Farmacogenetica
Fattori endogeni ed esogeni che contribuiscono alla variabilita’ nella risposta ai
farmaci
Goodman and Gilman, 2011
Definizioni di termini genetici
• Gene: unità fondamentale, fisica e funzionale,
dell’eredità, che trasmette le informazioni biologiche
da una generezione alla successiva.
• Fenotipo: caratterisitica morfologica e funzionale di
un organismo determinata dal suo genotipo e
modulata dall’ambiente.
• Polimorfismo genetico: presenza nella popolazione
di più varianti di un medesimo carattere,
determinato da alleli diversi con frequenza superiore
all’1%.
• Allele: forma alternativa di uno specifico gene.
Quanto è grande il genoma? Quanti
geni contiene?
http://jul2012.archive.ensembl.org/Homo_s
apiens/Location/Genome?r=1:1-1000000
E’ possibile prevedere l’effetto di un farmaco in un certo soggetto?
Farmacogenetica/farmacogenomica: associano ad un certo fenotipo
(modalità di risposta al trattamento) un certo genotipo.
La promessa della farmacogenetica è che conoscendo il genotipo di un
soggetto è possibile prevedere il rischio di tossicità di un certo
trattamento.
Obiettivo delle ricerche farmacogenetiche
- Associare ad un certo FENOTIPO (risposta terapeutica, effetti avversi,
resistenza) un determinato GENOTIPO
GENOTIPO
FENOTIPO
Varianti puntiformi (SNPs)
Risposta terapeutica
Delezioni
Effetti avversi
Sequenze ripetute
Mancanza di effetto
Profili di espressione(mRNA o proteine)
misurati con tecniche high throughput
come gli array
Dal punto di vista molecolare, l’efficacia dei farmaci è legata alla concentrazione delle
specie attive a livello del loro sito d’azione.
Proteine che hanno un ruolo nella determinazione della:
- FARMACOCINETICA (Assorbimento,Distribuzione, Metabolismo, Escrezione)
- FARMACODINAMICA (Bersagli molecolari)
di un composto possono influenzare la sua azione terapeutica.
Alcuni dei principali enzimi coinvolti nell’inattivazione metabolica dei farmaci presentano
dei polimorfismi di attività geneticamente determinati
(Science 1999; 286: 487-491)
Effetti farmacogenetici su
farmacocinetica e farmacodinamica
Evans & McLeod, NEJM 2003
Polimorfismi nei geni per gli enzimi coinvolti nell’inattivazione
metabolica dei farmaci e per i recettori influenzano la biodisponibilità
e l’efficacia del trattamento
(Science 1999; 286: 487-491)
Polimorfismi genetici a livello del DNA possono
influenzare la struttura ed attività di proteine
La complessita’ del dogma centrale
della biologia sta aumentando
Feero et al., NEJM 2010
Elementi di variazione genetica umana
Feero et al., NEJM 2010
In oncologia ci sono due genomi da
considerare: paziente e neoplasia
Polimorfismi genetici a livello del DNA possono
influenzare la struttura ed attività di proteine
Nomenclatura delle regioni genomiche
Goodman and Gilman, 2011
Meccanismi molecolari di polimorfismi genetici
Goodman and Gilman, 2011
Codice genetico
Codice genetico
Nomenclatura delle regioni genomiche
Goodman and Gilman, 2011
Quanto differisce il genoma (DNA) fra un
individuo e l’altro?
~ 1 nucleotide ogni 150-1000
nucleotidi
Per un totale di:
~ 60 milioni di elementi
variazione piccoli
~ 17 milioni di SNPs
~ 8000 copy number variations
di
Chakravarti et al Nature 409, 822 – 823, 2001
The International HapMap Consortium Nature 449, 851-861. 2007
The International HapMap Consortium Nature 437, 1299-1320. 2005
Conrad et al Nature 2009
Quanti geni contengono
alterazioni in ciascun individuo?
Studi del DNA genomico mediante
sequenziamento esoni e interrogazione copy
number variation (CNV):
- 46 non-sense cSNPs/persona;
- 52 frameshift indel/persona
- 274 geni alterati da CNV
Quindi ~372 geni/persona portano sostaziali
difetti.
Nature. 2009; 461:272-6. Ng ….Nickerson DA, Shendure J.
Nature. 2009. WTCC CNV Conrad DF et al
What is the importance of inherited
genomic variability?
• Common vs rare variants—still unclear if
variability is so diverse that it’s not tenable to
discover or utilize
• What proportion of variability in clinical
phenotypes (e.g. cancer risk, response to
medications) is inherited?
The 1000 genome project consortium, Nature 2012
The 1000 genome project consortium, Nature 2012
L’emivita dell’antipirina ha una concordanza maggiore nei
gemelli identici che nei gemelli non identici.
Goodman and Gilman, 2011
Cancer Phenotypes are determined in Cell lines, and HapMap
genotypes can be used for genome-wide phenotype/genotype
association studies
100
% Survival
80
60
40
20
0
0.05
0.1
0.15
Daunorubicin (µM)
0.2
(Dolan et al Cancer Res 2004; Watters et al PNAS 2004)
~ 30% - 70% of
pharmacodynamic
variability (how
drugs affect
humans) is genetic
Fenotipi farmacologici di tipo farmacocinetico hanno una
componente genetica di fenotipi più complessi (clinici)
+
Variabilità spiegabile in
termini genetici
Farmacocinetico
Fenotipi
di
risposta
ai
farmaci
Farmacodinamico
Clinico
-
- Emivita
- Concentrazione
allo steady state
- Sensibilità ai
farmaci in vitro
- Risposta clinica ai
farmaci
- Tossicità clinica dei
farmaci
A …G A G C A C A T …..
B …G A T C A C A T …..
Quando gli SNP sono importanti?
Sequenza di DNA
Proteina codificata
A …G A G C A C A T …..
Funzionale
B …G A T C A C A T …..
Non-funzionale
SNP = Single Nucleotide Polymorphism
Effetto del polimorfismo genetico sull’attività della proteina (1)
Pt 1
Pt 2
Pt 3
= allele funzionale (wild type )
= gene non-funzionale (variante con SNP, I/D, ecc)
Evans et al, SJCRH, 2000
Effetto del polimorfismo genetico sull’attività della proteina (2)
Evans et al, SJCRH, 2000
Caratteri farmacogenetici monogenici o multigenici
Goodman and Gilman, 2011
Come trovare informazioni sui
polimorfismi?
- Database dbSNPs selezionando la sezione
dedicata
agli
SNPs
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/).
- Genome browser (http://genome.ucsc.edu/)
- PharmGKB (http://www.pharmgkb.org)
Antimetaboliti tiopurinici
6-mercaptopurina ed il suo profarmaco azatioprina sono farmaci
analoghi delle purine, utilizzati entrambi come antiblastici e
immunosoppressori
la 6-mercaptopurina trova impiego nella terapia di
mantenimento della remissione della leucemia linfoblastica
acuta e nel trattamento di diverse malattie autoimmuni
Dal punto di vista strutturale, la 6-mercaptopurina è
l'analogo tiolico dell'ipoxantina
Metabolismo 6-mercaptopurina
Stocco et al., Expert Opin Drug Saf 2010
Metabolismo azatioprina e 6-mercaptopurina
CH3
S
H
N
N
N
N
6-methyl-mercaptopurine (6MMP)
SH
TPMT
O 2N
N
N
S CH3
H
N
N
N
N
azathioprine
N
-SH
SH
H
N
GST
N
HPRT IMPD GMPS H2N
H
N
N
N
Attività
cytotoxicity
N
N
H2O3PO
O
6-mercaptopurine
(6-MP)
OH
HO
6-thio
guanosine
5'-mono
phosphate
(6-TGN)
XO
SH
N
HO
H
N
OH
N
N
6-thiouric acid
Complessita’ del metabolismo della
6-mercaptopurina
Meccanismo d’azione molecolare tiopurine
I tionucleotidi esplicano la loro azione
immunosoppressiva / linfolitica principalmente
attraverso 3 meccanismi molecolari:
- incorporazione negli acidi nucleici ed
interferenza con gli enzimi che li processano;
- inibizione della sintesi de novo delle purine;
- inibizione delle vie di trasduzione del segnale
mediate da proteine leganti il GTP (per es.
Rac1).
Tiopurina-S-metil-transferasi (TPMT)
Enzima del metabolismo dei farmaci (fase II) che
catalizza la metilazione dei farmaci tiopurinici (6mercaptopurina, 6-tioguanina) e di altri tioli
aromatici.
Qual’è la funzione endogena di
TPMT?
sembra essere coinvolto nella
sintesi
della
molibdopterina,
cofattore di alcuni enzimi (xantina
ossidasi)
Il fenotipo attività di TPMT è ereditato come carattere
autosomico codominante
Weinshilbaum and Sladek, Am. J. Hum. Gen. 1980
Il fenotipo attività di TPMT è ereditato come carattere
autosomico codominante
Weinshilbaum and Sladek, Am. J. Hum. Gen. 1980
Il gene per TPMT è stato localizzato sul cromosoma 6, in posizione 6p22.3
mediante tecniche di ibridazione in situ.
Il gene ha una lunghezza di 34 kb; la sua struttura comprende 10 esoni e 9
introni.
Come si studia il gene TPMT? Come si effettua la genotipizzazione di TPMT,
ovvero come si individuano le mutazioni del gene?
Sono stati individuati molti alleli mutati di TPMT (attualmente almeno 36) ma 3 di
questi (TPMT*2, TPMT*3A, TPMT*3C) sono responsabili del 95 % dei casi di
attività TPMT ridotta o nulla.
G460A ->rs1800460
TPMT*2
TPMT*3
A719G ->rs1142345
Gruppi etnici e alleli varianti di
TPMT
• Caucasici: TPMT*3A
• Asiatici: TPMT*3C
• Africani: TPMT*3C, TPMT*8
Database alleli TPMT
http://www.imh.liu.se/tpmtalleles?l=en
The protein encoded by the TPMT*3A variant allele is less
stable than that encoded by the TPMT*1 (wild-type) allele
Dr. Evans’s lab (Tai et al., PNAS 1997)
picture from Jones TS et al, Clin Pharm Ther 2007
Polimorfismi di TPMT ed aggiustamenti del dosaggio di
mercaptopurina nel trattamento della leucemia linfoblatica
acuta
Relling et al., JNCI 1999
Relling et al., CPT 2011
Dalla scoperta all’implementazione clinica di TPMT
• L'associazione fra il polimorfismo di TPMT e la tossicità delle
tiopurine è una di quelle più studiate nell'ambito della
farmacogenetica.
• Nel 1980 è stato osservato che l'attività dell'enzima
presentava una distribuzione polimorfica trimodale, in uno
studio condotto su volontari sani.
• Studi successivi hanno chiarito che l'attività di TPMT viene
ereditata come un carattere autosomico codominante.
• Questi studi sono stati seguiti dall'individuazione del
polimorfismi genetici responsabili delle differenze di attività di
TPMT.
Linee guida farmacogenetiche
• La disponibilità di linee guida per l’applicazione
clinica di caratteristiche farmacogenetiche è indice
che una notevole evidenza si è accumulata riguardo
l’associazione fra una caratteristica farmacogenetica
e la risposta ad un farmaco.
• Per esempio, per la 6-mercaptopurina, sono stati
necessari 30 anni di ricerca per passare
dall’identificazione del polimorfismo a stabilire linee
guida utili alla genotipizzazione preventiva.
Dalla scoperta all’implementazione clinica di TPMT
Relling, 2013
Ricerca di Linee Guida Cliniche su Pubmed
Su Pubmed è possibile attivare un filtro per ricercare solo le linee guida
terapeutiche e, recentemente, ne esistono anche di farmacogenetiche…
Published CPIC Guidelines
2011
TPMT – thiopurines
Updated – March 2013
2012
2013
2014
Frazione dei farmaci utilizzati in clinica metabolizzati dai piu’
importanti enzimi di fase 1 e fase 2
Goodman and Gilman, 2011
DEBRISOCHINA
CYP2D6
4-IDROSSIDEBRISOCHINA
Immagine presa da Weinshilboum R. et al.,
Weinshilboum
NEJM 348(6),
R. et
2006
al., NEJM 2006
CYP2D6
Responsabile per il metabolismo
del 25-30% dei farmaci:
- Beta-bloccanti (propranololo,
metoprololo);
- Antiaritmici (nimodipina);
- Antidepressivi (imipramina, fluoxetina);
- Neurolettici (aloperidolo);
- Antitussivi (destrometorfano);
- Analgesici (codeina).
Immagine dal file PDB 2F9Q
Il
polimorfismo
del
citocromo
CYP2D6
è
stato
scoperto
grazie
all'osservazione di grandi differenza nella farmacocinetica e nell'efficacia
terapeuitica di molecole che sono substrato di questo enzima (per esempio
codeina, destromorfano, metoprololo e nortriptilina).
Per esempio il farmaco anti-ipertensivo DEBRISOCHINA. Questo farmaco
era utilizzato in clinica in virtù della sua azione come bloccante dei neuroni
noradrenergici.
Attualmente è utile come indicatore del metabolismo di altri farmaci che
vengono metabolizzati dallo stesso CYP. Può quindi essere impiegato come
farmaco "sonda", composto utilizzato per individuare i soggetti con un
metabolismo ridotto oppure con un metabolismo aumentato. Attualmente
comunque sono stati messi a punto dei saggi di biologia molecolare per
caratterizzare questo fenomeno ed i farmaci "sonda" non sono generalmente
utilizzati nella pratica clinica.
Polimorfismi genetici di CYP2D6
• Gene situtato sul cromosoma 22.
• Sono stati caratterizzati piu’ di 82 varianti
alleliche per questo enzima (descritti al sito:
www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm).
• SNPs o inserzioni/delezioni possono ridurre
l’attivita’
dell’enzima
(~10%
della
popolazione).
• Esistono soggetti con copie multiple del gene
(fino a 13 copie) (2% o + della popolazione)
Caratteristiche molecolari dei polimorfismi di CYP2D6
Polimorfismi presenti nel
gene
del
citocromo
CYP2D6:
- SNP
*4
*6
- delezioni
*3
- ripetizioni di basi
Delezione del gene
Amplificazione del gene
Frequenza dei polimorfismi di CYP2D6 nella
popolazione Italiana
Scordo et al., Pharm Res 2004
Distribuizione etnica
dei fenotipi polimorfici di CYP2D6

Poor metabolizer
Europei
 Africani (USA)
 Orientali


5-10 %
2-5 %
<1 %
Ultra-rapid metabolizer
Scandinavi
 Spagnoli
 Etiopi

1.5 %
7%
20 %
Copie del gene CYP2D6 ed effetti sulla
farmacocinetica della nortriptilina
(antidepressivo triciclico)
Nortriptilina
Indicazione terapeutica: Antidepressivo triciclico
Meccanismo d’azione: inibizione del re-uptake della
norepinefrina
Weinshilboum R. et al., NEJM 348(6), 2006
Codeina
• Indicazione
terapeutica:
antidolorifico,
antitussivo.
• Meccansimo d’azione: profarmaco della
morfina, agisce sui recettori per gli oppioidi.
• Attivazione a morfina catalizzata da CYP2D6:
~10% della popolazione non risponde bene e
~2% e’ a rischio di sovradosaggio.
Metabolismo della codeina
CYP2D6
CYP3A4
UGT1A1,
UGT2B7
Farmacocinetica Codeina e Morfina
Thorn et al., Pharmacogenetics & Genomics 2009
Curve concentrazione-tempo della codeina, morfina e
dei loro metaboliti e attivita CYP2D6
• EM = extensive metabolizer
• UM
=
ultra-rapid
metabolizer
• PM = poor metabolizer
Kirchheiner et al., Pharmacogenomics J 2007
Ridotta efficacia della codeina in pazienti con ridotta
attivita’ CYP2D6
Intossicazione da codeina dopo tonsillectomia in
pazienti con attivita’ molto elevata di CYP2D6
• Pazienti pediatrici:
- deceduti dopo la prima notte a casa;
- pazienti in trattamento con codeina;
- riscontri post-mortem in accordo con
un’attivazione aumentata della codeina a
morfina e con un’ attivita’ elevata di CYP2D6;
- comunque sono report di un unico gruppo.
Come mai questa paziente ha sviluppato questo tipo di tossicità?
L'analisi genetico molecolare ha rilevato che era un soggetto con un fenotipo ultrarapido per il CYP2D6!
In questa paziente inoltre si verificava anche l' inibizione del CYP3A4 dovuta alla
concomitante somministrazione di un antibiotico macrolide (claritromicina) e di
un azolo (voriconazolo).
Linee guide per il trattamento con codeina in
rapporto al genotipo CYP2D6
Crews et al., Clin Pharm Ther 2012
Genotipo CYP2D6 ed attivita’ dell’enzima
Crews et al., Clin Pharm Ther 2012
Raccomandazioni sulla terapia con codeina in
base al fenotipo CYP2D6
Siti di interesse:
• Linee guida:
http://www.pharmgkb.org/drug/PA449088
• Classificazione alleli:
www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm
• Elenco substrati ed inibitori dei citocromi:
http://medicine.iupui.edu/clinpharm/ddis/table.aspx
Dall’anno scorso l’uso di codeina è vietato
in pazienti sotto i dodici anni in Italia…
Tramadolo
Oppioide sintetico della
famiglia dei derivati
dell’amminocicloesanolo.
Agisce come agonista
oppioide ma anche come
antagonista adrenergico e
serotoninergico.
Caso clinico:
• Un paziente pediatrico (12 anni) dopo appendicectomia
viene trattato con tramadolo al dosaggio standard, ma
senza efficacia.
• Dopo qualche ora, visto il perdurare di dolore
persistente, si passa alla morfina e siccome non ha
risposto al tramadolo, una dose di morfina piuttosto
alta viene somministrata.
• Il paziente va incontro a depressione respiratoria che
risponde ad un inibitore degli oppiodi (naloxone).
• La dose di morfina viene ridotta ed il paziente risponde
alla terapia analgesica senza sviluppare effetti avversi.
Metabolismo
del tramadolo
CYP2D6 metabolizza il
tramadolo
ad
un
composto più attivo.
(+) - M1: ha un’affinità
aumentata di 300-400
volte per il recettore 
degli oppioidi.
pazienti con una ridotta
attività
di
CYP2D6
possono essere a rischio
di mancata risposta da
tramadolo.
CYP3A
4
Caso clinico: commenti (1)
Il paziente non ha risposto bene a dosaggi
convenzionali di tramadolo in quanto privo di
attività per il citocromo CYP2D6: mancava quindi
il contributo del metabolita (+) – M1, molto più
attivo rispetto al farmaco nativo ed agli altri
metaboliti.
Caso clinico: commenti (2)
L’opzione migliore sarebbe stato probabilmente
l’aumento di dosaggio del tramadolo oppure il
passaggio a morfina a dosi basse piuttosto che il
passaggio a morfina a dose elevata.
«Poor metabolizers» necessitano di una
dose di tramadolo aumentata del 30%
rispetto a pazienti con CYP2D6 normale
Pain. 2003 Sep;105(1-2):231-8.
CYP3A4 ed inattivazione
tramadolo
Warfarina
• Azione farmacologica: Antocoagulante orale,
prevenzione delle malattie tromboemboliche.
• Meccanismo d’azione: Antagonista della
vitamina K
• Dosaggio complicato in quanto l’indice
terapeutico e’ piccolo.
Il ciclo della vitamina K ed il meccanismo
d’azione della warfarina
Farmacogenetica del dosaggio della
warfarina
Da Goodman & Gilman, 2011 Figura 7 - 13
Tempo di protrombina / International Normalized
Ratio = indice farmacodinamico per la warfarina
• Range di normalità: 0,8 – 1,2
• Durante il trattamento anticoagulante si vuole
che rimanga fra 2 e 3
• Per valori di INR maggiore, c’è un aumento del
rischio di emorraggia
Farmacogenetica warfarina
• Esistono delle linee guida CPIC
• Due studi clinici prospettici recenti hanno
confrontato il dosaggio con un approccio
convenzionale in confronto a quello basato sul
genotipo CYP2C9 / VKORC1
Studio prospettico: europeo
(EUPACT)
• 226 pazienti con dosaggio
guidato dal genotipo;
• 228 pazienti con standard
care;
- INR migliore (7%) nei
pazienti
con
dosaggio
guidato dal genotipo = no
«over-shoot» nell’effetto
- Maggior tempo in range
terapeutico
Pirmohamed et al., NEJM 2013
Studio prospettico: americano
(COAG)
• 514 pazienti con dosaggio
guidato dal genotipo;
• 501 pazienti con standard
care;
• Nessuna differenza di INR
tra i pazienti con dosaggio
guidato da genotipo e quelli
con
dosaggio
guidato
clinicamente.
Kimmel et al., NEJM 2013
Differenze dei risultati fra i due studi
• Dose di carico: S-warfarina ha un’emivita di 18-35
ore, si raggiunge quindi lo steady state in 90 – 175
ore (5 emivite) = EUPACT prevede una dose di carico,
COAG no.
• I risultati delle genotipizzazioni non erano disponibili
al giorno 1 in COAG (genotyping point-of-care
method per EUPACT)
• Differenze etniche: EUPACT = 97% caucasici, CAOG =
30% afro-americani in cui gli SNPs significativi per
CYP2C9 sono differenti.
• COAG utilizzano un algoritmo clinico non validato e
mai testato prima.
Algoritmo per selezionare la dose
di warfarina
• Consultabile al sito:
http://www.warfarindosing.org