Università degli Studi
“G. d’Annunzio”
Chieti - Pescara
La Proteomica nelle
Malattie Renali
Mario Bonomini
Cattedra e Clinica Nefrologica
Ospedale Clinicizzato
SS. Annunziata, Chieti
La proteomica è la Scienza Omica che studia il proteoma (insieme di
PROTEine espresse dal genOMA). Essa comprende una serie di tecniche
che permettono identificazione, quantificazione e caratterizzazione di un
set globale di proteine e peptidi presenti in un campione biologico.
L’approccio proteomico alla identificazione delle proteine non richiede
ipotesi a priori circa quali proteine possano essere presenti e permette la
simultanea analisi di tutte le proteine presenti anche in miscele
complesse.
L’analisi proteomica consente anche di evidenziare singole isoforme
proteiche e modificazioni proteiche post-traslazionali.
•Proteomic technologies are being used with
increasing frequency in the renal community.
•Proteomic studies are most directed at finding
markers of disease progression, diagnosis, or
responsiveness to therapy.
Ambiti di applicazione della
Proteomica in Nefrologia
•Fisio(pato)logia renale
•Nefropatie glomerulari
•CKD
•AKI
•Nefrolitiasi
•Uropatia ostruttiva
•Trapianto renale
•Emodialisi
•Dialisi peritoneale
•Tossicità uremica
•Tossicità farmacologica
L’analisi proteomica del tessuto renale può
essere impiegata per identificare quali proteine
sono presenti, per confrontare l’abbondanza
proteica tra zone tissutali o condizioni, e per
analizzare modificazioni post-traslazionali.
Database
Kidney
Glomerulus
2DGE-LC-Based Proteomics
2DGE-Based Proteomics
Proximal Tubule
Distal Tubule
Collecting Duct
Rat IMCD
Rat IMCD Phosphoprotein
Others
Transcriptomics & Proteomics
http://www.hkupp.org
NEJM 2009
2011
2013
3.0
3.0
non linear pH
non linear pH
10.0
10.0
Mappa urina soggetto normale
Cortesia G. Candiano, Ospedale Gaslini, Genova
Naturally Occurring Human Urinary Peptides
for Use in Diagnosis of Chronic Kidney Disease
Studio mediante elettroforesi capillare+spettrometria di
massa di campioni urine di 230 pazienti con CKD e 379
soggetti sani
Identificazione di 273 potenziali biomarcatori associati a
CKD e creazione di un modello di classificazione basato su
tali markers (frammenti di collagene, proteine ematiche,
proteine rene-specifiche)
Successiva validazione “in cieco” del modello in 110 pazienti
affetti da CKD
Peptide patterns distinguishing patients with CKD
Dimostrata superiorità
delHealthy
modello
vs. creatininemia
from
Controls
Good et al, Molecular & Cellular Proteomics, 2010
Source proteins and peptide distribution of CKD biomarkers
www.humanproteinpedia.org; accession number HuPA_00670
Urinary Proteomics in Diabetes and CKD
“A panel including 65 urinary biomarkers correctly identified
diabetic nephropathy from diabetes without compromized renal
function (97% sensitivity and specificity), and patients who
were microalbuminuric at sampling and progressed toward
overt diabetic nephropathy over 3 years.
….Many of the biomarkers were fragments of collagen type I, and
quantities were reduced in patients with diabetes or diabetic
nephropathy.
….Analysis of the urinary proteome may allow early detection of
diabetic nephropathy and may provide prognostic information.”
Rossing et al, JASN 2008
RILEVANZA FISIOPATOLOGICA DEI
BIOMARCATORI URINARI PROTEOMICI DI CKD
I frammenti del collagene urinari, riflettendo il fisiologico turnover
della matrice extracellulare, non sono semplici prodotti di
degradazione; essi possono essere indicativi di processi fisiopatologici
e fornire informazioni malattia-specifiche in un singolo test diagnostico
CKD
↓ degradazione matrice extracellulare
↑ fibre collagene insolubili
↑ matrice extracellulare e alterazioni strutturali
perdita di funzione e fibrosi
RILEVANZA FISIOPATOLOGICA DEI
BIOMARCATORI URINARI PROTEOMICI DI CKD
Alterazioni della matrice extracellulare riflesse attraverso il
proteoma urinario, possono rappresentare uno stadio precoce
nel processo patologico della CKD e antagonizzare il patologico
accumulo di matrice extracellulare può rappresentare un nuovo
valido approccio terapeutico.
Mullen et al, Curr Opin Nephrol Hypertens 2011
22 pazienti nefropatici con diabete tipo 2
Irbesartan 300 mg/die (n=11)
Basal
2 years
Placebo (n=11)
Basal
2 years
STUDI CLINICI IN CORSO CON STRATIFICAZIONE DEI PAZIENTI IN
BASE AD ANALISI DI PROTEOMICA URINARIA
Mischak H and Rossing P, Nephrol Dial Transplant 2010
Kidney International (2010) 78, 1252–1262
ICU TRAINING SET
• 30 pazienti ricoverati in ICU con FR normale, con raccolta
longitudinale di campioni urinari
• 16/30 successivo sviluppo di AKI (↑ creatininemia)
• Caratterizzazione e confronto del pattern peptidico urinario
(elettroforesi capillare+spettrometria di massa) dei pazienti con
AKI vs pazienti che hanno mantenuto FR normale
• Sensibilità 92%, specificità 90%
Validazione risultati ICU training set
ICU VALIDATION SET
• Studio di coorte di fase II, prospettico, in cieco
• 20 pazienti in ICU
• Il pattern peptidico urinario ha correttamente identificato 8/9
pazienti che hanno sviluppato AKI
ALLOGENEIC HEMATOPOIETIC STEM CELL
TRANSPLANTATION VALIDATION SET
• 31 pazienti con trapianto (quale differente eziologia di AKI)
• In 13 sviluppo di AKI (sensibilità pattern peptidico urinario 94%,
specificità 82)
Caratteristiche dei polipeptidi urinari inclusi nel pattern di marcatori AKI
Mass (Da)
CE time (min)
Protein
Remarks
a-1 antitrypsin
1439.66
29.82
912.54
20.06
2080.99
20.20
2356.16
19.52
2427.19
19.58
2540.28
19.68
2639.35
19.78
1081.66
20.73
1399.59
28.53
2603.30
20.07
2716.38
20.19
1654.79
23.13
1737.78
31.00
1250.55
27.93
3359.57
31.90
2942.30
22.23
2007.94
22.10
Collagen 1 a(III)
1825.78
19.41
Fibrinogen a chain
1882.80
20.14
2559.18
19.41
Albumin
Up
Regulation
b-2 Microglobulin
Collagen 1 a(I)
Down
Regulation
Efficacia diagnostica precoce del pattern AKI urinario
Diagnosis of subclinical and clinical acute T-cellmediated rejection in renal transplant patients by
urinary proteome analysis
 sviluppo di un modello di identificazione di rigetto acuto,
basato su 14 biomarcatori urinari
 validazione in cieco del modello: corretta diagnosi in 16/18
casi di rigetto subclinico e in 10/10 casi di rigetto clinico (gradi
Banff Ia/Ib)
Il modello è attualmente impiegato in
uno studio multicentrico di fase III in corso in Germania
Metzger et al, Proteomics Clin Appl 2011
Limitazioni ad un diffuso impiego clinico
della Proteomica in Nefrologia
•Carenza di protocolli condivisi su raccolta e
analisi campione biologico
•Studi di ridotte dimensioni campionarie
•Costi
•Necessità di personale tecnico specializzato
Iniziative volte a favorire l’applicabilità
clinica della Proteomica in Nefrologia
•Standardizzazione metodi di raccolta e
preparazione del campione biologico
•Disponibilità di ampi e aggiornati database
Database di Proteomica Urinaria Umana
Siwy et al, Proteomics Clin Appl 2011
Iniziative volte a favorire l’applicabilità
clinica della Proteomica in Nefrologia
•Standardizzazione metodi di raccolta
preparazione del campione biologico
•Disponibilità di ampi e aggiornati database
•Studi multicentrici di validazione
•Studi con più adeguati disegni e dimensioni
•Attività collaborative nazionali e internazionali
e
Gruppo di Studio SIN
Scienze Omiche
SOCIETÀ ITALIANA DI
PROTEOMICA
It-HPP Mithocondria
Initiative by the Italian Proteomics Association on a
Mitochondria Integrated Biology Program, on Chronic
Not Transmissible Diseases.
Approved by the Human Proteome Project Consortium
(September 2012)
International partner
ISNAFF (www.isnaff.org) for Canada and USA,
IFCC, cQQP commission, EU JPND,
SIN
SIRNA
Other National Societies
(ItPA GC, June 13th, 2012)
(Rome, Nov 2012)
In Nefrologia vi è stringente necessità di migliori markers
diagnostici e terapeutici.
La Proteomica ha dimostrato in ambito nefrologico capacità
di identificazione di nuovi set di biomarcatori, indicativi di
progressione, diagnosi o risposta al trattamento.
La traducibilità clinica degli studi di Proteomica, iniziale e
promettente (pur se a lento ritmo di crescita), presenta
alcune limitazioni che ne hanno precluso un’ampia diffusione.
Le migliorate tecnologie e le attività in corso lasciano
ragionevolmente ritenere un prossimo uso della Proteomica
nella pratica clinica, più diffuso ed efficace.