Cosa sono e cosa servono
gli allergeni e gli epitopi
ricombinanti nella diagnosi di
allergia alimentare
Dott. Alberto Martelli
Melloni Pediatria Milano
Milano
1 Febbraio 2008
Variabilità degli estratti per prick e RAST
Estratti di fonti diverse, pur se definiti allo stesso modo
possono contenere miscele di proteine
qualitativamente e quantitativamente molto diverse tra
loro, il che ovviamente condiziona molto l’esito dei test
Grier TJ et al. Allergy Asthma Proc 2002;23:125-31.
Dolen WK. Ann Allergy Asthma Immunol 1995;75:81-2.
Come si ottengono gli allergeni?
L’estrazione e la purificazione
Gli allergeni possono essere proteine solubili e
glicoproteine. Le strategie utilizzate per la loro
purificazione sono le stesse di quelle adottate per la
purificazione delle proteine in generale.
Il primo passo consiste nell'estrarre dal materiale
grezzo la massima quantità di allergene, con la minima
degradazione o denaturazione possibile.
Scheurer S. Clin Exp Allergy 2006;36:1483-6.
Tecniche per identificazione dell’allergene
L'identificazione e la caratterizzazione degli allergeni
avviene per mezzo di tecniche immunochimiche,
biochimiche e di biologia molecolare. I metodi più
comunemente usati sono:
- la immunoelettroforesi migrazione elettroforetica con
Ab specifici
- la SDS - PAGE (sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis): peso molecolare
-l'isoelettrofocalizzazione (IEF), in associazione con
tecniche di immunoblotting: punto isoelettrico (è il valore
di pH al quale una molecola non reca alcuna carica
elettrica netta).
-Per alcune limitazioni di queste tecniche, spesso si
rende necessario l'impiego contemporaneo di più metodi
per poter giungere a risultati definitivi.
SDS page
Isoelettrofocalizzazione
Libraries di un DNA complementare
Il principio della clonazione molecolare è basato sulla
preparazione o l'isolamento del DNA che codifica il
polipeptide rilevante per inserirlo in un plasmide o in un
vettore batteriofagico, che può essere successivamente
utilizzato per infettare un microrganismo come
l'Escherichia coli.
Il plasmide o il batteriofago si moltiplicano all'interno
dell'Escherichia coli producendo colonie trasformate (nel
caso del plasmide) o placche (nel caso del batteriofago).
Braren I, et al. Clin Chem 2007;53:837-44.
284 aminoacidi del Pen a 1
Reese G, et al. Clin Exp Allergy 2006;36:517-24.
Analisi spettroscopica
Reese G, et al. Clin Exp Allergy 2006;36:517-24.
Cos’ è un epitopo?
L’epitopo, o determinante, é la
componente strutturale dell’allergene
responsabile dell’interazione specifica
con l’anticorpo IgE.
Gli epitopi lineari e conformazionali
Sampson HA. J Allergy Clin Immunol 2004;113:805-19.
Siero albumina bovina
Epitopi della siero albumina bovina
Restani P. Allergy 2004;59 Suppl 78:21-4
Come possiamo utilizzare queste
informazioni nella diagnostica ?
Diagnosi primaria di allergia alimentare
Precoce predizione della persistenza dell’allergia
alimentare
Predizione di reazione severa al Tpo
Determinazione delle cross-reattività
La tecnica dei microarray
Harwanegg C. et al. Clin Exp Allergy 2003;33:7-13.
Diagnosi di sensibilizzazione
Hiller R, et al. FASEB J. 2002;16:414-6.
Allergia alla carota
•
•
•
r Dau c 1.0104, r Dau c 1.0201 e r Dau c 4 erano
clonati attraverso E. Coli.
Erano valutati i sieri di 40 pazienti allergici alla
carota con challenge positivo
98% dei pazienti allergici alla carota erano positivi
ad almeno un ricombinante
98 % rDau c 1.0104
65% rDau c 1.0201
38% to rDau c 4
Ballmer-Weber BK. Clin Exp Allergy 2005; 35:970–8
I test con l’allergene naturale purificato
Allergeni
testati
Performance
del test
Sen (%;CI)
Spe
(%;CI)
CM SPT
97.91
(92.60-103.22)
76.00
(60.44-91.55)
sp IgE Ab
100
(100-100)
80
(65.42-94.57)
nBos d4
62.5
(44.49-80.50)
86
(73.35-98.64)
nBos d5
62.50
(33.50-70.65)
86
(85.34-102.65)
nBos d8
58.33
(40-76.66)
88
(76.16-99.83)
Fiocchi A. data on file
Precoce predizione della persistenza
dell’allergia alimentare
Sampson HA. J Allergy Clin Immunol 2004;113:805-19.
Ovomucoide ed epitopi lineari
• Ovomucoide è una proteina glicosilata composta
da 186 aminoacidi (Gal d 1.1, 1.2 e 1.3).
• I 3 domini dell’ovomucoide erano isolati e
valutati con sieri di pazienti allergici all’uovo.
• Una protratta allergia all’uovo è associata alla
presenza di significative quantità di IgE anti
epitopi lineari (sequenziali) mentre le forme a
rapida tolleranza erano associate ad IgE verso
epitopi conformazionali.
Cooke SK, et al. J Immunol 1997;159:2026-32.
Più lunga tolleranza all’uovo
se IgE per lineari
2/3 degli allergici all’uovo sono tolleranti nei primi 5 anni di
vita
- Si è valutato il legame delle IgE di bambini con allergia
all’uovo, transitoria o persistente, rispetto agli epitopi
conformazionali o sequenziali (lineari) di ovomucoide,
ovoalbumina, ovotransferrina.
-I bambini con protratta allergia all’uovo presentano IgE
elevate contro epitopi sequenziali dell’ovomucoide e
dell’ovoalbumina (P < 0.01).
-La presenza sierica di IgE diretti contro epitopi lineari
dell’ovomucoide dovrebbero essere usati come strumento
per identificare i casi a più lenta risoluzione.
Järvinen KM, et al. Allergy 2007;62:758-65.
IgE contro epitopi lineari dell’ovomucoide
Järvinen KM, et al. Allergy 2007;62:758-65.
Le IgE leganti peptidi per il latte vaccino
Beyer K, et al. J Allergy Clin Immunol 2005;116:704-5.
Cosa accade per i singoli peptidi?
Beyer K, et al. J Allergy Clin Immunol 2005;116:704-5.
Predizione di reazione severa al Tpo
MAL D 1= difensina (termolabile)
MAL D 2 = poco importante allergologicamente
MAL D 3 = Lipid Transfer Protein (termostabile)
MAL D 4 = bet v2= può dare SOA
La peluria della pesca è ricca di LTP
• Allergia a LTP comune nell’area mediterranea ma
assente nei Paesi nordici.
• Le pesche sono il principale agente sensibilizzante a
LTP
• Gli allergici a LTP della pesca spesso tollerano altre
Rosacee e sono cuti e RAST negativi alle loro LTP
• La peluria della pesca contiene elevate quantità di
LTP che esiste anche nella buccia
• La peluria della pesca induce la sensibilizzazione a
LTP
• La peluria viene eliminata durante il trattamento della
pesca mediterranea prima di andare a mercati lontani
• La rimozione sistematica della peluria diminuisce
l’allergenicità della pesca.
Asero R, et al. Allerg Immunol (Paris). 2006;38:118-21.
Predizione della cross-reattività:
le definizioni
Cross-sensibilizzazione: presenza di IgE che
reagiscono con proteine di origine differente
portatrici di epitopi simili od identici
Cross-reattività: reazione clinica ad agenti
diversi, alimentari e/o inalanti, dovuta a crosssensibilizzazione.
Brusic V. et al. Allergy 2003;58:1083–1092
Frequenza di BA in CMA
CMA
100%
BA
13-20%
Martelli A. et al. Ann Allergy Asthma Immunol 2002;89(6 Suppl 1):38-43.
La monosensibilizzazione é rara
Beyer K. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2003;3:189-97.
Probabilità di
reazione
ad alimenti
cross reattivi
Sicherer SH.
J Allergy Clin Immunol
2001;108:881-90
I limiti del test…
• Non è stata ancora segnalata la sensibilità e la
specificità del test per singola molecola
allergenica.
• Pochissimi lavori che esprimano la riproducibilità
del test.
• A seconda della fase solida che lega l’allergene
risultati possono essere differenti
• Difficile predizione della reazione clinica
• Pertanto impossibile per ora collocarlo nell’iter
diagnostico
A cosa servono?
Diagnosi primaria di allergia alimentare
-
Precoce predizione della persistenza
dell’allergia alimentare
+/ -
Predizione di reazione severa al Tpo
- /+
Determinazione delle cross-reattività
+
Cosa speriamo di aspettarci
• Una specifica identificazione delle molecole
allergeniche per il bambino allergico
• La riscrittura della storia naturale di alcune allergie
alimentari in base alle molecole allergeniche coinvolte.
• Lo studio di sottogruppi, per le singole allergie
alimentari, che potrebbero avere corrispondenza al test
di provocazione orale
• La possibilità di utilizzare un vaccino sub-linguale
specifico per desensibilizzare il bambino (esperienza in
Spagna dell’LTP nello studio EXPO)
• Informazioni ulteriori per le cross-reattività
• Sapere se c’è corrispondenza fra tipo di patologia
allergica espressa e la presenza di reattività a
particolari molecole allergeniche.
Sarà così lo scenario futuro?
Harwanegg C. et al. Clin Exp Allergy 2003;33:7-13.
Conclusioni
• Il test permette di acquisire informazioni sempre
più complete e dettagliate, ma anche di sempre
più difficile interpretazione.
• Tali esami devono essere considerati come test di
3° livello, da effettuarsi per approfondire la
diagnostica di particolari sottogruppi di bambini
già sottoposti ai test classici.
• Molta strada va percorsa per conoscere vantaggi
e limiti delle nuove tecnologie, definirne uso ed
abuso, e arrivare infine a tracciare adeguate
linee-guida per il loro impiego clinico.