Strategie di miglioramento per …
GRC ad alto valore qualitativo
1.
Rigorosa selezione del donatore
2.
Uniformare i valori Hct delle unità raccolte
3.
Uniformare l’efficienza di separazione (centrifugazione)
4.
Verificare e migliorare l’efficienza della leucodeplezione …
(la rimozione di 3-5 log permette la riduzione dell’emolisi < 0,2%)
5.
Evitare la rimozione del buffy coat (ricca di reticolociti)
6.
Migliorare gli attuali sistemi di conservazione
7.
Trasfondere sangue fresco (short storage)
8.
Eliminare il removal-prone RBCs
Heaton, TR 2009
8) Removal-prone RBCs
•
•
•
•
Frazione (circa 30%) di GRC trasfusi che vengono rimossi entro 24h dal
sistema reticolo endoteliale del ricevente
Principale responsabile degli effetti collaterali (nei politrasfusi!)

accumulo marziale

stato infiammatorio (adesione GRC all’endotelio)

reazioni immuni (allo e auto anticorpi)
Riducibile mediante l’impiego di nuove soluzioni conservanti !??
Rimuovibile !??
Luten, TR 2008
Reverberi … work in progress 2011
Gerociti (senescent erythrocytes)
• in vivo: i gerociti vengono
individuati dagli anticorpi
(autologhi) prodotti verso
antigeni di scenescenza prodotti
a seguito delle modificazioni del
dominio banda 3 (Naturally
occuring antibodies = Nabs)
• in vitro: le stesse modificazioni
intervengono negli eritrociti
durante la conservazione
Bosman, TM 2008
Proteomica
•
Applicazioni della proteomica
– allo studio delle lesioni da
conservazione dei GRC
–
–
–
•
Responsabile: Lello Zolla
Collaboratori: Anna Maria Timperio, Sara Rinalducci, Gian
Maria D’Amici, Angelo D’Alessandro, Federica Gevi
Convenzionato con il Centro Nazionale Sangue
studio dei fenomeni di stress ossidativo subiti dalle
proteine della membrana eritrocitaria durante lo
stoccaggio di emazie leucodeplete risospese in
soluzioni additive.
Conservare i GRC in atmosfera di gas inerti a
saturazione di O2 < 4%
… fino a 9 settimane!!
6) Sistemi di conservazione
•
•
•
•
•
SAGM (ipertonico = 376 mOsm/L)
PAGGS (isotonico = 285 mOsm/L)
AS-1 = Adsol (ridotto contenuto di mannitolo … rispetto al SAGM)
AS-3 = Nutricel (ricco in fosfato e citrato, ma privo di mannitolo)
AS-5 = Optisol (composizione simile al SAGM)
• RAS-2 = ErythroSol (autorizzato in Europa, con ½ dose CPD)
• EAS-64/76 = Experimental Additive Solution (arricchito di
bicarbonati) (Hess, TR 2000/03)
• AS in maggior volume (e con un miglior sistema tampone)
(Hamasaki, VS 2000)
• Washing! (Meryman, VS 1991)
4) Leucodeplezione
•
Dalla lisi dei globuli bianchi vengono liberati enzimi (glicosidasi, lipasi e
proteasi) che attaccano la membrana eritrocitaria determinando:
– rimozione della componente glucidica (immunoprotettiva)
– dealchilazione dei lipidi
– clivaggio delle proteine
Rimuovendo i leucociti si migliora la vitalità dei globuli rossi e si riduce
l’emolisi!!
Hess, J Pr 2010
2) Standardizzare le caratteristiche delle unità raccolte
• Contenuto di Hb … sempre diverso per:
– Il diverso valore per ogni singolo donatore
– Le diverse lavorazioni post-raccolta (leucodeplezione, rimozione BC)
– Il tempo di conservazione diverso (al momento dell’utilizzo)
Contenuto di Hb in unità GRC (in AS) private di buffy coat
Contenuto di Hb in unità GRC (in AS) private di
buffy coat e leucodeplete
Högman and Meryman, TR 2006
GRC da aferesi: quantità
1. GRC da aferesi
2. GRC da sangue intero
40%
Percent of Products
Percent of Products
40%
30%
20%
10%
20%
10%
0%
0%
1.
30%
140 160 180 200 220 240
140 160 180 200 220 240
Absolute RBC (ml)
Absolute RBC (ml)
Improved red blood cell products: collection by apheresis. Smith JW, Axelrod
FP, Ness PM. AABB Abstract #S263, 1995. [n = 1,612]
2. Haemonetics' internal study, 1994. [n = 352].
GRC da aferesi: qualità (I)
Parametri
(range)
GRC da aferesi
GRC da sangue intero
(leucodepleti)
Contenuto medio di
Hb / unità
58.1 g (53 – 61.2 g)
59.6 g (45.2 – 76.6 g)
Ematocrito medio
62% (61-65%)
58% (50-76%)
Volume medio
dell’unità
269 mL (249-282)
302.7 mL (258-349)
Harrison, TM 2006
GRC da aferesi: qualità (II)
GRC da aferesi
giorno
GRC da sangue intero
3
21
42
3
21
42
Hb libera
(mg/dl)
91
25  9
43  15
14  3.8
42  17.2
112  56
K+
(mmol/l)
2.24  0.35
33.4  2.34
46.6  3.28
5.13  0.4
34  3.5
54.6  5.8
7.2  0.2
6.8  0.04
6.6  0.1
6.9  0.07
6.6  0.03
6.5  0.04
pH
Valori espressi come media e deviazione standard
Leitner, JCA 2003
Doppia raccolta GRC in aferesi
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Procedura completamente automatica
Validata per unità di raccolta fisse e mobili
Prodotto raccolto con contenuto Hb programmabile
Standardizzazione della raccolta
Garanzia di integrità dei GRC
Anticoagulazione costante
Filtrazione in linea
Risospensione in sol additiva
Ottimale sottrazione plasma
Ben tollerata dal donatore
Reazioni alla donazione
Procedure
n
Pallore
Nausea
Vomito
Sincope
Convulsioni
Cefalea
Tossicità da
citrato
26.290
1:111
1:1.000
1:588
1:2.941
1:4.348
0
Piastrinoaferesi
4.150
1:147
0
1:4.000
1:4.000
0
1:4.000
Plasmaferesi
42.185
1:55
1:10.000
1:769
1:4.166
0
0
2GRC
aferesi
1.683
1:52
0
0
0
0
0
Sangue
intero
Jaster, HAG/DGTI 2005
Ragioni della buona tolleranza
alla donazione di 2GRC in aferesi
• Il tempo di donazione (30 min) porta ad un buon equilibrio volemico
• Il rimpiazzo con soluzione salina comporta isovolemia
• La stringente selezione porta alla donazione soggetti in condizioni
ottimali
• Non sono evidenti differenze
–
–
di pressione / frequenza cardiaca
nei tempi di recupero di Hb / Hct
nei donatori di 2GRC in aferesi vs donatori di 1GRC in aferesi …
Doppia raccolta GRC in aferesi
vantaggi per il paziente
•
Riduce l’esposizione antigenica
•
Riduce l’effetto immunomodulante
•
Migliora il controllo del dosaggio terapeutico
•
Riduce (nelle prime fasi) i danni da conservazione
• Trattamenti post-storage:
– Leucodeplezione
– Irraggiamento
– Inattivazione
– Quarantena
• Solo per PFC
Leucodeplezione
E’ in grado di ridurre:
 reazioni trasfusionali febbrili non emolitiche
 refrattarietà alle trasfusioni piastriniche
 trasmissione virus leucotropi
Se eseguita pre-storage … elimina anche l’accumulo
in sacca delle citochine (molecole in grado di
innescare reazioni infiammatorie acute)
Ridurre le esposizioni
 Contenere il numero dei donatori a
cui esporre il paziente … se necessita di
più emocomponenti
 trova la sua principale applicazione in
campo pediatrico
 nuove opportunità dalla
multicomponent collection
Sistemi di conservazione
(nuovi approcci)
Una maggior durata della conservazione dei
globuli rossi migliora la logistica della
distribuzione
 CPD = 21 gg ( 3 sett)
 CPDA = 35 gg ( 5 sett)
 SAG-M = 42 gg ( 6 sett)
 NUOVI = 77 gg ( da 11 a 12 sett)
Sistemi di conservazione
(cosa viene migliorato)
 si riduce il fenomeno della vescicolazione della
membrana dei GR
 si preserva il consumo di ATP in relazione alla
deformazione dei GR
 si riduce la formazione di mediatori proinfiammatori derivanti dalla frammentazione della
membrana dei GR, responsabili di NHTR (reazioni
trasfusionali non emolitiche) e TRALI (insufficienza
respiratoria acuta post trasfusionale).
Inattivazione dei patogeni
• All’inizio degli anni ’80 la quasi totalità dei pazienti che
impiegavano i concentrati dei fattori della coagulazione –
ottenuti da pool di plasma umano – si infettavano con gli
agenti virali (HBV / nAnBV) causa di devastanti sindromi
epatiche … da cui i primi tentativi di inattivazione virale …
• Con l’avvento dell’epidemia HIV le tecniche di inattivazione
virale vennero applicate sistematicamente …
• In questi ultimi anni le tecniche di inattivazione dei
patogeni hanno raggiunto un elevato grado di sicurezza, di
pari passo con i nuovi esami di validazione biologica
AGENTI PATOGENI
•
VIRUS
–
–
–
–
–
–
•
BATTERI
–
–
–
–
–
–
–
–
•
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS
BACILLUS CEREUS
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
PSEUDOMONAS FLUORESCENS E AERUGINOSA
KLEBSIELLA PNEUMONIAE
SERRATIA MARCESCENS E LIQUEFACIENS
CLOSTRIDIUM PERFRIGENS
PROPIONIBACTERIUM ACNES
PROTOZOI
–
–
–
•
ARBOVIRUS
HERPESVIRUS
RETROVIRUS
VIRUS EPATITICI
FILOVIRUS
PARVOVIRUS
PLASMODIUM
BABESIA MICROTI
TRYPANOSOMA CRUZI
PRIONI
Esami di Validazione Biologica (VB)
• Agenti patogeni in grado di essere trasmessi
attraverso emocomponenti ed emoderivati
• oggetto di esami di VB (HIV 1 e 2, HBV, HCV, Treponema)
• non oggetto di esami di VB (Arbovirus, Parvovirus B19, HAV,
HFV, HGV, HEV, EBV, HHV8, TTV, CMV, Batteri, Protozoi .. in
particolare Leishmania, Trypanosoma, Babesia microti,
Tricomonas, Plasmodio, Toxoplasma, Pneumocystis)
• Ancora oggetto di verifica CJD e SARS (Coronavirus)
Evoluzione esami di validazione biologica
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Anni ’70
1982
1985
1990
1991
1994
1995
2001
2002
2006/2008
2009
VDRL (test non treponemico) e HBsAg
Enzima epatico (ALT)
EIA HIV 1a g.ne
EIA HCV 1a g.ne/ EIA HIV 2a g.ne
EIA HCV 2a g.ne
EIA HIV / HCV 3a g.ne
VDRL + TPHA (test treponemico) / EIA HIV 4a g.ne
EIA Sifilide (Ac IgM e IgG)
NAT HCV
NAT HIV/HBV e chemiluminescenza Sifilide
NAT WNV
Infezione HIV: periodo “finestra” con test sierologici e molecolari
HIV-RNA (plasma)
Ag p24
EIA 4° generazione
EIA 3° generazione
EIA 2° generazione
EIA 1° generazione
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Giorni dopo l'esposizione
B. Weber, Exp Rev Mol Diagn 2006; 63 (3): 399-411
Infezioni trasmissibili: il periodo “finestra”
S.H. Kleinman , Transfusion 2009; 49: 2454-2489
Rischio residuo (n/106) di trasmissione di …
in Italia nel 2009
• HBV
1,6 (0,6 – 2,1)
• HCV
0,1 (0,1 -0,2)
• HIV
0,7 (0,6 – 2,1)
Italian Society of Transfusion Medicine and Immunohaematology – R & D – Dr C. Velati
Italian Group for the Study of Transfusion Transmissible Diseases
Agosto 2007
Patogeni emergenti
4 protozoi del genere Plasmodium … Malaria
Protozoi del genere Leishmania … Leishmaniosi
Protozoo specie Trypanosoma cruzi … Malattia di Chagas
Malaria
Malattia di Chagas
Leishmaniosi