TRWH v.2
1 Finalità d’uso
5 Stabilità e modalità di conservazione
RealCycler TRWH è un kit di reagenti che permette la rilevazione
qualitativa per Real-time PCR del DNA di Tropheryma whipplei In
campioni clinici, utilizzando lo SmartCycler® (Cepheid®).
Tutti i componenti di RealCycler TRWH devono essere stoccati a
-20°C. Il kit è stabile a -20°C fino alla scadenza indicata
sull’etichetta esterna del kit.
Il sistema include un controllo interno di amplificazione per la
prevenzione dei falsi negattivi dovuti all’inibizione della reazione.
6 Materiali e strumenti addizionali richiesti e
non forniti
2 Principio del test
- Sistema di PCR Real-time SmartCycler® (Cepheid®).
- Microcentrifuga per i tubi dello SmartCycler®.
- Rack per i tubi di reazione SmartCycler®.
- Kit di purificazione del DNA.
- Guanti monouso.
- Pipette calibrate.
- Puntali per pipette con filtro.
- Freezer (-20 °C).
La reazione a catena della polimerasi (PCR) si basa
sull’amplificazione di una regione specifica di DNA/RNA, mediante
l’utilizzo di primers complementari alla sequenza bersaglio. Nella
Real-time PCR si utilizzano sonde marcate con fluorofori, che
emettono fluorescenza a seguito della reazione di amplificazione. Il
ciclo della PCR in cui si evidenzia una fluorescenza significativa è
proporzionale alla quantità di DNA/RNA presente nel campione.
Questo valore è definito il Ciclo soglia (Ct -Cycle Treshold- o Cq Cycle Quantification-).
7 Avvertenze e precauzioni
L’amplificazione di Tropheryma whipplei viene rilevata in
corrispondenza del canale del fluoroforo FAM e il controllo interno in
corrispondenza del fluoroforo Alx532.
4 Contenuti
- Tutti i componenti del kit devono essere mantenuti al freddo mentre
vengono manipolati.
- Dopo l’aggiunta del DNA si deve ridurre il tempo necessario per
iniziare il programma di amplificazione.
-Non esporre i tubi di reazione contenenti la mix di amplificazione alla
luce per lungo tempo.
-Ripetuti cicli di congelamento/scongelamento possono ridurre la
sensibilità del kit.
- Utilizzare guanti monouso.
- Utilizzare pipette adeguate calibrate e puntali per pipette con filtro.
- Gli studi devono essere fatti da personale qualificato e seguendo le
buone pratiche di laboratorio.
- Si raccomanda di includere un controllo positivo ed uno negativo
ogni volta che si fanno le analisi.
- Si raccomanda di portare a temperatura ambiente le provette per 5
minuti prima di aprirle. Altrimenti si può rompere il tappo.
- Non utilizzare il kit oltre la data di scadenza.
- Per uso diagnostico in vitro.
- Cepheid® e SmartCycler® sono marchi registrati di Cepheid
Corporation.
- QIAamp® è un marchio registrato del QIAGEN Group.
- Maxwell® è un marchio registrato di Promega Corporation.
- NucliSENS® easyMAG® è un marchio registrato di bioMérieux.
RealCycler TRWH include la miscela AmpliMiX dispensata nei tubi
di reazione ed un Controllo Positivo DNA T.whipplei.
8 Campioni clinici
Tutti i reagenti sono pronti all’uso e non necessitano ne l’aggiunta ne
la ricostituzione di nessun componente.
-Prelevare i campioni clinici in appositi contenitori sterili.
-Mantenere e trasportare i campioni congelati a -20°C fino all’uso.
3 Specifiche tecniche
Sensibilità
Tropheryma whipplei: 10 copie/µL.
La sensibilità analitica è stata calcolata sulla base di diluizioni
successive. La sensibilità è stata determinata in prove ripetute,
mostrando una riproducibilità di oltre il 95%.
Specificità
Tropheryma whipplei: WiSP family protein.
La validazione della specificità è stata eseguita in accordo alle prove
sperimentali e all’analisi BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
Componenti
Flaconi
Volume
AmpliMix
24
19,5 µL
Controllo Positivo
1
9 Procedura
a) Purificazione degli acidi nucleici
Il DNA deve essere purificato dai campioni clinici utilizzando una
procedura adeguata. Sono disponibili in commercio numerosi kit di
purificazione di acidi nucleici. Si prega di eseguire il processo di
purificazione in accordo alle istruzioni del produttore a partire dal
volume di campione raccommandato.
60 µL
1
2
e) Esempio di un risultato
Questo kit è stato validato con il seguente sistema di purificazione:
● QIAamp DNA Blood Mini kit (references 51104, 51106). QIAGEN.
Questo kit può essere usato in combinazione dei seguenti sistemi di
purificazione:
● Maxwell® 16 Cell LEV DNA Purification kit. Promega Corporation.
● BioRobot EZ1.QIAGEN.
● QIAcube. QIAGEN.
● NucliSENS® easyMAG®. bioMérieux.
b) Protocollo
Impostare il protocollo di amplificazione “TRWH” in accordo con le
seguenti specificazioni:
Figura 1 (Canale FAM: T. whipplei): Risultati ottenuti dalla reazione
di amplificazione di un controllo negativo ed un controllo positivo.
Controllo negativo (A9 blu): non rilevato. Controllo positivo (A10
grigio): si osserva segnale Ct=31,05.
c) Preparazione della reazione
-Scongelare i tubi contenenti l’AmpliMix necessari alla reazione di
amplificazione dei campioni e il Control Positivo.
- Aggiungere 8 µL di DNA di ogni campione o controllo in ogni tubo.
- Spinnare i tubi per trasferire l‘AmpliMix nell’area di lettura ottica del
tubo perché la reazione ci sia nella zona ottica del tubo. Verificare
l’assenza di bolle in tale area.
- Caricare i tubi nello strumento.
- Create Run > Dye Set > FATA25.
- Add/Remove Sites: assegnare il protocollo “TRWH” alle posizioni
corrispondenti ai campioni e ai controlli.
- Start Run: Avviare il programma di amplificazione.
Figura 2 (Canale Alx532: controllo interno): Risultati ottenuti dalla
reazione di amplificazione di un controllo positivo ed un controllo
negativo. Controllo negativo (A9 blu): si osserva segnale Ct=32,76.
Controllo positivo (A10 grigio): si osserva segnale Ct=32,02.
10 Controllo qualità
d) Interpretazione dei risultati
Interpretare il risultato ottenuto in ogni campioni secondo la
combinazione dei segnali indicati nella tabella seguente:
FAM
Std/Res
Canali
Alx532
Std/Res
Alx532
Ct
POS
Indifferente
Indifferente
POSITIVO
T. whipplei
NEG
POS
Ct dentro
del rango
NON SI RILEVA
NEG
POS
Ct fuori
del rango
NON VALUTABILE
NEG
NEG
0,00
NON VALUTABILE
Per validare i risultati, i valori di Ct ottenuti per il controllo positivo e
per il controllo interno devono rientrare entro specifici range contenuti
sull’etichetta interna del kit.
Ciascun lotto di RealCycler TRWH è stato testato in accordo alle
specifiche del metodo Real-time PCR utilizzando lo strumento
SmartCycler® (Cepheid®).
Interpretazione
Data di pubblicazione: Maggio, 2014.
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