TERAPIA GENICA
Cos’è la terapia genica?
Per terapia genica (Gene Therapy) si
intende l'inserzione di materiale genetico
(DNA) all’interno delle cellule al fine di
poter curare delle patologie. Questa
procedura di inserzione è nota come
transfezione.
La storia
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•
•
‘50-’60: il trasferimento genico in cellule animali
portava alla sintesi di proteine e di anticorpi
contro di esse.
’70-’80: nei primi test di terapia genica le proteine
sintetizzate a partire dai geni transfettati
venivano eliminate dal sistema immunitario.
’80: progressi nel campo della biologia
molecolare permettevano di modificare il DNA di
batteri e microrganismi in modo tale da indurli a
produrre determinate molecole. In seguito, gli
scienziati decisero di provare ad utilizzare le
mutazioni indotte per curare le malattie umane.
Caratteristiche perché sia
efficace:
Trasferimento
effettuato con
successo,
Durata
dell’espressione,
Assenza di reazioni
immunitarie,
Attenzione nella
procedura.
Tipologie di terapia genica:
Dalle cellule delle linea germinale
Dalle cellule della linea somatica:
• IN VIVO
• EX VIVO
EX VIVO
Si tratta della tipologia che
venne messa in pratica per
prima e consiste nel prelievo
delle cellule somatiche della
persona interessata. Esse,
successivamente, vengono
messe in cultura in laboratorio.
Durante questo tempo
vengono trasfettate con il gene
d’interesse, inserito tramite un
apposito vettore (spesso
virale), e successivamente
vengono reinfuse o
reimpiantate nel corpo del
soggetto. Tale procedura è
sicuramente la più lunga e la
più costosa delle due ma
permette di selezionare ed
amplificare le cellule
d’interesse ed inoltre gode
d’una maggior efficienza.
IN VIVO
Viene attuata in tutti quei
casi in cui le cellule non
possono essere messe in
cultura o prelevate o
reinfuse come quelle del
cervello o del cuore e della
maggior parte degli organi
interni. In questo caso il
gene d’interesse viene
inserito, tramite un
opportuno vettore,
nell’organismo direttamente
per via locale o sistemica.
Come ottenere il gene da
transfettare:
• Conoscendo la fisiopatologia della malattia
da curare, si selezionano i geni alterati e si
ricavano di conseguenza quelli terapeutici.
• Il gene viene isolato, amplificato e
sequenziato.
• Grazie alla biologia molecolare, si
costruiscono filamenti di DNA con il gene
in questione.
Tipologie di trasferimento:
1.
2.
3.
Il gene si integra nel genoma dell’ospite
e si trasmette alle cellule figlie (si usa
nelle malattie genetiche quando serve un
gene che si replichi in maniera stabile).
Il gene rimane nella cellula sottoforma di
particella episomiale, che quindi non
viene trasmessa alle cellule figlie ma si
manifesta codificando per proteine etc.
La particella episomiale viene associata
ad un’origine di replicazione, una
sequenza di DNA che permette
l’aggancio delle polimerasi cellulare, per
cui l’episoma viene trasmesso alle
cellule figlie.
Trasferimento genico
VIRALE
NON VIRALE
NON VIRALE
• Iniezione di DNA nudo;
• Inserimento tramite
liposomi (polimeri
cationici);
• Bombardamento tramite
particelle (gene gun).
DNA NUDO
• Vantaggi:facilità a produrlo in elevate
quantità ed a purificarlo;
• Svantaggi:è facilmente degradabile dalle
endonucleasi dell’ospite, l’efficienza di
trasformazione del DNA è relativamente
bassa.
LIPOSOMI
Sono vescicole lipidiche artificiali, dotate di carica positiva,
in grado di incorporare DNA a carica negativa (che viene
rilasciato nel citoplasma della cellula ospite, la quale in
seguito lo integra nel nucleo). Entrano nelle cellule per
endocitosi.
• Vantaggi:sono molto più sicuri dei vettori
virali, contengono molto materiale genetico,
perché transfettino una cellula questa non
deve essere per forza in divisione.
• Svantaggi: solo lo 0,1% del DNA viene
espresso.
GENE GUN
Consiste nell’utilizzo di
particolari strumenti
elettrici o ad alta
pressione, detti cannoni
genici (gene gun), che
permettono di inviare
nella cellula particelle
microscopiche d’oro o
di tungsteno ricoperte
da DNA. Al momento
non esistono studi
sull’uomo di questa
metodica ma solo su
animali.
VIRALE
I vettori virali devono avere determinate caratteristiche:
• Le particelle virali ricombinanti devono essere difettive rispetto
alla replicazione,
• Il virus non deve essere pericoloso,
• Deve esserci spazio a sufficienza per il gene terapeutico
(vincolo di dimensione).
I virus più studiati come possibili vettori da utilizzare nella terapia
genica sono:
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Retrovirus,
Adenovirus,
Lentivirus,
Virus adenoassociati,
Herpesvirus.
RETROVIRUS
Sono formati da due filamenti di RNA con un capside di proteine ed un
involucro lipidico. Grazie all’enzima trascrittasi inversa, a partire dal RNA si
ricava il DNA che poi si integra nel genoma dell’ospite grazie all’integrasi.
• Vantaggi: attitudine all’infezione di numerose linee cellulari, l’elevata
efficienza nell’integrazione del gene terapeutico nel genoma, che poi viene
trasmesso anche alle cellule figlie.
• Svantaggi: è complessa la procedura di purificazione
dal mezzo di coltura. Il genoma retrovirale, inoltre, si
può integrare in quello cellulare solo quando la
membrana nucleare è assente e di conseguenza solo
le cellule replicanti possono esser infettate. Un altro
problema deriva dal fatto che il gene virale si integra
nel genoma in modo relativamente casuale,
provocando inserzioni mutageniche con potenziale
danno alle cellule. Il vincolo di dimensione è stretto e
costa molto utilizzarli.
LENTIVIRUS
I lentivirus appartengono alla famiglia dei retrovirus di cui
condividono la morfologia ed il ciclo replicativo.
• Vantaggi: possono infettare anche cellule non replicanti
(perché passano attraverso la membrana nucleare), il
che li rende dei buoni candidati per modificare
l’espressione delle cellule a differenzizione terminale .
• Svantaggi: essendo facile che questi virus vadano
incontro a ricombinazione genetica, permane il rischio di
dare origine ad un virus infettante (è per questo che non
ci sono studi di lentivirus applicati all’uomo).
ADENOVIRUS
• Gli adenovirus sono patogeni naturali dell’uomo, con DNA a doppio
filamento, e che causano solamente il comune raffreddore.
• Vantaggi: infettano molti tipi di cellule con grande facilità, le infettano
anche se non sono in divisione, il DNA virale esiste come episoma e
non si inserisce quindi nel genoma delle cellule bersaglio (evitando
così il rischio di cancro).
• Svantaggi: rapida inattivazione delle cellule
infettate, inoltre avviene una perdita
progressiva dell’episoma per cui la sua
espressione risulta transitoria.
VIRUS ADENOASSOCIATI
Appartengono alla classe dei parvovirus, cioè piccoli virus a DNA che
necessitano della coinfezione con un adenovirus per potersi replicare. Gli
AAV si replicano come virus a DNA a doppio filamento, ma si
impacchettano come virus a DNA a filamento singolo. Si utilizzano, se non
modificati, perchè si integrano nel genoma bersaglio in uno specifico locus
del cromosoma 19, eliminando il rischio di inserzioni casuali.
• Vantaggi: non causano nessuna patologia nell’uomo,
per cui non ci sono reazioni immunitarie (e quindi i loro
effetti durano a lungo).
• Svantaggi: trasportano solo 4kb di geni, cioè la metà
rispetto agli adenovirus.
HERPESVIRUS
Non si integrano nel genoma dell’ospite, ma possono essere trattenuti
all’interno dei neuroni, in forma più o meno innocua, per tutta la vita
del paziente.
• Vantaggi: sono 5 volte più grandi degli
adenovirus, di conseguenza contengono
più geni; agiscono sulle cellule non in
divisione ed hanno un ampio spettro
d’infezione (quasi tutte le cellule dello
organismo).
RIASSUMENDO
PROBLEMI CHE SI
POSSONO PRESENTARE:
• Possono insorgere malattie
immunitarie in pazienti con il sistema
immunitario compromesso (anziani,
persone sottoposte alla chemio etc);
• Alcune mutazioni possono riattivare la
pericolosità del virus utilizzato (se si
utilizza), come vettore;
• Reazioni allergiche.
LA CURA DELLA EPIDERMOLISI BOLLOSA
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EB:devastante malattia genetica della pelle che provoca il distacco dello strato superficiale,
l’epidermide, da quello più profondo, il derma.
Ricercatori: Michele De Luca, Fulvio Mavilio
Un adulto di 36 anni, colpito dalla forma non letale di epidermolisi bollosa, chiamata giunzionale
(JEB), è stato arruolato per una sperimentazione clinica detta di fase I/II: uno studio pilota in cui
per la prima volta un nuovo trattamento viene somministrato a un paziente per cercare di curare
una malattia. Il risultato conseguito in questa fase consente di trarre indicazioni circa l’efficacia del
trattamento e, in caso positivo, fornisce elementi per le giuste dosi e per la stesura dei relativi
protocolli di somministrazione.
La malattia dipende da un difetto nel gene per la catena beta 3 della laminina 5, una proteina che
permette che l’epidermide si attacchi al derma e senza la quale la pelle si stacca con conseguenti
infiammazione e infezione.
Per la prima volta, cellule staminali provenienti dall’epidermide del paziente, prelevate con una
biopsia cutanea, sono state corrette geneticamente mediante l’inserimento di un vettore retrovirale
della versione sana del gene “malato” (terapia genica), e fatte crescere in laboratorio. La crescita
è stata seguita fino a ottenere nove lembi di epidermide, sufficientemente grandi da poter essere
trapiantati su due zone delle gambe del malato.
Il mantenimento della nuova epidermide dipende dalla presenza di cellule staminali
geneticamente corrette che garantiscono il rinnovo del tessuto.
“È la prima volta che una malattia genetica della pelle viene curata grazie a un intervento che
unisce la terapia genica alla terapia cellulare. Dopo aver concluso questo studio clinico, il
prossimo passo sarà estendere questo trattamento ad altre malattie genetiche della pelle e a
malattie di altri epiteli, come per esempio le distrofie corneali, malattie invalidanti che portano a
cecità”.
LA CURA DELLA SCID
• SCID=Sindrome da immunodeficienza grave combinata
• Legata ad un gene recessivo mutato per cui non vengono
sintetizzate correttamente le proteine necessarie alla maturazione
dei globuli bianchi.
• Gli individui affetti da SCID, nelle prime settimane di vita non
presentano sintomi (si sviluppano dopo 3-6 mesi).
• Trapianto di midollo osseo da un donatore compatibile. Vista la
mancanza di un sistema immunitario nell'ospite, non vi è il problema
del rigetto.
• Graft-versus-host disease
• Difficile trovare donatori compatibili;
• Infusioni mensili di anticorpi;
• Ingegnerizzare le cellule del paziente stesso
• L’ada-scid è stata sconfitta. Altri tipo no, forse a causa dell’uso di
vettori virali si sono sviluppati casi di leucemia.
PROGETTI FUTURI:CREAZIONE DI
BIOREATTORI
Le cellule che esprimono le proteine
terapeutiche vengono fatte crescere in coltura in
un dispositivo impiantabile nel corpo del
paziente. Questo permette alle sostanze
nutritive di entrare per garantire la crescita
cellulare ed alla proteina ricombinante di
diffondersi in circolo, mentre le cellule impiantate
sono difese dal sistema immunitario degli ospiti.
GLOSSARIO
• Episoma: un elemento genetico che può
integrarsi in un cromosoma mediante un
processo di ricombinazione.
• Liposoma: particolare conformazione che
una particella contenente grasso e fosforo
assume in una soluzione acquosa.
• Cationico: caricato positivamente
• KB: unità di misura utilizzata in genetica
corrispondente a 1000 nucleotidi