ANIMALI TRANSGENICI
ANIMALI TRANSGENICI
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Per animali transgenici si intendono quegli
animali ottenuti attraverso una
manipolazione del genoma, inserendo uno o
più geni, appartenenti alla stessa specie, o
più spesso ad altre specie.
MICROINIEZIONE DI DNA
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INIEZIONE DI DNA nel pronucleo maschile di un
oocita appena fecondato. Più precisamente, si
depositano con una microsiringa 1-2 picolitri di DNA
che contengono circa 100-200 copie del gene da
inserire. A monte del gene(cDNA) da trasferire nel
pronucleo si utilizza una sequenza promotore che
conferisce al gene la specificità di espressione in un
particolare tessuto
MICROINIEZIONE DI DNA
E PRODUZIONE DI TOPI TRANSGENICI
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Il gene inserito viene integrato nel genoma della
cellula uovo che viene trapiantata in una madre
adottiva , che darà origine alla nascita di un topino
“chimera” ( mosaico di cellule con patrimoni genetici
diversi). Nella fase successiva si effettua un incrocio
riproduttivo tra il topino chimera e un topo normale
con la nascita di topini con i nuovi geni ma
eterozigotici ; solo nell’incrocio successivo tra i
precedenti avremo la nascita di topini omozigotici
per il gene introdotto
MICROINIEZIONE DI DNA E PRODUZIONE
DI TOPI TRANSGENICI
Dennis Roop and c-Myc
Myc è un oncogene che attiva la trascrizione
dei geni di stimolo di sviluppo;quando viene
espresso altera la funzione usuale dello
sviluppo e della proliferazione di controllo
delle cellule
Studio del ruolo di c-Myc nella carcinogenesi
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Creazione di topi transgenici
Inserimento di c-Myc umano in topo
Overexpression di c-Myc nell’epidermide
Risultati esperimento:
-aumento di crescita cellulare
-inibizione della differenziazione
TOPI KNOCK–OUT
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I topi knock–out sono divenuti molto utili nel
contribuire a capire il genoma umano ed il relativo
ruolo nelle malattie. Generando un knock-out è stato
dimostrato che è possibile mirare l’inserimento del
gene in una posizione precisa del genoma del topo;
ciò dà la possibilità di eliminare un gene specifico
con un allele inattivo o mutato. Di conseguenza gli
animali Knock-out sono considerati una tecnica
investigativa che tiene conto dell’eliminazione di un
gene in particolare, nel tentativo di definire che
effetto ha nell’organismo
CLONAGGIO DEL DNA
PLASMIDI
I Plasmidi sono elementi genetici extracromosomici che si replicano nelle cellule
batteriche autonomamente. Il loro DNA è
circolare e a doppia elica.I plasmidi usati
negli esperimenti di clonaggio derivano tutti
da plasmidi trovati in natura che sono stati
“ingegnerizzati” in modo da presentare
caratteristiche che facilitino il clonaggio di
geni. I più usati sono i plasmidi di E.Coli.
Caratteristiche dei plasmidi
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Una sequenza ORI che permette al plasmide di replicarsi
nelle cellule di E.Coli in quanto viene riconosciuta dagli
enzimi di replicazione della cellula ospite
Deve avere un marcatore selettivo, che renda le cellule di
E.Coli contenenti il plasmide, facilmente distinguibili
dalle cellule che non lo contengono; uno dei marcatori
più usati è il gene amp che conferisce la resistenza
all’ampicillina
Deve avere anche un sito di taglio per un enzima di
restrizione in modo che lo si possa aprire per inserire il
frammento di DNA esogeno
INSERIMENTO DEL DNA DA CLONARE
CELLULE ES
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Le cellule ES sono cellule embrionali totipotenti,
infatti possono dare origine a cellule di tessuti
differenti. Le cellule ES vengono prelevate dalla
massa cellulare interna della blastocisti(cellula
embrionale indifferenziata) e mantenute in
coltura in presenza di cellule o fattori che ne
impediscono il differenziamento. In queste
condizioni le cellule ES mantengono intatta la
loro capacità di differenziarsi in modo
appropriato in qualunque tessuto, una volta
reintrodotte in un embrione
RICOMBINAZIONE OMOLOGA
INIEZIONE DEL DNA RICOMBINATO
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Le cellule staminali che hanno integrato nel loro
genoma il DNA ricombinato, vengono iniettate in un
embrione isolato in stadio precoce di sviluppo.
L’embrione precoce, composto parzialmente da
cellule ES, viene introdotto nell’utero di una femmina
pseudogravida.
Il topo “chimera” che si sviluppa da questo embrione
conterrà alcune cellule somatiche portatrici del gene
alterato e conterrà anche cellule della linea
germinale che portano il gene modificato.
TOPO CHIMERA INCROCIATO CON TOPO NORMALE
1.
2.
3.
Il topo “chimera” verrà incrociato con un topo normale e
alcuni discendenti (2 su dieci) avranno un gene
modificato in tutte le loro cellule ( eterozigosi).
Incrociando tra loro questi topi portatori del gene
modificato si ottiene qualcuno dei discendenti contenente
2 geni alterati in tutte le sue cellule (omozigosi ).
Se l’alterazione genica originale inattiva completamente
la funzione genica si avranno allora dei topi ad
“eliminazione” (Knock-out) cioè ceppi di topi che hanno
un certo gene inattivato definitivamente.
TECNICA KNOCK - OUT
USO DEL KNOCK-OUT NELLA
COLORAZIONE DEL PELO DI TOPO
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Le cellule ES utilizzate hanno uno “STRAIN” con pelo di colore bianco
Dopo che tali cellule sono state inserite in una blastocisti, esse si divideranno
in molti tessuti differenti. Se il risultato è un topo che il pelo con macchie
bianche e macchie nere vuol dire che l’iniezione di cellule ES è riuscita. Dopo
l’individuazione dei topi che hanno avuto contributi da entrambi i tipi di cellule,
si ha la trasmissione della germ-line per cui dall’incrocio di questi topi
eterozigoti con il pelo a chiazze avremo la nascita di topi Knock-out con il pelo
nero ( quindi genotipo omozigote)
TECNICA “CONDITIONAL KNOCK-OUT”
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Lo scopo dei Knock-out condizionali è
eliminare un gene in un tessuto, in un organo
o in una fase particolare di sviluppo.
VANTAGGI:
-topi Knock-out conditional sopravvivono più a lungo
-i metodi sono anche più precisi
Il sistema di Recombinase Cre-Lox
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Metodo knock-out conditional piu’ usato.
Si basa sull’azione del recombinase che è un enzima che
funziona come le forbici tagliando un frammento di DNA
inserito fra due siti LOX recombinase specifici. Poiché questo
enzima è espresso soltanto in determinati tipi cellulari, il gene
designato sarà eliminato soltanto da tali cellule. Quindi
questa metodica è basata su un’inattivazione tessutospecifica del gene bersaglio. In una prima fase avviene la
descrizione del luogo d’interesse :il frammento di DNA
compreso tra siti Lox. Successivamente avviene la
costruzione del vettore bersaglio, la ricombinazione omologa
in cellule ES, l’iniezione nell’embrione ad uno stadio precoce
e la generazione del topo chimera. Quest’ultimo, contenete i
siti Lox recombinase-specifici, verrà incrociato con un topo
CRE positivo, cioè che esprime l’enzima recombinase in un
tessuto specifico. L’espressione tessuto-specifica del
recombinase permette l’inattivazione del gene d’interesse
soltanto nel tessuto in cui la recombinase è espressa.