PROTEINE RIBELLI…
(REBELS ARE WE...)
Un saluto e un augurio di
curiosità culturale sempre
viva…
Dr. Stefano Gestri
L.S. “Niccolò Copernico”
Prato, 04-10-2014
TABLE OF CONTENTS
Abstrac
Introduction
Proteins folding
Proteic misfolding
Amyloidoses
Fibrils characterization
Any question?
Polyphenols: sources, metabolism and activities
Fighting against the amyloidoses
Conclusions
Bibliography (and more)
Looking forward…
ABSTRACT (I)


Amyloidosis encompasses a large group of
diseases characterized by tissue deposition of
proteins generally assembled in antiparallel βstrands
Over 20 human proteic molecules, intact or
fragmented, have resulted amyloidogenic in vivo,
and connected with disorders such as
Alzheimer’s, Parkinson’s and type II diabetes
diseases. Amyloidoses are often divided into
neurodegenerative disorders, non-neuropathic
localized amyloidoses and systemic amyloidoses
ABSTRACT (II)
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

Polyphenols are nutraceuticals widely diffused in
the human diet, and used in the
phytopharmaceutical industry for their
antioxidant properties
According to their structure, they are divided in
phenolic acids, flavonoids, stilbenes, and lignans
Some of them are described as efficient in vitro
inhibitors of amyloid fibril formation; several
results suggest their possible future uses, in
nutraceutical or pharmaceutical forms, for
amyloidosis prevention or treatment
INTRODUCTION (I): THE BEGINNING



L'encefalopatia
spongiforme bovina
(BSE, ossia Bovine
Spongiform
Encephalopathy) fu
scoperta nel Regno Unito
nel 1986
Fa parte di un gruppo di
malattie denominate
encefalopatie spongiformi
trasmissibili (TSE)
S. Prusiner, Nobel per la
medicina per la sua
ricerca sui prioni, ha
mostrato legami tra BSE
e una variante della
malattia di CreutzfeldtJakob (vCJD) che
colpisce l’uomo
INTRODUCTION (I): CLINICAL DATA


Morbo di Alzheimer:
si stima che entro il
2050 a livello
mondiale ne sarà
affetta 1 persona su
85
Negli adolescenti
statunitensi il diabete
di tipo 2 viene ormai
diagnosticato con una
frequenza simile al
diabete di tipo 1…
PROTEINS FOLDING
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
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
Struttura primaria,
secondaria, terziaria e
quaternaria delle
proteine
Folding cotraduzionale o
(nella cellula eucariota)
dal reticolo
endoplasmatico
all’apparato di Golgi
Processo guidato dalle
proteine chaperonine
Foldone: 2 β-strand e 1
α-elica
Paradosso di Levinthal
(1968)
Misfolding o
aggregazione
PROTEIC MISFOLDING


Aggregazione amiloide delle
proteine: deposizione tissutale
di strutture proteiche
supramolecolari organizzate in
foglietti β. Il tutto si evolve
fino alla formazione di fibrille,
il cui asse risulta
perpendicolare ai filamenti β,
paralleli o antiparalleli. Si
parla di strutture cross β
Sono stati elaborati algoritmi
per il calcolo della propensione
ad aggregare di una qualsiasi
sequenza aminoacidica (per
ogni aminoacido si determina
Zagg, partendo dal contesto
molecolare dei 3 aminoacidi
precedenti e dei 3 successivi)
HISTORY



Il termine amiloide fu introdotto nel 1854 dal
medico tedesco Rudolph Virchow, che notò come
anomali corpi tissutali del cervello si colorassero
in blu pallido se trattati con iodio, e in violetto
dopo la successiva aggiunta di acido solforico, e
pensò si trattasse di cellulosa o amido. “Amido”
deriva dal latino “amylum”, che, traducendo il
termine greco “amylon”, indica un materiale “non
macinato”
Nel 1959 Friedereiche e Kekulè dimostrarono,
valutandone l’alto contenuto in azoto, che la
sostanza amiloide contiene proteine
In vivo gli aggregati amiloidi risultano costituiti
da proteine unite ad apprezzabili quantità di
glicidi
AMYLOID FIBRILS FORMATION
(ENERGY LANDSCAPE MODEL)
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


L’aggregazione sembra
richiedere delle condizioni di
parziale unfolding; può
addirittura coinvolgere
proteine o peptidi che nel loro
stato nativo sono unfolded
Spesso la fase d’accrescimento
esponenziale è preceduta da
una fase di latenza (lag phase)
Protofibrille: perline in catene
o anelli; 2-5 nm di diametro;
costituite da 2-6 monomeri
proteici
Protofilamenti: 2-6
superavvolti in ogni fibrilla; 25 nm di diametro; costituiti
dall’impilamento di uno o più
strand b
Fibrille: 7-13 nm di diametro;
lunghezza micrometrica
FIBRILS TOXICITY



I primi studi
sull’aggregazione
amiloide in vitro
risalgono al 1998
Gli aggregati solubili
(“inclusioni cellulari”, fino
alle protofibrille) sono
assai citotossici (forse
scompaginano i 3-8 mm
di fosfolipidi membranali,
con ingresso di calcio e
apoptosi)
Sono citotossiche anche
le fibrille mature (il
termine è usato per lo
più per strutture
extracellulari)
AGGREGATING PROTEINS AND RELATED
DISEASES



Amiloidosi umane (oltre
40):
• neurodegenerative
• localizzate nonneuropatiche
• sistemiche nonneuropatiche
Il diabete di tipo 2 è un
fattore di rischio per il
morbo di Alzheimer
(considerato “diabete di tipo
3”)
Alcuni antidiabetici
promuovono la neurogenesi
e riducono la
neuroinfiammazione
PROPERTIES OF THE AMYLOID AGGREGATES
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
Permettono di definire un
aggregato proteico “fibrilla
amiloide”, se copresenti: la
birifrangenza in verde dopo la
colorazione con Congo red
(CR), la morfologia fibrillare e
la predominanza di foglietti β
Le fibrille amiloidi sono state
studiate al microscopio
elettronico a trasmissione
(TEM, con potere risolutivo di
2 nm) negli anni ’50; sono
state usate anche la STEM, la
cryo-EM e l’AFM (microscopia
a forza atomica, nata nel
1986, utile per la
determinazione dello
spessore)
Informazioni sul diametro
delle varie particelle presenti
possono ottenersi anche dal
dynamic light scattering (DLS)
STUDYING AMYLOID AGGREGATES
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
Per la determinazione della
struttura secondaria delle fibrille
amiloidi la tecnica originariamente
usata è stata la diffrazione dei
raggi X
Hanno poi contribuito: risonanza
magnetica allo stato solido
(SSNMR) e spin labeling sitospecifico accoppiato alla risonanza
paramagnetica elettronica (SDSLEPR)
Meno costoso è risultato il
dicroismo circolare (CD) - segnale
a 216 nm
Con quantitativi di proteina
intorno al mg può essere
utilizzata la spettroscopia
infrarossa in trasformata di
Fourier (FTIR); fa risparmiare
campione la tecnica della
riflessione totale interna
attenuata (ATR)
SCREENING ON AMYLOID AGGREGATES


Test del Congo red
(CR) – segnale a
540 nm, descritto
oltre 50 anni fa
Dosaggio
fluorimetrico
tramite tioflavina T
(ThT) – segnale a
485 nm, in seguito
a red-shift
…TO BE CONTINUED
AGAINST AMYLOID AGGREGATION


Il termine
“nutraceutico” fu
coniato nel 1989 dal
medico Stephen
DeFelice
Talvolta si parla
anche di alimenti
funzionali
POLYPHENOLS: CLASSIFICATION

Acidi fenolici
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
Oltre 8000 in natura; metaboliti secondari di
piante, spesso con funzione difensiva
Classificazione chimica di J. B. Harborne
(anni ’80 del secolo scorso)
Oltre 4000 flavonoidi (pigmenti dei fiori),
talora glicosilati
Oltre 200 antocianine (flavonoidi rossovioletti)
Analisi per lo più con HPLC/DAD/MS
POLYPHENOLS: SOURCES AND
BIOAVAILABILITY
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
Principali fonti alimentari:
frutta e succhi di frutta,
ortaggi, tè, cioccolata,
vino rosso
1 g/die (2/3 di flavonoidi)
Le fibre, i metalli
bivalenti e le proteine ne
diminuiscono la
biodisponibilità
Antiossidanti quali le
vitamine C ed E possono
ridurne la degradazione
intestinale
POLYPHENOLS: METABOLISM
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CBG = Cytosolic beta-glucosidase (EC 3.2.1.21)
LPH = Lactase-phlorizin hydrolase (EC 3.2.1.108)
COMT = Catechol-O-methyltransferase (EC 2.1.1.6)
UDPGT = UDP glucoronosyl transferase (EC 2.4.1.17)
SULT = Phenol sulfotransferase (EC 2.8.2.1)


Il 75-99% dei polifenoli
ingeriti non si ritrova nelle
urine immodificato
I flavonoli e le antocianidine
possono essere assorbiti
glicosilati
Il ramnosio è staccato dalla αramnosidasi della microflora
del colon
Alcuni polifenoli possono
essere assorbiti per trasporto
attivo
Massime concentrazioni
ematiche dopo 1,5-5,5 h
Coniugazione con acido
glucuronico (soprattutto per
gli isoflavoni) nel reticolo
endoplasmatico
Emivite di alcune ore
Escrezione urinaria dei
polifenoli: 0,3-43%
POLYPHENOLS: BIOLOGICAL ACTIVITIES
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I polifenoli sono usati come
antiossidanti per preparati
farmaceutici e alimentari
(l’epicatechina gallato è la più
efficace)
L’ossidazione delle LDL sembra essere
un fenomeno aterogenetico (i radicali
liberi dell’ossigeno - ROS - sono in
grado di perossidare gli acidi grassi
polinsaturi); inoltre i polifenoli
inducono vasodilatazione
“Paradosso francese”
I polifenoli sono stati testati contro il
melanoma, i tumori della prostata e
del seno
I flavonoidi potrebbero essere
impiegati contro la resistenza multipla
alla chemioterapia dovuta al trasporto
attivo (vedi glicoproteina P) fuori dalla
cellula dei farmaci
Alcuni polifenoli sono antifungini
Antibatterici polifenolici sono noti da
oltre 30 anni
Alcuni polifenoli sono attivi contro
virus erpetici, influenzali,
dell’immunodeficienza
I polifenoli si possono legare a
proteine, glicidi, vitamine e minerali
POLYPHENOLS AND AMYLOIDOSES


Gli effetti neuroprotettivi
dei polifenoli non
sembrano dovuti al solo
potere antiossidante
I composti fenolici
sembrano inibire in vitro
la formazione di fibrille
amiloidi (inibizione poco
attiva, molto attiva,
selettiva; della nascita di
oligomeri, di
oligomeri/fibrille, di
fibrille) o destabilizzare le
fibrille stesse
CONCLUSIONS
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
I polifenoli sembrano dare
tossicità a lungo termine solo
quando rappresentano l’1-5%
dell’alimentazione
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
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Composti molto attivi come
inibitori dell’aggregazione
amiloide sono l’acido tannico e
l’acido rosmarinico fra gli acidi
fenolici, e l’epigallocatechina
gallato, la keracianina,
l’hinokiflavone e il cumestrolo fra i
flavonoidi
La coesistenza di più di una
struttura fenolica (con molteplici
possibilità di legami a idrogeno)
sembra essere un requisito
indispensabile
In particolare gli antociani, stabili
a livello gastrico, dove sono in
parte già assorbiti, e in grado di
attraversare la barriera
ematoencefalica, risultano assai
promettenti
A livello di estratti vegetali gli
effetti antiamiloidogeci sembrano
essere più pronti e amplificati
Il molecular modeling potrà
fornire un valido aiuto
nell’allestimento di screening
SOME REFERENCES…




Chiti F and Dobson CM, 2006. "Protein misfolding, functional amyloid, and
human disease". Annu. Rev. Biochem. 75(75): 333-66
Rivière C, Richard T, Vitrac X, Mérillon JM, Valls J and Monti JP, 2008. "New
polyphenols active on beta-amyloid aggregation". Bioorg. Med. Chem. Lett. 18(2):
828-31
Stefani M and Dobson CM, 2003. "Protein aggregation and aggregate toxicity:
new insights into protein folding, misfolding diseases and biological evolution". J.
Mol. Med. 81(11): 678-99
Vendruscolo M and Dobson CM, 2005. "Towards complete descriptions of the
free-energy landscapes of proteins". Philosophical transactions. Series A,
Mathematical, physical, and engineering sciences 363(1827): 433-50; discussion
450-2
FROM THE NETWORK

www.pubmed.org

www.expasy.org

www.lescienze.it
MISCELLANEA


Richler Mordecai La versione di
Barney - Adelphy
A spasso con Daisy
- di Bruce
Beresford
YOUR FUTURE, OUR
RESOURCE..
…e ad maiora!