Istruzioni per l'uso + Famiglia Dynal AllSet ™ e + CombiSet ™ SSP 0088 ISTRUZIONI PER L'USO Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP SOMMARIO Pagina USO PREVISTO…………………………………………………………………………..…… 3 RIEPILOGO E SPIEGAZIONE…….........………………...…………………………..…… 3 PRINCIPI DELLA PROCEDURA …………………………………...............………….. 3 REAGENTI................................................................................................................... Reagenti inclusi nel kit di tipizzazione……………….……………………….….…. Conservazione …………………………………………………………………..……. 4 4 4 AVVERTENZE E PRECAUZIONI ………………………………………………………… 5 MATERIALE RICHIESTO NON FORNITO DA DYNAL BIOTECH….…….…………… 5 PROCEDURA ...........……………………………….....………….........……………………. Raccolta e Preparazione dei Campioni.......................……………….........… Preparazione dei Reagenti per la PCR........…………........………............…. Amplificazione……....................................………………..………..........….… Analisi delle reazioni di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio ..……. 6 6 6 8 9 LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA ...............................................……........….....…… 10 RISULTATI ATTESI…………………………………………………………….……………… Controllo di Qualità ..…………………....................……………….............… Controllo Interno ..…………………………………………………………………. Interpretazione dei Risultati ............................…................………....…...… Interpretazione mediante Dynal SSPTool™ ….……………………………….. 10 10 10 11 11 GUIDA ALLA RISOLUZIONE DEI PROBLEMI ...…..........................……….............. 12 BIBLIOGRAFIA ..................…………………….….......…………...….......…..........…...... 13 GARANZIA ………………………………………………………………………….…………. 14 MARCHI DI FABBRICA UTILIZZATI NEL PRESENTE DOCUMENTO/PRODOTTO … 14 BREVETTI UTILIZZATI NEL PRESENTE DOCUMENTO/PRODOTTO ..…………..….. 14 CONTATTI .....................................................................................................…………. 15 Pagina 2 di 15 ISTRUZIONI PER L'USO Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP Per uso diagnostico in vitro USO PREVISTO Tipizzazione del DNA degli alleli HLA di Classe I o Classe II. RISOLUZIONE Kit a bassa risoluzione: La tipizzazione degli alleli viene eseguita a livello generico, o del gruppo allelico, che in genere corrisponde alle specificità definite sierologicamente. Kit ad alta risoluzione: O kit di subtipizzazione, forniscono una genotipizzazione ad alta risoluzione o a livello di allele . RIEPILOGO E SPIEGAZIONE Quasi tutte le metodiche di tipizzazione tissutale basate sul DNA utilizzano la tecnica PCR1 per l'amplificazione del locus HLA da analizzare. Nella maggior parte delle metodiche per la tipizzazione tissutale basate sul DNA la tecnica di PCR è impiegata per la fase di amplificazione, prima cioè della tipizzazione effettiva, con lo scopo di aumentare la quantità di DNA bersaglio. Il processo di tipizzazione HLA richiede quindi una fase di post-amplificazione finalizzata alla discriminazione allelica. A differenza di altri metodi basati sulla PCR, la tecnica SSP2,3,4,5utilizzata da Dynal Biotech Ltd per gli AllSet+™ e CombiSet+™ SSP discrimina i diversi alleli nel corso del processo stesso della PCR. Ciò consente di abbreviare il tempo di analisi dei risultati post-amplificazione riducendolo ad una semplice fase di rivelazione mediante gel-elettroforesi. PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il metodo SPP Dynal è una tecnica basata sulla PCR che impiega Sequence Specific Primers (SSP), cioè Primer Sequenza Specifici, per la tipizzazione tissutale basata sul DNA. I prodotti Dynal SSP sono costituiti da miscele diverse di primer, in cui ciascuna miscela contiene una o più coppie specifiche di primer, vale a dire i primer specifici per un allele e/o un gruppo allelico, oltre ad una coppia di primer di controllo per le sequenze non alleliche nel campione. La coppia di primer di controllo ha la funzione di controllo interno della PCR e quindi di verifica dell'efficienza delle amplificazioni. Il metodo Dynal SSP si basa sul principio che un primer perfettamente corrispondente potrà essere utilizzato con maggiore efficienza nella reazione PCR rispetto ad un primer che presenta uno o più mismatch all'estremità 3’. La specificità della tipizzazione rientra nella fase di amplificazione e il processo di elaborazione dei risultati dopo l’amplificazione è ridotto al minimo. L'assegnazione degli alleli consiste semplicemente nel constatare se si è verificata o meno l'amplificazione, cioè nel visualizzare l'amplificazione mediante elettroforesi su gel di agarosio. La tecnica PCR-SSP assicura un elevato grado di risoluzione, in quanto ciascuna coppia di primer identifica due siti polimorfici in cis. Il metodo ha un livello elevato di sensibilità, specificità e riproducibilità. Pagina 3 di 15 ISTRUZIONI PER L'USO Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP REAGENTI Reagenti inclusi in tutti i kit Dynal AllSet+™ SSP o CombiSet+™ SSP Articolo Descrizione 1. Vassoi PCR con miscele di primer SSP disidratati pre- aliquotati Ciascuna provetta del vassoio per la PCR contiene una miscela disidratata di SSP composta da primer specifici per un allele e/o un gruppo allelico e una coppia di primer di controllo per le sequenze non alleliche. La coppia di primer di controllo amplifica un gene presente in tutti i campioni. 2. Tappi Tappi per la chiusura ermetica dei vassoi per la PCR N. di reazioni di PCR per 3. Master Mix (il numero di flaconi compresi nei kit dipende dal numero di reazioni di PCR per test – ved. tabella corrispondente) No. di flaconi di Master Mix inclusi nei kit (tutti da 1,8 ml) 1-9 1 10-20 2 21-40 3 41-95 4 96 5 Concentrazione 1x pronta all'uso. La Master Mix è stata ottimizzata per l'impiego con la DNA polimerasi AmpliTaq® (Roche Molecular Systems, Inc.) Informazioni sulla formulazione sono disponibili all'indirizzo [email protected] 4. Istruzioni per l'uso del prodotto/Opuscolo informativo sul lotto specifico del prodotto Istruzioni per l'uso e opuscolo informativo sul lotto specifico del prodotto (BSPI). 5. Foglio di Lavoro per Interpretazione Modulo di registrazione delle reazioni positive ottenute con le diverse miscele di primer. Conservazione 1. I vassoi per la PCR e la Master Mix devono essere conservati a 2-8˚C. 2. Non congelare i reagenti 3. Se conservati in modo corretto, reagenti e miscele di primer sono stabili fino alla data di scadenza indicata nell'opuscolo informativo allegato ad ogni prodotto. Pagina 4 di 15 ISTRUZIONI PER L'USO Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Per uso diagnostico in vitro Per l’esecuzione dei test con i kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP è necessario attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle linee guida stabilite ad es. negli standard EFI, nelle direttive CPA o in altre direttive locali. Avvertenza - Rischio biologico: Manipolare tutti i campioni come potenzialmente in grado di trasmettere malattie. Eseguire tutte le operazioni indossando guanti e protezioni adeguate. Avvertenza - Rischio biologico: Per la preparazione dei campioni utilizzare sempre provette con tappo a vite, al fine di evitare fuoriuscite e potenziali casi di contaminazione. Avvertenza - Rischio biologico: Tutti i campioni devono essere manipolati come potenzialmente infettivi utilizzando procedure di laboratorio sicure come quelle indicate in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories6 e nel documento NCCLS M29-T7. Pulire e disinfettare con cura tutte le superfici di lavoro utilizzando candeggina (NaClO) all'1%. Sterilizzare in autoclave qualsiasi apparecchiatura o materiale che sia entrato in contatto con campioni clinici prima di procedere allo smaltimento. Avvertenza - Rischio biologico: Il bromuro di etidio utilizzato per la colorazione del DNA è un potenziale agente cancerogeno. Durante l'impiego di gel colorati e bromuro di etidio, indossare sempre guanti in nitrile. Cautela: Indossare una protezione anti-UV per gli occhi e non guardare direttamente la fonte di luce UV a occhio nudo durante l'analisi o la fotografia dei gel. Cautela: Le pipette utilizzate per le operazioni post-PCR non devono essere utilizzate per le operazioni pre-PCR. Cautela - Contaminazione: Evitare la contaminazione batterica dei reagenti durante il prelievo di aliquote dalle provette dei reagenti. Indossare sempre i guanti per evitare qualsiasi rischio di contaminazione dei campioni. Si consiglia di utilizzare pipette e puntali con filtro monouso e sterili. Non utilizzare reagenti con evidenti tracce di torbidità o contaminazione batterica. Cautela - Smaltimento: Smaltire i reagenti non utilizzati e le sostanze di scarto in conformità con le normative comunitarie, nazionali, regionali e locali. La scheda dei dati di sicurezza dei materiali (MSDS) è disponibile per il download all'indirizzo www.tissue-typing.com oppure su richiesta presso il rappresentante locale di Dynal Biotech (Ved. i numeri di telefono elencati nell'ultima pagina del presente inserto.) MATERIALE RICHIESTO NON FORNITO DA DYNAL BIOTECH: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Pipette calibrate per uso manuale (ad es. Eppendorf, Gilson) Puntali con filtro per pipette sopra indicate Vortex Microcentrifuga Vassoio per la conservazione delle microprovette di PCR Perkin-Elmer GeneAmp® 9600 o 9700 o qualsiasi altro amplificatore approvato con specifiche equivalenti Piastra scaldante/forno a microonde per la preparazione dei gel di agarosio Apparecchiatura per elettroforesi (ad es. ABgene Electro-Fast® Stretch 108 Complete, AB0708) Transilluminatore UV Sistema di documentazione per immagini/macchina fotografica per i gel Taq polimerasi ricombinante (Dynal raccomanda AmpliTaq®) Agarosio per gel Bromuro di etidio Pagina 5 di 15 ISTRUZIONI PER L'USO Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP PROCEDURA NOTA: Questa procedura deve essere eseguita in due aree distinte del laboratorio (pre-amplificazione e post-amplificazione) come indicato nelle istruzioni seguenti. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Attenzione: Manipolare tutti i campioni come potenzialmente in grado di trasmettere agenti infettivi. a) b) c) d) e) f) NON UTILIZZARE SANGUE IN EPARINA8 Il DNA può essere estratto da cellule nucleate umane utilizzando il metodo di preferenza Per ottenere risultati ottimali di amplificazione e di tipizzazione utilizzare DNA con un elevato grado di purezza (rapporto OD 260:280 compreso tra 1,6 e 1,8). La concentrazione finale del DNA prima della PCR deve essere di circa 50 ng/µl Il DNA estratto deve essere diluito in dH20 Il DNA può essere conservato a -20°C o a temperature inferiori per periodi più prolungati (> 1 anno) senza influire sulla qualità dei risultati. Se conservato a +4° per lunghi periodi il DNA si degrada, dando luogo ad una maggiore quantità di artefatti, come ad esempio amplificazioni non specifiche. PREPARAZIONE DEI REAGENTI PER LA PCR (eseguita nell'area di pre-amplificazione) Per eseguire una singola tipizzazione preparare la seguente miscela di PCR. Per i volumi necessari (in funzione del numero di reazioni di PCR per test), consultare la tabella riportata nella pagina seguente. • • • Master Mix DNA del campione (50 ng/µl) AmpliTaq® DNA polimerasi (5 u.i./µl ) • • Miscelare accuratamente Dispensare 10 µl della miscela PCR in ciascuna provetta della piastra Dynal AllSet+™ o CombiSet+™ SSP Apporre i tappi e chiudere accuratamente in modo da sigillare perfettamente le provette. Si possono utilizzare chiudiprovette appositi. È inoltre possibile utilizzare le apposite pellicole sigillanti. I campioni sono ora pronti per l'amplificazione. Conservare i reagenti del kit di tipizzazione non utilizzati a 2-8˚C • • Pagina 6 di 15 ISTRUZIONI PER L'USO Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP Tabella per la Preparazione della Miscela di PCR: Reazioni di PCR per test Master Mix (µl ) DNA (µl ) AmpliTaq® (µl ) 1 4 6 8 10 32 48 64 80 96 7.6 11.4 15.2 19.0 22.8 0.32 0.48 0.64 0.80 0.96 12 14 16 18 20 112 128 144 160 176 26.6 30.4 34.2 38.0 41.8 1.12 1.28 1.44 1.60 1.76 22 24 26 28 30 208 224 240 256 272 49.4 53.2 57.0 60.8 64.6 2.08 2.24 2.40 2.56 2.72 40 42 44 46 48 352 384 400 416 432 83.6 91.2 95.0 98.8 102.6 3.52 3.84 4.00 4.16 4.32 96 864 206.0 9.00 NOTA: Le reazioni di PCR in numero dispari non vengono riportate nella tabella, fare riferimento al numero pari successivo (ad es., nel caso di un test con 13 reazioni di PCR fare riferimento ai volumi indicati per 14 reazioni di PCR). Pagina 7 di 15 ISTRUZIONI PER L'USO Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP CONFIGURAZIONE DEL VASSOIO L’orientamento corretto del vassoio è assicurato dalla miscela di primer della provetta numero uno (identificata anche dalla presenza di un colorante blu), contrassegnata dal numero di lotto stampato di lato. e.g HLA-X 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 QUALSIASI ALTRO NUMERO STAMPATO SUL VASSOIO IN PLASTICA, AD ES. 1, 2, 3, DEVE ESSERE IGNORATO AMPLIFICAZIONE (eseguita nell'area di post-amplificazione) 1. Collocare il vassoio AllSet+™ o CombiSet+™ SSP nel termociclatore Impostare i seguenti parametri: Fasi Temperatura (˚C) 96 Tempo (sec.) 120 10 cicli 96 65 15 60 20 cicli 96 61 72 10 50 30 Denaturazione Azione Denaturazione Denaturazione Allineamento Estensione Denaturazione Allineamento Estensione Per informazioni specifiche sul termociclatore fare riferimento al manuale del produttore 2. 3. Dare inizio al programma A programma ultimato togliere i campioni dal termociclatore NOTA: Non portare il DNA amplificato nell'area di pre-amplificazione. Pagina 8 di 15 ISTRUZIONI PER L'USO Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP ANALISI DELLE REAZIONI DI PCR MEDIANTE ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO Nota: Si raccomanda di utilizzare lo stesso tampone per la preparazione del gel e del tampone di corsa; ciò significa che se si utilizza TBE 0.5x per il gel è necessario utilizzare TBE 0.5x anche come tampone di corsa. 1. Preparare un gel di agarosio al 2% (p/v) (ad es.ABgene MultiABgarose, AG-0100c) in tampone TBE 0.5x a) Far sciogliere l'agarosio (2 g/100 ml di tampone TBE 0.5x) mediante ebollizione nel forno a microonde fino al completo scioglimento • Lasciarlo raffreddare a 60˚C. • Aggiungere bromuro di etidio alla concentrazione finale di 0.5 µg/ml di gel b) Versare il gel nell’apposito vassoio in modo da ottenere 3-4 mm di spessore e pozzetti profondi 3 mm. • Lasciare solidificare per almeno 15 minuti. 2. a) Trasferire il gel di agarosio nella cella elettroforetica. Il gel deve essere coperto da TBE 0.5x per almeno 1-2 mm. • Rimuovere con cautela il pettine • Caricare in sequenza tutto l’amplificato di ogni reazione in ogni pozzetto del gel 3. Far correre i gel nel tampone TBE 0.5X Far correre i minigel (gel con una distanza <10 cm tra i due elettrodi) per 10 minuti a 15 V/cm, i gel più grandi per 15 minuti a 10 V/cm. Per calcolare il voltaggio misurare la distanza (in centimetri) tra gli ELETTRODI della cella elettroforetica (la lunghezza del gel NON È IMPORTANTE). 4. Esaminare il gel al transilluminatore UV e scattare la fotografia. 1. Lo stesso tampone TBE 0.5x può essere utilizzato più volte anche se l'impiego del tampone fresco aumenta la nitidezza dei segnali. AVVERTENZA: Il bromuro di etidio è un potente agente mutageno. Indossare guanti in nitrile e proteggere adeguatamente gli occhi durante la manipolazione dei gel o delle soluzioni contenenti bromuro di etidio. Pagina 9 di 15 ISTRUZIONI PER L'USO Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA 1. L'elevata sensibilità analitica della PCR rende necessario procedere con estrema cautela al fine di preservare la purezza dei reagenti del kit o delle miscele di amplificazione. Assicurarsi che il flusso di lavoro all'interno del laboratorio sia unidirezionale e che gli ampliconi della PCR non vengano portati nell'area di preparazione dei reagenti per la PCR. La purezza dei reagenti può essere preservata solo attenendosi alle Buone Pratiche di Laboratorio. I risultati attesi possono essere garantiti se si osservano rigorosamente le procedure descritte nel presente inserto. 2. I prodotti Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ sono stati sviluppati utilizzando esclusivamente campioni di sangue intero non eparinato o campioni di DNA purificati. Non sono stati valutati risultati con altre tipologie di campioni. 3. Il campione di DNA costituisce lo stampo per il processo di amplificazione e la sua qualità deve rientrare nei valori indicati sia in termini di purezza che di concentrazione. 4. Con questi prodotti è possibile utilizzare qualsiasi termociclatore approvato , a condizione che le specifiche dello strumento siano equivalenti a quelle dello strumento Perkin-Elmer GeneAmp® PCR 9600 o 9700. 5. Verificare che tutti gli strumenti e le apparecchiature siano calibrati in base alle specifiche del produttore. RISULTATI ATTESI Controllo di Qualità Il Controllo di Qualità e l'aggiornamento dei prodotti per la tipizzazione tissutale basata sul DNA sono estremamente importanti. Gli oligonucleotidi di sintesi devono essere sottoposti a numerosi test con DNA di linee cellulari note. Le soluzioni dei primer devono essere testate con DNA positivi e negativi con sequenze molto simili. La procedura del controllo di qualità si svolge nel modo seguente: • Test dei primer sintetizzati con un pannello di DNA di linee cellulari ben caratterizzate • Test di una soluzione di primer specifica con un pannello di DNA positivi e negativi • Test del set di SSP completo • Test del prodotto finale Controllo Interno La coppia dei primer di controllo9 viene inserito per verificare l'efficienza della reazione PCR. La sua presenza conferma che la mancanza di un'amplificazione specifica in una determinata reazione è effettivamente dovuta all'assenza di quel polimorfismo nel campione di DNA e non al fallimento della reazione di PCR. A causa delle diverse concentrazioni e delle differenti temperature di ibridazione della coppia di primer specifici rispetto alla coppia di primer di controllo: - L'intensità della banda di controllo spesso diminuisce in presenza di un'amplificazione specifica e - I primer del controllo interno sono più sensibili a condizioni di PCR non ottimali e possono essere utilizzati per monitorare l'efficienza della PCR. L’assenza di amplificazione del controllo interno in reazioni senza amplificazioni specifiche deve essere interpretata come segno che il sistema in cui si opera non è in condizioni ottimali. Per l’identificazione delle possibili cause e delle azioni correttive da eseguire fare riferimento alla Guida alla risoluzione dei problemi. Le informazioni specifiche riguardanti il Controllo Positivo Interno sono contenute nell'opuscolo informativo che accompagna ogni kit. Pagina 10 di 15 ISTRUZIONI PER L'USO Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI L'assegnazione degli alleli viene eseguita in base alla presenza di uno specifico prodotto di PCR. Un'amplificazione specifica indica che i campioni di DNA contengono l'allele, oppure uno degli alleli del gruppo definito dalla coppia di primer in quella determinata reazione di PCR. La tabella di interpretazione fornita con ciascun lotto può essere utilizzata per assegnare l'allele o il gruppo di alleli identificato dalle rispettive soluzioni di primer. Nella maggior parte dei kit Dynal AllSet+™ o CombiSet+™ SSP, non in tutti, ciascun allele o gruppo di alleli è amplificato da più di una soluzione di primer. È importante verificare che tutte le soluzioni dei primer che dovrebbero risultare positive in quanto portatrici di quell'allele o gruppo di alleli lo siano effettivamente. Sebbene gli alleli vengano assegnati in base alla presenza del prodotto di PCR, le dimensioni relative dei prodotti di PCR possono essere di aiuto nell'interpretazione delle tipizzazioni mediante SSP. Le dimensioni approssimative dei prodotti di PCR specifici possono essere utilizzate per distinguere un'amplificazione positiva vera e propria da: - artefatti di oligomeri (primer dimer) - carry over da pozzetti adiacenti - amplificazioni non specifiche Nella tabella di interpretazione fornita con ciascun kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP viene indicata la sequenza dei tre nucleotidi terminali, che determinano la specificità dell'estremità 3’ sia del primer forward che del primer reverse. • • Per i prodotti HLA di Classe I viene indicata la posizione del nucleotide negli esoni 2, 3 o 4 corrispondente all'estremità 3’ dei primer. Per i kit HLA AllSet+™ SSP di Classe II, viene indicata la posizione del codone corrispondente all'estremità 3’ dei primer. Se si dispone della sequenza di un nuovo allele non elencato nella tabella di interpretazione, le informazioni sulla sequenza del primer possono essere utilizzate per scoprire il pattern di amplificazione del nuovo allele. In questo caso si prega di contattare il Servizio Tecnico via e-mail: [email protected] o via fax: +44 151 346 1223. Interpretazione mediante Dynal SSPTool™ Dynal SSPTool™ è un software appositamente concepito come supporto nell'interpretazione dei risultati. Le tabelle di interpretazione di ogni lotto specifico dei kit AllSet+™ e CombiSet+™ SSP vengono inserite nel database del software. Il database viene aggiornato in concomitanza con la produzione di nuovi lotti. Per qualsiasi richiesta di assistenza e di informazioni riguardanti l'inserimento dei risultati e l'utilizzo del software fare riferimento alla sezione Help del programma SSPTool™. Per ordinare una copia gratuita del Dynal SSPTool™ (codice prodotto 990.80), rivolgersi al rappresentante locale di Dynal Biotech. Pagina 11 di 15 ISTRUZIONI PER L'USO Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP GUIDA ALLA RISOLUZIONE DEI PROBLEMI PROBLEMA Amplificazione assente (né amplificazione del controllo interno, né amplificazione specifica) “ CAUSA Quantità insufficiente del DNA Il DNA contiene inibitori della PCR, ad es. proteine, etanolo (dalle fasi di precipitazione). “ Il DNA è stato estratto da sangue eparinato “ Il DNA è sospeso in tampone contenente EDTA I tappi delle provette di PCR non chiusi ermeticamente sono causa di evaporazione e successivo fallimento dell’amplificazione Episodi casuali di mancata amplificazione “ “ “ Errori di caricamento del gel Utilizzo di pipette non calibrate AZIONE Controllare che il volume e la concentrazione del DNA siano corretti. Determinare la qualità del DNA. Seguire esattamente il metodo di estrazione del DNA indicato dai fornitori. Provare un metodo alternativo per l'estrazione del DNA. Ripetere l'estrazione del DNA Utilizzare sangue non eparinato, oppure provare il trattamento con eparinasi (ved. rif. 8) Ripetere l'estrazione del DNA e sospenderlo in acqua sterile Accertarsi che tutti i tappi siano chiusi ermeticamente. Utilizzare gli appositi chiudiprovette Controllare che siano stati caricati correttamente i pozzetti e che ciascuno contenga una quantità simile di miscela di PCR Calibrare regolarmente tutte le pipette in base alle indicazioni dei fornitori “ Errori di pipettamento Il DNA, la Taq polimerasi o la miscela di PCR non sono miscelati adeguatamente prima dell'impiego Controlli Interni deboli DNA impuro Determinare la qualità del DNA. Ripetere l'estrazione del DNA con soluzioni appena preparate. Quantità di DNA insufficiente Determinare la concentrazione del DNA e diluirlo a 50 ng/µl Temperatura di ibridazione eccessiva, il termociclatore non è calibrato Calibrare il termociclatore e controllare il programma di PCR. Un termociclatore utilizzato di routine per PCR-SSP deve essere calibrato ogni 6 mesi. Quantità insufficiente di DNA polimerasi termostabile Utilizzare una quantità maggiore di enzima nelle reazioni di PCR DNA polimerasi termostabile di bassa qualità Utilizzare Amplitaq® Perkin-Elmer “ “ “ “ Amplificazione non specifica (ladder o smear) DNA non pulito (Alcune miscele di primer presentano una maggiore tendenza a dare luogo ad amplificazione non specifica, ved. note a piè di pagina delle Tabelle di Specificità) Segnali di amplificazione progressivamente più deboli “ La soluzione di etidio bromuro per la colorazione del gel di agarosio è vecchia Una delle lampade UV è rotta Amplificazioni false-negative Temperatura di ibridazione eccessiva, il termociclatore non è calibrato Amplificazioni false-positive Potrebbero essere causate da contaminazione “ “ Pattern di amplificazione anomalo “ “ DNA non pulito Temperatura di ibridazione troppo bassa Il termociclatore non è calibrato È stata utilizzata la tabella di interpretazione sbagliata Il pattern di amplificazione contiene un "falso-positivo" Nuovo allele, non compreso nella tabella di interpretazione Bande sfocate e indistinte Il tampone di elettroforesi può essere caldo “ Corsa non adeguata dell'amplicone Il pettine utilizzato ha i denti troppo spessi Il tampone di corsa e il tampone utilizzati presentano una concentrazione differente Tampone di corsa non compatibile con l'amplicone Bolle d'aria nella pipetta Eseguire con maggiore attenzione il pipettamento Miscelare brevemente mediante vortex Tutti i frammenti di dimensioni maggiori rispetto al controllo interno possono essere ignorati Controllare la qualità del DNA Ripetere l'estrazione del DNA L'assenza di DNA può anche causare smear Preparare una nuova soluzione di bromuro di etidio in modo tale da ottenere una migliore colorazione del gel. Controllare l'apparecchiatura di illuminazione UV. Calibrare il termociclatore e controllare il programma di PCR impostato. Un termociclatore utilizzato di routine per PCR-SSP deve essere calibrato ogni 6 mesi. Utilizzare guanti, puntali con filtro, eseguire le operazioni di pre e post-PCR in aree separate. Manipolare con cura i campioni in tutte le fasi. Controllare l'eventuale contaminazione utilizzando primer per il controllo della contaminazione Dynal (codice prodotto 990.05) Determinare la qualità del DNA. Ripetere l'estrazione del DNA con soluzioni appena preparate. Calibrare il termociclatore e controllare il programma di PCR impostato. Un termociclatore utilizzato di routine per PCR-SSP deve essere calibrato ogni 6 mesi. Controllare che il numero di lotto del prodotto utilizzato corrisponda a quello della tabella di interpretazione. Controllare che tutte le amplificazioni siano delle dimensioni corrette o se un artefatto (carry-over, dimero) è stato erroneamente interpretato come un'amplificazione Ripetere la tipizzazione. Se il nuovo pattern di amplificazione è riproducibile, si prega di contattare il rappresentante locale Dynal Biotech per informazioni sul pattern di amplificazione di alleli di recente descrizione. Utilizzare il tampone TBE consigliato. Far correre il gel ad un voltaggio inferiore Utilizzare pettini con denti sottili (4 x1mm) Utilizzare lo stesso tampone per il gel e per il tampone di corsa Si consiglia TBE 0.5x Pipettare adeguatamente Pagina 12 di 15 ISTRUZIONI PER L'USO Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP BIBLIOGRAFIA 1) Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 20 dic. 1985;230(4732):1350-4. 2) Wu, D. Y., Ugozzoli, L., Pal, B. 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Phototyping: Comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilising sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens 46(5), 355-367. 6) Richmond, Y. e McKinney, W. (ed.) 1993. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. HHS Publication N. (CDC) 93-8395. 7) National Committee for Clinical Laboratory Standards. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue. Tentative Guideline. NCCLS Document M29-T Villanova, PA:NCCLS, 1989. 8) Satsangi J, Jewell DP, Welsh K, Bunce M, Bell JI.Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet. 11 giugno 1994;343(8911):1509-10. 9) Bein G, Glaser R, Kirchner H. Rapid HLA-DRB1 genotyping by nested PCR amplification. Tissue Antigens. feb. 1992;39(2):68-73 Pagina 13 di 15 ISTRUZIONI PER L'USO Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP GARANZIA I prodotti sono garantiti per l'acquirente originale solo per essere conformi alla quantità e al contenuto indicati sul flacone o sulle etichette esterne per la durata indicata. L'obbligo di Dynal Biotech e l'unico risarcimento per l'acquirente previsti dalla presente garanzia si limitano alla sostituzione, a spese di Dynal Biotech, di qualsiasi prodotto che presenti difetti di produzione e che sia restituito a Dynal con pagamento anticipato del trasporto, o a discrezione di Dynal Biotech, al rimborso del prezzo di acquisto. I reclami per merci danneggiate durante il trasporto devono essere presentati allo spedizioniere. La presente garanzia non verrà applicata a prodotti che abbiano subito alterazioni al di fuori di Dynal Biotech, né a prodotti sottoposti a uso improprio o cattivo uso. 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MARCHI DI FABBRICA UTILIZZATI NEL PRESENTE DOCUMENTO/ PRODOTTO Dynal® è un marchio registrato di DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norvegia AllSet™ e AllSet+™ sono marchi registrati di DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norvegia DynaMix™ è un marchio di DYNAL BIOTECH Ltd., U.K. CombiSet™ e CombiSet+™ sono marchi di DYNAL BIOTECH., U.K. SSPTool™ è un marchio di DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norvegia AmpliTaq® è un marchio registrato di Roche Molecular Systems, Inc. USA. Electro-Fast® è un marchio registrato di Advanced Biotechnologies Ltd (ABgene®) GeneAmp® è un marchio di Roche Molecular Systems, Inc. USA BREVETTI UTILIZZATI NEL PRESENTE DOCUMENTO/PRODOTTO * I prodotti Dynal SPP sono venduti sul licenza concessa da ZENECA Ltd. ARMS™ in base al brevetto europeo N. 0332435 e dei corrispondenti brevetti internazionali. ARMS™ è un marchio registrato di ZENECA Ltd. ** Questo prodotto è STATO ottimizzato per l'impiego nel processo di reazione a catena della polimerasi (“PCR”) protetto da brevetti di proprietà di Roche Molecular Systems Inc. e F. Hoffmann-La Roche Ltd (“Roche”). Con l'acquisto di questo prodotto, all'acquirente non viene concessa alcuna licenza espressa o implicita di utilizzo del processo di PCR coperto da tali brevetti. Per ulteriori informazioni sull'acquisto di licenze per l’utilizzo del processo di PCR, contattare il Director of Licensing presso Roche Molecular Systems,, Inc.,1145 Atlantic Avenue, Alameda, California, 94501, per quanto riguarda gli Stati Uniti e il PCR Licensing Manager, F. Hoffman-La Roche Ltd, Grenzacherstr. 124, DH-4070 Basilea, Svizzera, per gli altri paesi. Prodotto da Dynal Biotech Ltd.,U.K. Sviluppato da Dynal Biotech Ltd.,U.K. Pagina 14 di 15 ISTRUZIONI PER L'USO Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP CONTATTI Dynal Biotech Ltd., 11 Bassendale Road, Croft Business Park, Bromborough, Wirral, CH62 3QL, U.K. Tel: +44 151 346 1234, Fax: +44 151 346 1223 E-mail: [email protected], Internet: http://www.tissue-typing.com Dynal Biotech A.S.A PO Box 114 Smestad, N-0309, Oslo, Norvegia Tel: +47 2206 1000 Fax: +47 22 50 E-mail:[email protected] Internet: http://www.dynalbiotech.com DYNAL BIOTECH GmbH Bramfelder Chaussee 41 22177 Hamburg, Germania Tel: +49 40 36 15 73-0 Fax: +49 40 36 15 73-30 E-mail: [email protected] Dynal Biotech Inc. HLA Diagnostics Division 555 Andorra Glen Court Suite 5 Lafayette Hill, PA 19444, USA Toll Free: +1 1866 DYNAL TT (396 2588) Tel: +1 610 940 1511 Fax: +1 610 940 3606 E-mail: [email protected] Dynal Biotech A.S.A Centre de Transfert de I'U.T.C., 66 Avenue de Landshut 60200 Compiègne, Francia Tel: +33 3 44 23 45 95 Fax: +33 3 44 23 16 14 E-mail: [email protected] Dynal Biotech Pty PO Box 204, Carlton South, Victoria 3053, Australia Tel: 1 800 623 453 Tel: +61 3 9663 5777 Fax: +61 3 9663 6660 Numero verde NZ: 0800 448 246 Email: [email protected] Per informazioni sui distributori Dynal a livello mondiale, contattare Dynal Biotech Ltd. © Copyright 2003 Dynal Biotech Ltd., U.K. Tutti i diritti riservati Stampato 12.03. Rev. 000 Pagina 15 di 15