CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI
Sara Caldarola
Lab 4306 (studio 4317 Prof Loreni)
[email protected]
ORARIO di RICEVIMENTO:
Mercoledi 11:00-12:00
ANIMALI TRANSGENICI : Metodologie e Applicazioni
DROSOPHILA TRANSGENICA
PIANTE TRANSGENICHE: Metodologie e Applicazioni
OGM AGRICOLO ALIMENTARI
G 19/03: PRESENTAZIONE + Lez1 ANIMALI TRANSGENICI
G 26/03: OGM (Prof. Gravina)Lez1
G 02/04: OGM (Prof. Gravina)Lez2
G 09/04: Lez2 ANIMALI TRANSGENICI ***consegna articoli
G 16/04: Lez3 ANIMALI TRANSGENICI
G 23/04: Lez4 DROSOPHILA
G 30/04: Lez5 PIANTE
G 07/05: Lez6 PIANTE
G 14/05: PRESENTAZIONI (3 a lezione) 15m
G 21/05: PRESENTAZIONI
G 28/05: PRESENTAZIONI
G 04/06: PRESENTAZIONI
ANIMALI TRANSGENICI :
definizione
Animali transgenici: animali ottenuti
attraverso una manipolazione del genoma,
inserendo uno o più geni, appartenenti alla
stessa specie, o più spesso di specie diverse.
ANIMALI TRANSGENICI :
come si producono???
GFP
Vettori retrovirali
Microiniezione del DNA
Cellule staminali embrionali
Gene targeting/ gene trap
KO condizionali
Trasferimento del nucleo
YAC
1) VETTORI RETROVIRALI
Permettono il trasferimento e l’integrazione
di materiale genetico nella cellula ospite
Vantaggi dei vettori non virali
•
•
•
•
Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni
Riduzione del rischio di reazione immunitaria
Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di
trasdurre molecole di DNA anche molto grandi
Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo
•
•
Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione
Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale
Svantaggi dei vettori non virali
Vantaggi dei vettori virali
•
Alta efficienza di trasduzione
•
Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con
eventuali virus presenti nell’ospite
Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale
nel genoma)
Molecole di DNA di dimensioni limitate
Reazioni immunitarie
Costi elevati
•
•
•
•
Svantaggi dei vettori virali
VETTORI VIRALI
Vettore virale
Vantaggi
Svantaggi
Retrovirus
Capacità d'inserimento del gene,
integrazione stabile nel DNA dell'ospite,
elevati titoli di virus ricombinante, ampio
tropismo d'infettività, relativa facilità di
manipolazione del genoma virale
Difficoltà nel controllare l'infezione
virale, mancata infezione delle cellule
non in divisione, integrazione a caso nel
genoma dell'ospite
Lentivirus
Infezione delle cellule in divisione o meno,
espressione stabile del gene, elevata capacità
d'inserimento
Mutagenesi potenziale presenza di
sequenze proteiche regolatrici e
accessorie
Adenovirus
Elevati titoli di virus, alta espressione genica,
Risposte immuni alle proteine virali,
grande capacità d'inserimento, infezione di
nessuna integrazione nel genoma
cellule in divisione e non in divisione
dell'ospite, espressione genica transitoria
Virus adeno-associati Infettano le cellule in divisione o meno, ampio Limitate capacità per i transgeni, difficile
tropismo cellulare, potenziale d'integrazione, generazione di alti titoli virali, presenza di
bassa immunogenicità e non patogenicità
adenoviruds o herpevirus per la
moltiplicazione dei virus adeno-associati
Herpesvirus
Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari, alta
capacità d'inserzione, tropismo naturale per
le cellule neuronali, seguita dalla produzione
di alti titoli virali
Poxvirus
Alta capacità d'inserzione, possibile inserzione
Possibile effetto citopatico
di grandi framenti di DNA, alti livelli di di
espressione transgenica,, seguita da virus vivo
ricombinante
Infetta cellule in divisione o meno con
Difficoltà di controllare le linee cellulari
prevalenza per i linfociti B, alta capacità
d'inserimento
Virus di Epstein-Barr
Possibile tossicità, rischio di
ricombinazione, nessuna integrazione
virale nel DNA dell'ospite
Ciclo vitale di un retrovirus
• genoma a RNA, 2 copie
• L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNA in DNA a doppio filamento nel
citoplasma della cellula infetta.
• Il DNA lineare migra nel nucleo e viene integrato nel DNA della cellula ospite. Il
DNA integrato è chiamato provirus.
• L’apparato della cellula ospite trascrive il provirus producendo RNA virali che
fungono sia da mRNA che da genomi che saranno impaccati nei nuovi virioni.
• 2 copie di RNA genomico vengono incapsidate in ogni virione
RNA
DNA
Struttura genomica ed
espressione genica dei retrovirus
•
Il genoma tipico contiene 3
“geni”
– Gag (componenti del core
nucleoproteico)
– Pol (replicazione e
ricombinazione)
– Env (componente della
membrana esterna)
Genoma retrovirale
Trascrittasi inversa e integrasi
Proteina strutturale capside
Proteina per involucro
Psi + non codificante. Per confezionamento nel capside
Lunga sequenza terminale ripetuta
Vettore retrovirale
Lunghezza massima: 8Kb
Inserito nelle
cellule eucariotiche
con bassissima efficienza
tramite
trasfezione/elettroporazione
Con alta efficienza
Mediante
INFEZIONE
•Le particelle virali prodotte sono difettive per la replicazione
•Possiedono un gene marcatore selezionabile (NeoR)
•Infettano facilmente cellule in attiva replicazione
•Si integrano stabilmente nel genoma ospite e producono il geneX
INFEZIONE DI CELLULE IN COLTURA
E PRODUZIONE GENE X
Packaging cell lines
Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali
codificanti per proteine strutturali del capside (late
genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni.
La loro transfezione transiente con il DNA-vettore
determina l’impacchettamento del costrutto nel
virione.
Si ottiene in questo modo un vettore virale di
transfezione completo.
Utilizzo vettori retrovirali:
A) TERAPIA GENICA
Tecnica terapeutica in cui un gene funzionale viene inserito nelle cellule
somatiche di un paziente
Scopo:
• Correggere un difetto genetico
• Fornire una nuova funzione alla cellula
Applicabilità:
1. Malattie genetiche classiche
(un solo gene coinvolto, ereditarietà mendeliana)
2. Malattie multigeniche (cancro)
3. Malattie genetiche acquisite (AIDS)
4. Malattie non genetiche
80% dei protocolli coinvolge malattie delle categorie 2-4
TERAPIA GENICA NELLE MALATTIE GENETICHE
CLASSICHE
E’ importante stabilire se il processo citopatico risulta da:
Loss of function del gene mutato, cioè la mutazione nel
gene provoca perdita della funzione genica
introduzione del gene normale OK
Gain of function cioè la mutazione nel gene produce una
proteina con funzioni diverse da quelle della proteina
normale introduzione del gene normale INEFFICACE
Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA
• Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato).
• Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteina
terapeutica (a livelli adeguati).
• Capace di incorporare DNA di varie dimensioni.
• Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o
post-traduzionale) dell’espressione del gene terapeutico
• Non dovrebbe essere patogeno.
• Amministrabile direttamente nel paziente.
• In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio.
• Ben tollerato.
• Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune.
• Facile da produrre in maniera riproducibile.
IL VETTORE IDEALE NON ESISTE. IL VETTORE PIU’
UTILIZZATO OGGI E’ IL VETTORE RETROVIRALE
Vettori Retrovirali:
• Pro situazione attuale e prospettive future
– efficiente trasduzione di cellule in attiva replicazione
• linfociti e precursori delle linee ematopoietiche
– notevole esperienza clinica ex vivo
(linee tumorali)
• Contro
– integrazione random
• attivazione di oncogeni
• shut-off trascrizionale dipendente dal sito di integrazione
– capacità di impaccamento limitate (max. 7 kb)
- Incapacità di infettare cellule in quiescenza (cellule nervose)
TERAPIA GENICA IN VIVO
Somministrazione diretta del gene terapeutico
in vivo alle cellule:
• iniezione diretta (ad es. nel muscolo scheletrico distrofico)
• somministrazione in prossimità del tessuto (ad es. vie respiratorie nella fibrosi cistica)
Problemi:
• Trasferimento quantitativamente limitato
• Rischio di inserimento in cellule sane
• Reazione immunitaria
TERAPIA GENICA
EX VIVO
Trapianto di cellule geneticamente
modificate:
• Estrazione/preparazione delle
cellule primarie o di linea
• Trasferimento del gene in vitro
• Reimpianto delle cellule
Problemi:
• Cellule autologhe
ingegnerizzate: laboriosa, vita
limitata
• Cellule eterologhe
ingegnerizzate: reperibilità,
compatibilità
IN VIVO
EX VIVO
TERAPIA GENICA per deficit dell’ADA
ADA (adenosina deaminasi): enzima coinvolto nel salvataggio delle purine nel percorso di
degradazione degli acidi nucleici, indispensabile in molti tipi cellulari.
La sua carenza causa una patologia recessiva molto rara che ha effetti molto seri sui linfociti
T, una delle principali classi di cellule del sistema immunitario: GRAVE E COMPLESSA
IMMUNODEFICIENZA
ADA e TERAPIA GENICA:
1) Il gene ADA è piccolo e clonato nel 1990
2) Le cellule bersaglio sono i Linfociti T, cellule facilmente ottenibili dal paziente e facilmente
coltivabili TERAPIA GENICA EX-VIVO
3) Livello di espressione puo’ variare senza conseguenze (range 10-5000&)
Trial clinico per deficit ADA
(1990)
PROBLEMI DELLA TERAPIA GENICA
1. Stabilità d’espressione del transgene nel tempo
2. Mutagenesi inserzionale
3. Regolazione dell’espressione del transgene
(promotori inducibili)
4. Cell targeting
5. Pericolosità, Etica
Utilizzo vettori retrovirali:
B) PRODUZIONE TOPI
TRANSGENICI
SVANTAGGI
-Max 8Kb
-L’animale puo’ risultare contaminato da retrovirus
delle cellule helper
ANIMALI TRANSGENICI :
come si producono???
GFP
Vettori retrovirali
Microiniezione del DNA
Cellule staminali embrionali
Gene targeting/ gene trap
KO condizionali
Trasferimento del nucleo
YAC
2) MICROINIEZIONE del DNA
Gli organismi transgenici possono essere
ottenuti modificando cellule embrionali
totipotenti mediante iniziezione di materiale
genetico
Stimolazione della ovulazione delle femmine donatrici (da 5 a 35)
Dopo accoppiamento gli ovuli fertilizzati sono
microiniettati con DNA lineare contenente
il transgene (circa 200 copie)
all’interno del pronucleo maschile
Gli ovuli microiniettati (25-40) vengono impiantati
in una madre adotttiva resa pseudogravida da maschio
vasectomizzato. Dopo 3 settimane progenie e analisi.
Accoppiamento e analisi progenie per
capire se integrazione
è nella linea somatica o germinale
INIEZIONE DI DNA nel pronucleo maschile di un oocita appena fecondato. Più
precisamente, si depositano con una microsiringa 1-2 picolitri di DNA (circa 100200 copie del gene da inserire). A monte del gene (cDNA) da trasferire nel
pronucleo si utilizza una sequenza promotore che puo’ conferire al gene la
specificità di espressione in un particolare tessuto
Il gene inserito viene integrato nel genoma
della cellula uovo che viene trapiantata in una
madre adottiva , che darà origine alla nascita
di un topino “chimera” (mosaico di cellule con
patrimoni genetici diversi). Nella fase
successiva si effettua un incrocio riproduttivo
tra il topino chimera e un topo normale con la
nascita di topini con i nuovi geni ma
eterozigotici; solo nell’incrocio successivo tra i
precedenti avremo la nascita di topini
omozigotici per il gene introdotto
Promotore Introne
1
2 3
ATG
CDS
4
Poly-A
5
*
Iniezione di costrutti di espressione
lineari, che si integrano sotto forma di
concatameri a partire dai primissimi
stadi di sviluppo.
• Gli animali nati da questi esperimenti devono essere analizzati per mezzo
di Southern blotting o PCR per valutare se il transgene si è integrato e in
quante copie.
•Gli animali transgenici (founders e/o loro discendenza) vengono
successivamente analizzatati per valutare se il transgene si esprime in, ed
eventualmente gli effetti fenotipici della sua espressione
EFFICIENZA DELLA MICROINIEZIONE DEL DNA
Al max 5% degli ovuli inoculati
genera prole transgenica!!!
Utilizzo microiniezione del DNA
ANIMALI COME BIOREATTORI
Utilizzo microiniezione del DNA
ANIMALI COME BIOREATTORI
SVANTAGGI
-Integrazione casuale del transgene
-Integrazione multipla copia (effetto tossico?)
-Bassa efficienza (50 animali transgenici/1000 uova inoculate)
nonostante questo…
E’ IL METODO PIU’ UTILIZZATO
PER LA PRODUZIONE DI TOPI TRANSGENICI
ANIMALI TRANSGENICI :
come si producono???
GFP
Vettori retrovirali
Microiniezione del DNA
Cellule staminali embrionali
Gene targeting/ gene trap
KO condizionali
Trasferimento del nucleo
YAC
2) Cellule staminali embrionali (ES cells)
Le cellule ES sono cellule embrionali totipotenti,
infatti possono dare origine a cellule di tessuti
differenti. Le cellule ES vengono prelevate dalla
massa cellulare interna della blastocisti(cellula
embrionale indifferenziata) e mantenute in coltura
in presenza di cellule o fattori che ne impediscono
il differenziamento. In queste condizioni le cellule
ES mantengono intatta la loro capacità di
differenziarsi in modo appropriato in qualunque
tessuto, una volta reintrodotte in un embrione
• CALCIO FOSFATO
Il DNA a contatto con una soluzione di fosfato di calcio forma dei
precipitati i quali, con un meccanismo poco noto (probabilmente per
endocitosi) entrano nelle cellule
•
•LIPOSOMI
Lipidi che permettono la formazione di vescicole liposomiali
Il DNA all’interno entra nella cellula mediante fusione vesciola-membrana
•
Integrazione
Sito specifica
•ELETTROPORAZIONE
•
Scarica elettrica che altera la permeabilità della membrana generando
“buchi” e permettendo l’entrata di DNA esogeno
IDENTIFICAZIONE di ES CELLS con TRANSGENE
integrato nel sito corretto
SELEZIONE
POSITIVA/NEGATIVA
PCR
SELEZIONE POSITIVA-NEGATIVA cellule ES
Seq di DNA per RICOMBINAZIONE OMOLOGA nel genoma bersaglio
TRANSGENE di interesse
Gene che conferisce resistenza alla G418
Geni della Timidina Kinasi (virus herpes simplex). In presenza di GANCICLOVIR: MORTE
SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA
ASPECIFICA
SPECIFICA
1) Aggiunta di G418: SELEZIONE POSITIVA di cellule che hanno INTEGRATO il DNA
2) Aggiunta di GANCICLOVIR: SELEZIONE NEGATIVA di cellule con INTEGRAZIONE ASPECIFICA
METODO della SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA
non è infallibile ma ARRICCHISCE la popolazione delle ES cells
in elementi con TRANSGENE integrato nel sito CORRETTO
PCR
SPECIFICA
ASPECIFICA
Utilizzo ES cells:
DISTROFIA
Morbo di PARKINSON
SCLEROSI MULTIPLA
Patologie
neoplastiche
Patologie non
neoplastiche
Disordini
metabolici genetici
Leucemie mieloidi
acute
Aplasia midollare
grave
Mucopolisaccarido
si
Leucemie linfoidi
acute
Emoglobinuria
parossistica
notturna
Tesaurismosi
Leucemie mieloidi
croniche
Anemia di Fanconi
Altri disturbi
metabolici rari
Sindrome
mielodisplastica
Anemia di BlakfanDiamond
Linfoma non
Hodgkin
Talassemie
Linfoma di
Hodgkin
Anemia falciforme
Leucemia linfatica
cronica
Altre
emoglobinopatie
Mieloma Multiplo
Immunodeficienza
grave combinata
Leucemia a cellule
capellute
Osteopetrosi