Biotecnologie vegetali per
l’industria e l’ambiente
Biochimica classica - atto I
Il Cavallo Rosso
E. Corti (Ed. ARES)
Come manipolare
il metabolismo?
È necessaria la comprensione
del sistema metabolico e di
come venga modulato il flusso
Metà corso dedicato alla
comprensione dei sistemi
multienzimatici
Metà corso a discutere degli
interventi di ingegneria
metabolica
Il metabolismo: questo sconosciuto
Un centinaio di anni di studio
degli enzimi e dei metaboliti
ci ha permesso di costruire
accurate mappe metaboliche:
E. Buchner: cell-free fermentation
"Alcoholic Fermentation Without
Yeast Cells". (1897) Ber. Dt.
Chem. Ges. 30: 117–124.
http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1907/buchner-lecture.pdf
E’ possibile descrivere il metabolismo a partire dalle proprietà
(studiate di solito in vitro) dei suoi componenti?
vie metaboliche
Flux is phenotype!
enzimologia
(H. Kacser)
Teoria generale capace di predire i flussi?
Breve ripasso di enzimologia
Colmate le lacune con attenzione (ad
es. Voet & Voet, Biochemistry)
Cinetica di MM
irreversibile
E + S = ES  E + P
Vm  S
v
KM  S
Derivazione della formula reperibile su tutti i testi (decenti) di biochimica.
Formula e curva sono la stessa cosa detta in due modi diversi!!!
Curva v/S
Significato di KM e Vm; unità di misura
Molte rappresentazioni della cinetica sono sballate
Quando v raggiunge
Vmax?
A [S] infinito, cioè mai!
http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/asympt.htm
Linearizzazione
1 1 KM
1
 

v S Vm Vm
y=0
x=0
Esistono tipi diversi di linearizzazione (vedi Voet e Voet o Fell)
Inibizione competitiva
Vm  S
v
I
K M  (1  )  S
Ki
es. Succinato deidrogenasi:
fumarato (S) e malonato (I)
E + S = ES  E + P
+
I
 Ki
EI + S = EIS  no reaction
Il valore di Km viene aumentato: KMapp = KM(1+I/Ki)= KMα
L’inibizione si annulla aumentando la concentrazione del substrato
Che faccià avrà la linearizzazione in presenza di inibitore?
COO
CH2
OOC
H
succinate dehydrogenase
CH2
H
COO
COO
Fumarate
Succinate
COO
CH2
COO
Malonate
succinate dehydrogenase
No reaction
Inibizione incompetitiva
Vm  S
v
K M  S  '
E + S = ES  E + P
+
I
 Ki
es. EPSP sintasi (con glifosate)
EIS  no reaction
Il valore di Vm viene diminuito: Vmapp= Vm/(1+I/Ki)= Vm/α’
L’inibizione, inefficace a basse [S], non si annulla ad alte [S]
Che faccià avrà la linearizzazione in presenza di inibitore?
Fosfoenolpiruvato
(PEP)
COO
-
CH2
-2 O PO
3
-2
COO
COO
-
CH2
EPSP sintasi
O 3 PO
Reazione della EPSP sintasi e sua
inibizione da parte del glifosate
-2
OH
OH
O3 PO
O
COO
-
OH
3-enolpiruvil-3-shikimato
-fostato (EPSP)
Shikimato-3-fosfato
Glifosate
-
OOC
NH
PO3
2-
Nonostante assomigli molto a parte dello shikimato, il
glifosate è un inibitore competitivo del PEP.
La reazione è sequenziale, con lo shikimato che entra
per primo, per cui il glifosate risulta essere un inibitore
incompetitivo di questo primo substrato.
Questo causa l’accumulo di Shikimato e la riduzione in
Arogenato (che è un inibitore della DHAP sintasi che
quindi esacerba l’accumulo di Shikimato) (vedi note)
http://plantandsoil.unl.edu/Image/siteImages/ShikimatePathway.gif
Inibizione mista
Vm  S
v
K M   S  '
E + S = ES  E + P
+
+
I
I
Ki 
EI
 K’i
EIS  no reaction
Sia Vm che Km cambiano: Vmapp = Vm/α′ e KM′ = α KM/α′
L’inibizione si sente sia a bassa che ad alta concentrazione di S
Che faccia avrà la linearizzazione in presenza di inibitore?
Le inibizioni dal punto di vista grafico
Equazione MM reversibile
Per una dimostrazione elegante:
http://www.bioinformaticsservices.com/bis/resources/cybertext/chapter6.html
v
(V f  S / K S )  (Vr  P / K P )
1 S / KS  P / KP
Due conseguenze importanti:
La v della reazione reversibile sarà minore
di quella irreversibile per due motivi:
La presenza di prodotto rende più piccolo il numeratore
La presenza di prodotto rende più grande il denominatore
La relazione di Haldane
All’equilibrio v = 0 per cui il numeratore sarà = 0
(V f  S / K S )  (Vr  P / K P )  0
(V f  S / K S )  (Vr  P / K P )
Vf  KP
Vr  K S
P eq

S eq
= Keq
Le costanti cinetiche non sono indipendenti!
Ricordatevi che il valore della Keq è
indipendente dalla presenza dell’enzima
Una formulazione alternativa dell’equazione si ottiene
sfruttando la relazione di Haldane (sostituisco Vr)
Vr 
Vf  KP
K eq  K S
Vf
( S  P / K eq )
KS
v
1  S / KS  P / KP
Quando la Keq >>1
(cioè una reazione molto
spostata verso i prodotti)
(o meglio P/Keq<< S)
Vf
(S 
P / K eq )
)A
KS
v
1 S / KS  P / KP
L’effetto di P si fa sentire solo sul denominatore
(si parla di inibizione da prodotto)
Inoltre se [P]/KP è bassa ( 0 o comunque <<1)
Vf
( S  P / K eq )
KS
v
1  S / KS  P / KP
Che altro non è se non l’equazione
per la reazione irreveversibile
Importantissimo
L’equazione di MM irreversibile non descrive il
comportamento in vivo perché la maggior parte degli enzimi
catalizzano reazioni reversibili.
Quella reversibile è cruciale per descrivere i sistemi reali
Inoltre la maggior parte delle reazioni enzimatiche
hanno più di un substrato o di un prodotto per cui
si richiedono equazioni più complesse.
Enzimi a più substrati/prodotti
A+B  C+ D
Vm  A  B
v
K iA  K B  K B  A  K A  B  A  B
Classificati secondo il meccanismo:
*Random order
* Compulsory order
* Ping Pong
Sequenziali
Equaz.
generale
(irrev.)
http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/transkinetics/ATCasekin.jpg
Enzimi allosterici:
Molti enzimi non hanno curve iperboliche,
ma sigmoidi, per cui sono stati introdotte
teorie per spiegare questi comportamente
(Hill, MWC e Koshland)
v =Vm*(x*(1+x)n-1+L*c*x*(1+c*x)n-1)/((1+x)n + L*(1+c*x)n)
[MWC model]
Andate a rivederli sul testo di biochimica !
atto II
(ovverosia la termodinamica)
Dopo le nozioni essenziali di enzimologia,
ripassiamo alcuni concetti di termodinamica che
sono rilevanti per le vie metaboliche
Si raggiunge sempre uno stato stazionario (ss)?
Che conseguenze avrebbe non raggiungere uno ss…
La presenza di un flusso in una via metabolica
cosa implica dal punto di vista termodinamico?
G = G°' + RT lnQ
All’eq. G= 0 e
Un G
≠ 0 (<0)
Q = quoziente di reaz.
G°' = –RT lnKeq
G°' = –RT lnKeq = –2.3RT Log10(Keq)
G°' è la variazione di energia libera in condizioni standard
Ordine di grandezza
Da Lehninger
ATP + H2O  ADP + Pi
Go' = -31 kJoules/mol
Pi + glucose  glucose-6-P + H2O Go' = +14 kJoules/mol
Values of Go and Keq for common reactions at 25oC
Reaction
Go(KJ/mol)
Keq
SO3(g)
2 SO2(g) + O2(g)
141.7
1.4 x 10-25
H2O(l)
H+(aq) + OH-(aq)
79.9
1.0 x 10-14
AgCl(s) + H2O
Ag+(aq) + Cl-(aq)
55.6
1.8 x 10-10
H+(aq) + OAc-(aq)
27.1
1.8 x 10-5
N2(g) + 3 H2(g)
2 NH3(g)
-32.9
5.8 x 105
HCl(aq) + H2O
H+(aq) + Cl-(aq)
-34.2
1 x 106
Cu(NH3)42+(aq)
-76.0
2.1 x 1013
Zn2+(aq) + Cu(s)
-211.8
1.4 x 1037
HOAc(aq) + H2O
Cu2+(aq) + 4 NH3(aq)
Zn(s) + Cu2+(aq)
R = 8.314472[15] J · K-1 · mol-1
Go (kJ/mol)
Quoziente di reazione e Keq
G = G°' + RT lnQ = –RT lnKeq+ RT lnQ =
= RT ln(Q/Keq) = RT ln ρ
(con ρ Disequilibrium ratio)
ρ  Q
K eq
Che valori assume ρ? Ovviamente tra 0 e 1 per G <0
Quanto più ρ è vicino a 0 tanto più G < 0 (reaz. spontanea)
ρ (o G, che concettualmente è la stessa cosa) è considerato da
molti un indicatore del potenziale di regolazione della reazione:
*se ρ è molto piccolo (0) si ritiene che l’enzima sia un potenziale
sito di regolazione (se ρ 1 c’è poca possibilità di regolazione)
 (=Q/Keq) e quindi G variano da tessuto a tessuto
http://users.humboldt.edu/rpaselk/C431.F08/C431Notes/C431nLec31.htm
ΔG°' e ΔG in vivo nella glicolisi
Perché ρ è considerato un indice
di potenziale regolazione?
I metaboliti devono essere a concentrazioni nel range μM- mM
A) Non possono essere a concentrazioni molto alte (es. 1M)
* perché ci sarebbero effetti osmotici pesanti
* perché le variazioni nel metabolismo sarebbero lente
(ci sarebbe molto intermedio da smaltire)
* perché si investirebbe molto in intermedi (e non prodotti)
B) Non possono essere a concentrazioni molto basse (es. nM)
* perché gli enzimi avrebbero Km basse e quindi una bassa
efficacia catalitica: Kcat / Km vale al max 108-109
* perché gli intermedi verrebbero esauriti velocemente
(non ci sarebbero riserve efficaci di metaboliti)
kcat is called the turnover number
kcat = moli di substrato trasformato / mole di enzima/secondo
Kcat = Vmax/Etot = turnover number
n. di reazioni catalizzate da ogni sito attivo ogni secondo; per un enzima MM vale K2.
Non può essere maggiore della frequenza con cui substrato ed enzima si incontrano.
Se ogni incontro è produttivo, si avrà la perfezione catalitica
http://www.aw-bc.com/mathews/ch11/c11kkkk.htm
VM  S
v
Km  S
Quando [S] << KM (soluzioni diluite) ricaviamo
ammettendo E= Etot :
= (k2/KM)[E][S] ~
(kcat/KM)[E][S]
Rate constant per
reaz. Bimolecolare
 Non può essere
maggiore della
velocità d’incontro
K 2 ET  S K 2 ET  S


KM  S
KM
Pendenza della retta: kcat/KM
(kcat/KM) vale al massimo 108-109 cioè il valore
massimo compatibile con la diffusione
Diffusion theory predicts that kcat/KM will attain a value of about
108-109 (mol/L)-1s-1. Carbonic anhydrase, Catalase, Fumarase and
Triose phosphate isomerase actually approach this limit.
TIM accelerates isomerization by a factor of 1010 compared with the rate obtained
with a simple base catalyst such as acetate ion. Indeed, the kcat/KM ratio for
isomerization of glyceraldehyde 3-phosphate is 2 × 108 M-1 s-1.
Da Lehninger
The kcat and activation energy of Rubisco from a variety of C3 and C4 plants
Sage et al.
Se questi 2 ragionamenti sono veri, ne consegue che :
* quando G° ' <<0 la reazione deve rimanere lontana dell’eq.
* quando G° '  0 (Keq 1) la reazione deve rimanere vicina all’eq.
Cosa significa
(approssimativamente)?
G <<0
G  0
Cosa succederebbe infatti se le reazioni con G° ' <<0
andassero all’equilibrio?
[P] >> [S]
Con due reazioni di questo tipo in fila (come ad es.
nella glicolisi GG6PF6PF1,6BP*), allora:
[S] << [P1]  [P2] << [P3] e più precisamente:
([F1,6BP][ADP]2 / [G][ATP]2) = 106
E cosa succederebbe se le reazioni con G° '  0 fossero
lontane dall’equilibrio…
[P] << [S]
Riassumendo:
Le concentrazioni dei metaboliti possono rimanere dentro ambiti
sensati (μM-mM) se le reazioni con
* G° ' <<0 rimangono lontane dall’equilibrio (G <<0, vale a
dire ρ 0). Tali reazioni quindi devono essere ben regolate!
* G° '  0 rimangono vicine all’equilibrio (G  0)
Queste
reazioni devono essere catalizzate da enzimi in eccesso
(altrimenti rallentando rimarrebbero lontane dall’equilibrio)
Da Lehninger
TPI aumenta la
velocità della
reazione 109 volte!!
Referenze
Per la cinetica enzimatica vedere
* Testo di biochimica (ad es. Voet and Voet, Biochemistry)
* Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 3
Per la parte di cinetica chimica vedere:
* Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 1.4.2 e 1.4.3
Effect of reversible inhibitors on the reaction rate: � no inhib. a)� mixed inhib. ([I] =
Ki = 0.5 Ki'); lower Vmaxapp (= 0.67 Vmax), higher Kmapp (= 2 Km). b)� competitive inhib.
([I] = Ki); Vmaxapp unchanged (= Vmax), higher Kmapp (= 2 Km). c)� uncompetitive inhib.
([I] = Ki'); lower Vmaxapp (= 0.5 Vmax) and Kmapp (= 0.5 Km). d)� noncompetitive inhib. ([I]
= Ki = Ki'); lower Vmaxapp (= 0.5 Vmax), unchanged Kmapp (= Km).
A special case of uncompetitive inhibition is substrate inhibition which occurs at
high substrate concentrations in about 20% of all known enzymes (e.g. invertase
is inhibited by sucrose). It is primarily caused by more than one substrate
molecule binding to an active site meant for just one, often by different parts of the
substrate molecules binding to different subsites within the substrate binding site.
If the resultant complex is inactive this type of inhibition causes a reduction in the
rate of reaction, at high substrate concentrations. It may be modelled by the
following scheme:
http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/inhibition.html
Effect of substrate inhibition the reaction rate. A comparison is made between the
inhibition caused by increasing KS relative to Km. � no inhibition, KS/Km >> 100; �
KS/Km = 100; � KS/Km = 10; � KS/Km = 1. By the nature of the binding causing this
inhibition, it is unlikely that KS/Km < 1.
Competitiva
Incompetitiva
Mista
Quando α = α‘ si parla
di in. non-competitiva
(la Km non cambia)
Effetto degli inibitori sui parametri cinetici