Cos’è la terapia genica
Per terapia genica si intende l'introduzione di un gene che ha come effetto quello di
prevenire o correggere una condizione patologica.
Tipi di terapia genica
 Somatica:
Manipolare l’espressione genica in cellule del paziente, permettendo di trasferire tale
mutazione alla progenie
 Germinale:
modificare geneticamente le cellule germinali per trasferire il cambiamento alla progenie
Strategie terapeutiche
• Compensare una mutazione che causa la perdita di una funzione cellulare
(sostituzione del gene perso o difettivo) ad esempio in patologie autosomiche
recessive o autosomiche dominanti caratterizzate da aploinsufficienza)
• Sostituire/inattivare una mutazione negativa dominante
(sostituire il gene dominante nel suo locus o degradare selettivamente il suo RNA)
Strategie terapeutiche
• Uccisione diretta di cellule patologiche (in genere tumorali)
• Uccisione di cellule patologiche mediata dal sistema immunitario (tumori)
Il vettore
• Per trasferire il transgene nella cellula bersaglio è necessario disporre di un
sistema in grado di veicolarvi all’interno il DNA, cioè un VETTORE.
• Un vettore efficiente deve:
 Essere selettivo
 Entrare facilmente nelle cellule-target
 Essere esprimibile in elevate quantità
 Essere sicuro
• Esistono due grandi categorie di vettori che consentono il trasferimento genico:
 Vettori non virali: si basano sull’uso di DNA, da solo o complessato a molecole
che ne facilitino l’ingresso nella cellula.
 Vettori virali: si basano sull’utilizzo di virus opportunamente modificati in modo tale
da poter veicolare il loro genoma all’interno delle cellule bersaglio, senza dare
malattia.
VETTORI VIRALI
• I virus hanno un'ottima tendenza ad infettare le cellule ed ad inserirvi il proprio
DNA sia integrandolo sia sotto forma d'episoma.
• Rispetto ai sistemi di trasferimento non virali, quindi, hanno un'efficienza
nettamente maggiore.
• I virus attualmente studiati quali vettori per la terapia genica sono
Retrovirus
Adenovirus
Virus AdenoAssociati
• Si ottengono inserendo il gene di interesse nel genoma di diversi tipi di virus, sotto
il controllo di un promotore forte.
• Il virus viene reso incapace di riprodursi autonomamente, per evitare la diffusione
di virus ricombinanti (virus difettivo). A tal scopo molti geni virali dei vettori sono
rimossi e sostituiti dal gene bersaglio e da elementi regolatori
Clonaggio con doppia digestione
EcoRI HindIII
GAATTC AAGCTT
CTTAAG TTCGAA
G
AGCTT
CTTAA
A
pShuttle
pShuttle
DNA ligasi
AATTC
G
A
TTCGA
EcoRI
HindIII
GAATTC
GAATTC
CTTAAG
CTTAAG
AAGCTT
AAGCTT
TTCGAA
TTCGAA
Gene target
pShuttle
+
Gene target
Vettori virali
Virus difettivi: possono essere prodotti solo grazie a
particolari linee cellulari capaci di complementare i difetti del
virus. La loro preparazione deve seguire queste fasi obbligate:
1. Costruzione del genoma ricombinante
2. Trasfezione del DNA nella linea cellulare capace di
produrre le particelle virali (linee di packaging)
3. Raccolta e analisi del virus
Vettori virali:
caratteristiche principali
• Retrovirus : Sono stati i primi virus ad essere studiati per la terapia genica. Possono
infettare solo cellule in divisione e si integrano stabilmente in maniera casuale.
• Lentivirus : derivati del virus dell'HIV, possono infettare cellule quiescenti e si
integrano stabilmente in maniera casuale.
• Adenovirus: Sono espressi ad alti livelli, non si integrano stabilmente e danno
grosse reazioni immunitarie.
• Virus adeno-associati (AAV): integrazione sito specifica ed espressione stabile nel
tempo, difficile produrli ad alto titolo. Non causano patologie.
Retrovirus
• I retrovirus presentano due filamenti di RNA complessati con varie proteine, un
capside ed un involucro lipidico (envelope). Possiedono una funzione di trascrittasi
inversa, capace di sintetizzare una forma di DNA complementare che può integrarsi nel
DNA cromosomico.
• Il genoma tipico contiene tre geni:
– gag: codifica per le proteine strutturali
– pol : codifica per gli enzimi trascrittasi inversa,
proteasi e integrasi
– env: codifica per le proteine di membrana
– Psi (ϕ): Sequenza necessaria per il packaging (impacchettamento)
• Ad ognuna delle due estremità esiste un segmento di DNA, formato dalle unità
ripetitive terminali o LTR.
Queste unità LTR agiscono come promoter, regolando l’espressione dei geni virali ed
inoltre permettono al virus di integrare il proprio genoma entro i cromosomi delle cellule
infettate.
• I vettori retrovirali possono veicolare inserti di DNA lunghi sino a 8kb.
Ciclo vitale di un Retrovirus
• Il retrovirus si lega a specifici recettori situati sulla membrana cellulare della cellula
ospite (il recettore CD4 della superficie cellulare e recettore delle chemochine a sette
domini transmembrana associato a G protein).
• Si ha quindi la fusione dell’involucro lipidico virale con quello della cellula, e il virus
viene rilasciato nel citoplasma e l’RNA viene liberato
dall’involucro capsidico.
• L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNA
in DNA a doppio filamento nel citoplasma
della cellula infetta.
• Il DNA lineare migra nel nucleo e viene
integrato nel DNA della cellula ospite
mediante l’enzima integrasi prodotto
dal virus. Il DNA integrato è chiamato
provirus.
• L’apparato della cellula ospite trascrive
il provirus producendo RNA virali che saranno
incapsidati nei nuovi virioni.
Vettori retrovirali difettivi per replicazione
Linea cellulare di packaging: Fibroblasti 3T3 murini
Virus difettivo integrato
LTR Gag
Pol
Env Psi -
Plasmide
LTR Gene Psi +
Virus difettivo integrato
LTR Gag
LTR
Pol
Gene
Env Psi -
Psi +
Particelle virali
ricombinanti
Lentivirus
• I Lentivirus sono una sotto-classe di retrovirus di cui condividono la morfologia ed
il ciclo replicativo ma a differenza dei precedenti, possono infettare ed integrarsi
anche in cellule quiescenti
• Hanno una struttura più complessa:
– oltre ai geni gag, pol ed env, il genoma contiene due geni regolatori , tat e rev
essenziali per il controllo dell’espressione genica, ed un numero variabile di geni
accessori.
• Derivano dal virus dell'HIV opportunamente modificato per garantire la sicurezza
del ricevente.
I Retrovirus nella terapia genica
Vantaggi
• Il DNA del vettore si integra stabilmente nel genoma
• Il gene terapeutico viene trasmesso alle cellule figlie in seguito a divisione
cellulare.
Limiti
• L’infezione delle cellule richiede la replicazione cellulare, cosa che esclude il loro
utilizzo nella cura delle patologie che interessano i tessuti non in divisione come
quelle del sistema nervoso.
• Si integrano nel genoma cellulare in modo relativamente casuale, provocando
inserzioni mutageniche con potenziale danno alle cellule
• La loro produzione è estremamente costosa
• La semplice iniezione dei vettori retrovirali non è sufficiente per una terapia genica
in vivo, perchè essi vengono uccisi dal sistema Immunitario umano mediante
l'attivazione del complemento.
Adenovirus
• L’adenovirus è un patogeno naturale dell’uomo con un genoma a DNA a doppio
filamento.
• Ad oggi se ne conoscono ben 51 sierotipi, in grado di infettare 6 diverse specie,
causando un’ampia gamma di patologie diverse, da malattie respiratorie a
congiuntiviti, a gastroenteriti.
• I vettori adenovirali possono essere prodotti con titoli elevatissimi e solitamente
accettano inserti grandi sino a 7-8kb.
• L'ingresso nelle cellule avviene mediante endocitosi mediata da recettori,
ma il DNA inserito non sembra integrarsi e quindi l'espressione dei geni inseriti può
essere mantenuta solo per brevi periodi.
• Può infettare molti tipi di cellule
Struttura
•
Tutti gli adenovirus hanno una simmetria
icosaedrica
•
Essi sono composti da 252
capsomeri di cui 240 esoni
e 12 pentoni al vertice dell’icosaedro
•
Una glicoproteina (Fibra) protrude dal centro
del pentone. Essa è responsabile dell’attacco
del virus al recettore della cellula ospite.
Genoma
Il genoma degli adenovirus è apprissimativamente di 36 kb
Sono individuabili regioni codificanti per geni espressi precocemente (early, E) e
tardivamente (late, L).
Ai due lati del genoma
VA
si trovano le cosiddette
ITR Y E1A/B
E2B
sequenze terminali
invertite (ITR, Inverted
L1 L2 L3
Terminal Repeat) le quali
sono necessarie per la replicazione del virus.
genoma virale
E3 E4 ITR
L4
L5
Nel nucleo cellulare vengono espressi per primi i geni E1 (detti precoci immediati) che
permettono la transattivazione dei geni E2 ed E4 che determinano il blocco della
sintesi proteica cellulare e partecipano alla replicazione del DNA virale.
Una volta che è iniziata la replicazione, vengono attivati i geni tardivi che codificano
per le proteine strutturali che nel nucleo cellulare si assemblano intrappolando il DNA
dell'adenovirus virale.
Ciclo vitale di un Adenovirus
• Il legame dell’adenovirus alla superficie cellulare avviene in due fasi:
- Le proteine della fibra virale interagiscono con il recettore CAR
(recettore degli adenovirus coxsackie).
- La regione RGD del pentone interagisce con alcune integrine di membrana
(53 o 55)
• Il legame promuove
l’internalizzazione per
endocitosi mediata da
recettore in una vescicola
ricoperta da clatrina.
• Il virus lisa la vescicola
endosomiale
Cell membrane
CAR
Integrin
Receptor-mediated endocytosis
lysosome
Endosomal escape
• il capside rilascia il genoma
a DNA nel nucleo.
Nucleus
Microtubules
Cytoplasmic transport
Dynein
Viral gene
transcription
VETTORI ADENOVIRALI
• Inserimento del gene terapeutico mediante ricombinazione omologa
(quantità massima di DNA trasportato : 8 kb)
• Gli adenovirus ricombinanti usati come vettori presentano una delezione almeno
della regione E1 il che rende il virus difettivo per la replicazione
ITR Y E1A/B
VA
E2B
L1 L2 L3 L4
transgene
ITR Y E1A/B
ITR Ytransgene
VA
E2B
L1 L2 L3 L4
E3
E4
L5
ITR
genoma virale
vettore navetta
ricombinazione
genoma virale
E3
E4
L5
ITR
vettore adenovirale
VETTORI ADENOVIRALI
Generalmente gli adenovirus ricombinanti presentano una delezione sia della
regione E1 che di quella E3.
Si è visto, però, che talune cellule infettate da questo vettore esprimono i geni
rimanenti in quantità basse, ma sufficienti ad evocare una risposta citotossica in
grado d'eliminarle.
Studi successivi hanno permesso d'ottenere vettori ricombinanti aventi anche una
delezione delle regioni E2 o E4 ma ciò ha determinato una riduzione dell'espressione
genica.
VETTORI ADENOVIRALI HD
Attualmente si è ottenuta una terza generazione di vettori ricombinanti (Helper
Dependent o anche high Capacity) in cui tutti i geni virali sono stati eliminati
e sono rimaste solamente le regioni ITR e la sequenza di packaging a fianco del gene
d'interesse.
La produzione di questo tipo di virus utilizza cellule trasfettate stabilmente con E1 ed una
ricombinasi chiamata CRE, che è in grado di tagliare il segnale di impacchettamento del
virus helper contente tutti i geni virali tranne E1,
e che ha la funzione di provvedere alla
loxP
Y
trascrizione di tutte le proteine del capside
promoter transgene
vettore navetta
del vettore helper dependent.
VA
ITR
Il virus helper al contrario non può
impacchettarsi in quanto mancante
del segnale di impacchettamento
poiché exciso dalla proteina CRE.
Y
genoma virale plasmidico
E2A/B
E4
L1 L2 L3 L4
L5
ITR
ricombinazione in cellule 293
ITR
Y
VA
promoter transgene
E2A/B
E4
L1 L2 L3 L4
L5
taglio mediato da Cre
ITR
Y
E2B
promoter transgene
ITR
ITR
Gli Adenovirus nella terapia genica
Vantaggi
• Largo numero di tipi cellulari bersaglio ed alta efficienza .
• Non richiede che la cellula ospite sia in divisione.
• Il DNA virale esiste come episoma e non si incorpora stabilmente nel genoma delle
cellule bersaglio, eliminando così il rischio di cancerogenesi.
Limiti
• Rapida inattivazione delle cellule infettate dall’adenovirus.
• Avviene una progressiva perdita dell’episoma che porta generalmente ad una
espressione transitoria.
Virus Adeno-associato (AAV)
• I virus adeno-associati sono virus umani non patogeni che appartengono alla
classe dei parvovirus (piccoli virus a DNA a singolo filamento).
• Il virione è molto piccolo e privo di un involucro lipidico.
• Le ridotte dimensioni del virione non permettono l’inserimento di DNA esogeno
di lunghezza superiore a 4 Kb e questo comporta notevoli limitazioni al loro
utilizzo.
• Ad oggi ne sono stati descritti 11 sierotipi, in grado di infettare cellule di diversi
tessuti, anche non attivamente proliferanti.
Struttura
Il loro genoma è costituito da un singolo
filamento di DNA costituito da due geni:
Rep che codifica per le proteine implicate
nella replicazione e nell'integrazione
Cap per le proteine del capside.
A ciascuna estremità vi è una sequenza
regolatoria terminale ripetuta, ITR
(inverted terminal repeats), di
145bp contenente un promotore.
Quando tale virus viene utilizzato come vettore, i due geni rep e cap vengono
sostituiti con il gene di interesse e le regioni regolatrici ad esso correlate.
Ciclo vitale di AAV
Gli AAV sono incapaci di replicare autonomamente:
Il loro ciclo vitale richiede la presenza di un virus di dimensioni superiori (virus helper),
quasi sempre un adenovirus o un herpes virus.
In assenza del virus helper, l’AAV si integra in una regione ben precisa sul cromosoma
19 ed esprime i suoi geni a livelli molto bassi, infettando la cellula in modo latente.
Se questa cellula viene poi infettata da un virus “helper”, il genoma dell’AAV viene
estratto dal DNA genomico e replicato, le proteine virali vengono prodotte ad alti livelli,
avviene l’assemblamento delle particelle virali e il loro rilascio.
Il vettore basato sui virus adenoassociati
ricombinanti è costruito sostituendo il gene
terapeutico a cap e rep. La produzione d'un
simile vettore la si ottiene trasfettando una
linea cellulare (HEK293) con un plasmide
contenente i geni cap e rep e
Successivamente infettandola con un
adenovirus helper difettivo per E1.
I Virus AdenoAssociati nella terapia genica
Vantaggi
• Non causano infiammazioni e non sono responsabili di nessuna patologia che colpisca
l’uomo.
• Mancanza di reazioni immunitarie → questi virus danno luogo ad un'espressione
genica a lungo termine e con un elevato grado di sicurezza.
• Normalmente il virus non modificato si integra nel genoma della cellula bersaglio ad
uno specifico locus del cromosoma 19, eliminando così il rischio di inserzioni casuali.
Limiti
• Hanno una ridotta capacità a trasportare geni estranei (solo 4 kb, la metà rispetto agli
adenovirus).