6 Resophor agarose hight resolution (Eurobio) Agarose Low Electroendosmosis (Roche) 9.7 Allegato 7 TBE 1X 100 ml TBE 10X 900 ml Acqua MilliQ (Millipore, NOIONAQUA Sagl, Svizzera) TBE 10X (Tris‐borato) 108 g 55 g 40 ml Tris‐base (Fluka) Acido borico EDTA 0.5 M pH 8 9.8 Allegato 8 GelRed 10000x in acqua (Biotium, Brunschwig Schweiz) 9.9 Allegato 9 DNA molecular weigh marker XIV 100 base pair ladder (Roche, Svizzera) Solution in 10mM EDTA, pH8 Concentrazione 250 μg/ml Marcatore di taglia 100bp 36μl 54μl 18μl marker 100bp H20 RNAse free loading buffer 6X 9.10 Allegato 10 Loading buffer 6X 0.25% 0.25% 30% Blu di bromotimolo (Merck) Xylene cyanol glicerolo in acqua Prisca Cima TAB3/SSMT 31 Tipizzazione molecolare di Clostridium difficile 9.11 Allegato 11 BigDye terminatori v1.1 Cycle sequencing kit (Applied Biosystems) 9.12 Allegato 12 Sephadex G‐50 Sephadex G‐50 fine DNA grade (GE Healthcare) Acqua demineralizzata 9.13 Allegato 13 DHB. 98% 15 mg/333μl 333 μl 333 μl 0.3 μl Prisca Cima ALDRICH ethanol ACN H2O TFA TAB3/SSMT 32