ASSORBIMENTO TRANSIENTE IN
MIOGLOBINA FOTOLIZZATA
Laureando:
Relatore:
Fabrizio Pittorino
Tullio Scopigno
LA MIOGLOBINA

Scopo della dissertazione: studiare la cinetica ultraveloce
della mioglobina in seguito alla fotodissociazione del ligando.

Funzione fisiologica della mioglobina: legare reversibilmente
l’ossigeno.

E’ un’emoproteina: il sito attivo è l’eme: Fe coordinato con
i 4 atomi di azoto di una porfirina.

Il Fe può essere 6-coordinato (mioglobina legata)
o 5-coordinato (mioglobina non legata).


Fotolisi (impulso
elettromagnetico)
t < 50 fs


Stati eccitati
transienti a vita
ultrabreve (fs, ps)
CO
Ricombinazione geminata (reazione in
soluzione acquosa) sulla scala del ns
Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata
4/11/2011
SCHEMA PUMP E PROBE

Gli impulsi di pump e di probe sono focalizzati sul campione.

Impulso di pump: ultracorto, utile alla fotolisi.

Impulso di probe: utile allo studio dello spettro di assorbimento transiente del sistema.

Quantità di interesse: differenza di assorbanza del probe in presenza e in assenza del pump:
A( , t )  ln( I ON / I 0 )  ln( I OFF / I 0 )

Variando la lunghezza d’onda del probe e il suo ritardo temporale rispetto all’impulso di
pump si ottiene lo spettro di assorbimento transiente del sistema, in cui A è funzione del
tempo e della lunghezza d’onda.
PROBE
PUMP
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APPARATO SPERIMENTALE

Laser a Ti:Sa centrato a 800 nm e con frequenza di 30 fs.

Impulso di pump ottenuto tramite OPA a 540 nm per massimizzare la fotolisi

Impulso di probe tramite dispersione non lineare in cristallo di CaF2

Delay line permette di regolare il ritardo tra pump e probe.

Chopper tarato a 500 Hz permette l’arrivo a intermittenza del pump sul campione.

Monocromatore e CCD raccolgono lo spettro di assorbimento transiente tra 400 e 700 nm

Campione di mioglobina nelle forme legata e non legata.
Come si presentano i dati:

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LE IPOTESI: PARALLELA E SEQUENZIALE

Fotolisi: meno di 50 fs.

Ipotesi per la cinetica dell’eme in seguito alla fotolisi del CO
in termini dell’apparizione di stati eccitati dell’eme non legato: Mb1 e Mb2.
1
1
Q
Q
 f  50 fs
 f  50 fs
Mb1
Mb1
Mb2
 2  3 ps
1  300 fs
k12
k10
Mb2
k 20
Mb
 g  ns
Mb
 g  ns
MbCO
Mb1 decade con  = 300 fs allo
stato fondamentale della proteina non legata.
Mb2 si rilega con il CO con  = 3 ps.
Ricombinazione geminata tra Mb e CO
sulla scala del nanosecondo.
Canale di formazione di Mb2 inibito nella MbCO.
MbCO
Mb1 è creato istantaneamente, decade
contemporaneamente nello stato
fondamentale e in Mb2.
Mb2 non è creato istantaneamente!
k10, k12 e k20 frequenze di transizione
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MODELLO PER L’IPOTESI SEQUENZIALE
Proponiamo un modello per l’ipotesi sequenziale:


Condizioni iniziali
Autovalori:


Soluzione
Autovettori:
Nonostante tre frequenze di transizione, solo due tempi caratteristici del
sistema!
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ANALISI DATI: PRESENTAZIONE

Spettro di assorbimento transiente della mioglobina non legata: A in funzione di  e t.

Chirp temporale: dovuto
alla variazione dell’indice
A
di rifrazione con 
(…e visibile data l’elevata
risoluzione temporale)!

Possibile eliminazione del chirp
tramite routine scritta su MatLab.
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A
4/11/2011
ANALISI DATI: PRESENTAZIONE

Risultato dell’eliminazione del chirp nello spettro della mioglobina non legata.

Picchi: “nascita” di:

Mb1 (462 nm)

Mb2 (448 nm)

Scomparsa dello
A
stato fondamentale
(435 nm).

Analogamente per la proteina legata con il CO:

Assenza di picco a 448 nm
A
(Inibizione di formazione Mb2)

Baseline rappresenta la lenta
ricombinazione geminata.
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ANALISI DATI: A SINGOLA LUNGHEZZA D’ONDA (MB)

Un primo approccio può essere eseguire fit a singola lunghezza d’onda sui picchi di
assorbimento delle specie transienti (problema delle code).

In accordo col nostro modello, fit bi-esponenziali.


Mb: 435 nm

Mb2: 448 nm
Mb1: 462 nm
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ANALISI DATI: A SINGOLA LUNGHEZZA D’ONDA (MBCO)

Analoghi risultati per la mioglobina legata con il monossido di carbonio.

Per rappresentare la ricombinazione geminata bisogna inserire una baseline.

Mb: 435 nm


Mb2: 448 nm
Mb1: 462 nm
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4/11/2011
ANALISI GLOBALE: SVD

La sovrapposizione degli spettri di assorbimento delle specie transienti rende
difficoltosa l’estrazione dell’informazione lontano dai picchi di assorbimento.

Una possibile soluzione è effettuare un’analisi simultanea su tutte le lunghezze
d’onda.

L’analisi globale è condotta usando il pacchetto MatLab Ultrafast Toolbox.

Primo passo: SVD. Questo tipo di analisi permette la stima del numero di
processi attivi del sistema decomponendo la matrice dei dati in spettri di base
pesati. Quelli con peso maggiore rappresentano il segnale, gli altri sono rumore.

Risultati per la mioglobina
non legata:

Si confermano due processi
dominanti… e un terzo
non trascurabile.
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4/11/2011
ANALISI GLOBALE: GLOBAL FIT

Global fit: fit simultaneo su tutte le lunghezze d’onda, che ha come parametri i
tempi caratteristici corrispondenti ai processi attivi del sistema e a ognuno di essi
associa uno spettro indipendente dal tempo.

I dati possono essere ricostruiti secondo la formula:

Dati caricati:

Un processo in più.

… I tempi caratteristici sono
sovrastimati!

Questo è imputabile alla presenza del cooling vibrazionale (il terzo processo).
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4/11/2011
COOLING VIBRAZIONALE

La foto-eccitazione all’origine delle specie elettroniche ha come risultato specie
vibrazionalmente calde. I picchi di assorbimento di queste si spostano quindi nel tempo,
“raffreddandosi”.

Fit con combinazione lineare di gaussiane
permette di estrarre la posizione dei picchi

Spostamento dei picchi nel caso
della mioglobina non legata.


Tempi caratteristici paragonabili a
quelli della foto-cinetica

Spostamento del picco nel caso della
mioglobina legata.
Possibile distorsione dovuta a Mb2
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4/11/2011
CONCLUSIONI
Ci siamo occupati di studiare nel dettaglio la cinetica ultraveloce
della mioglobina in seguito alla fotolisi del ligando CO.

Il nostro studio, effettuato sia tramite fit a singola lunghezza d’onda
sia con fit simultanei su tutto lo spettro di assorbimento transiente,
conferma l’apparizione di due stati eccitati in seguito alla fotolisi
e il loro decadimento sequenziale verso lo stato fondamentale.

Il cooling vibrazionale è un’ulteriore complicazione all’interpretazione dei dati
e ne abbiamo studiato le dinamiche, evidenziando di lavorare con stati dell’eme
vibrazionalmente caldi, sia per lo stato fondamentale sia per gli stati eccitati.
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4/11/2011
ANALISI DATI: PRESENTAZIONE

Traccia temporale a 435 nm nel caso della proteina non legata:

Assorbimento transiente in funzione della lunghezza d’onda a tempi selezionati.
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27/10/2011
SVD E GLOBAL FIT
La sovrapposizione degli spettri di assorbimento delle specie transienti rende difficoltosa
l’estrazione dell’informazione lontano dai picchi di assorbimento.
 Singular value decomposition: decompone i dati
seguente:
vvvvv
nel modo
dove S è una matrice diagonale mxn che contiene le singular values, U le tracce nel dominio del
tempo e V quelle nel dominio spettrale.
Decomposizione di una matrice in somma pesata di matrici di base.
Matrici separabili, possono essere scritte come prodotto esterno di due vettori:
o in coordinate:
Si ottiene così:
dove le
rappresentano le singular values.
Base di componenti ortogonali che può riprodurre i dati tramite combinazione lineare (non hanno
necessariamente un significato fisico).
Le componenti della base corrispondenti alle SV più alte rappresentano il segnale, le altre il
rumore.
Permette di estrarre il numero dei processi attivi presenti nei dati.
SVD E GLOBAL FIT
La sovrapposizione degli spettri di assorbimento delle specie transienti rende difficoltosa
l’estrazione dell’informazione lontano dai picchi di assorbimento.
Global fit permette di estrarre costanti di tempo e spettri indipendenti del tempo corrispondenti
ai processi attivi presenti nei dati.
Pacchetto Ultrafast Toolbox: algoritmo patternsearch per la ricerca del minimo assoluto della
somma dei residui
dove
è la matrice dei dati aspettata.
Il problema è multidimensionale (su tutte le lunghezze d’onda)
minimizzazione su una ipersuperficie.
Nella spettroscopia ultraveloce i dati di assorbimento transiente sono descritti da:
dove le
indipendenti dal tempo. I
parametri di fit.
sono gli spettri funzione di
e
sono le costanti di tempo corrispondenti e sono i
Lo scopo è dunque trovare questi due parametri.
 Tramite SimBiology si può caricare il modello tramite il quale si effettuerà il global
fit sui dati (prima profili di concentrazione, poi fit sui dati).