Animali transgenici:
concetti e applicazioni in
biomedicina
MANIPOLARE IL GENOMA DEL
TOPO:
• Generazione di TOPI TRANSGENICI: microiniezione di
DNA esogeno in uova fertilizzate. Il DNA si integra a
posizioni CASUALI nel genoma.
• Generazione di mutazioni specifiche in geni endogeni:
RICOMBINAZIONE OMOLOGA IN CELLULE ES
(Embryonic Stem Cells). Il DNA si integra a siti di
omologia con il vettore usato.
Generazione di topi transgenici
• Il gene da esprimere viene clonato sotto il controllo di
regioni regolatrici adatte e purificato dal plasmide.
• Le regioni regolatrici vengono scelte in base all’attivita’, la
distribuzione tissutale e nello sviluppo.
• Il DNA purificato viene microiniettato nel pronucleo di
uova fertilizzate.
P/E
GENE
PA
L’embrione murino pre-impianto
IL DNA VIENE MICROINIETTATO NEL PRONUCLEO MASCHILE
DI UN UOVO FERTILIZZATO
Integrazione (frequenza 10-30%)
Le uova microiniettate soino introdotte nell’ovidotto
di una madre adottiva
Alcuni cuccioli nasceranno con il DNA integrato nel genoma
(TOPI TRANSGENICI)
TIPICHE APPLICAZIONI DEI TOPI
TRANSGENICI IN BIOMEDICINA:
• Analisi e dimostrazione dell’attivita’ di ONCOGENI
• Analisi del ruolo patogeno di proteine impropriamente
espresse
• Analisi del ruolo patogeno di proteine umane mutate
• Caratterizzazione di sequenze regolatorie (enhancers,
promotori, locus control regions etc.)
• I proto-oncogeni c-Fos e c-Myc sono coinvolti nella crescita cellulare.
• La loro sintesi e’ indotta da fattori di crescita in modo rapido e
TRANSIENTE
• L’ espressione incontrollata stimola crescita cellulare incontrollata
Lo sviluppo di un tumore richiede mutazioni multiple.
Suggerito da studi epidemiologici e dimostrato da studi con
topi transgenici
La cinetica di comparsa di tumori mammari in topi transgenici che
esprimono gli oncogeni myc, rasD o ambedue nella mammella sotto il
controllo del promotore di MMTV dimostra la cooperativita’ delle
mutazioni oncogeniche (carcinogenesi a piu’ stadi).
MUTAGENESI MIRATA
Generazione di mutazioni specifiche in geni endogeni tramite
RICOMBINAZIONE OMOLOGA IN CELLULE ES
MUTAGENESI MIRATA:
GENERAZIONE DI TOPI CHIMERICI TRAMITE INIEZIONE DI CELLULE ES
IN BLASTOCISTI MURINE
3.5 DAYS MOUSE EMBRYO
(BLASTOCYST)
IN VITRO EXPANSION
EMBRYONIC STEM CELLS
(TOTIPOTENT)
GENE TARGETING
MICROINJECTION OF MUTANT ES CELLS
INTO RECIPIENT EMBRYOS
REIMPLANTATION IN
PSEUDOPREGNANT FOSTER MOTHER
CHIMERIC MICE ARE BORN
ALCUNI TOPI CHIMERICI
TRASMETTERANNO LA MUTAZIONE
ALLA PROGENIE
+/ +
+/ +
-/ +
+/ +
-/ -
-/ +
INCROCIANDO TOPI ETEROZIGOTI
PER LA MUTAZIONE SI OTTERRANNO
MUTANTI OMOZIGOTI
STUDIO DEGLI EFFETTI DELLA MUTAZIONE
Mutazioni specifiche tramite ricombinazione omologa: la
strategia della “sostituzione” e la selezione positiva-negativa
linearisation
Plasmid seq.
•L’intera regione tra le 2 regioni di omologia viene sostituita
•Il marcatore di selezione positiva (Neo) e’ all’interno dell’omologia
•Il marcatore di selezione negativa (HSV TK) e’ fuori dell’omologia
•Una regione cruciale viene deletata o mutata nel vettore
APPLICAZIONI BIOMEDICHE DELLA MUTAGENESI
MIRATA TRAMITE RICOMBINAZIONE OMOLOGA
• Analisi in vivo delle funzioni di geni specifici tramite la
generazione di mutanti inattivi
• Analisi delle funzioni di proteine mutanti tramite
l’introduzione di mutazioni fini
• Generazione di modelli animali di malattia
(inattivazione di oncosoppressori, riproduzione di malattie dovute alla
difettiva funzione genica - es fibrosi cistica, b-talassemia etc.)
ANIMALI TRANSGENICI/KO: APPLICAZIONI
IN BIOTECNOLOGIA
• Produzione di proteine bioattive nel latte di mucche/pecore
• Miglioramento delle caratteristiche commerciali/nutritive
di animali da allevamento.
• Produzione di anticorpi umanizzati
• Produzione di animali con antigeni umanizzati per lo
xenotrapianto d’organo
Produzione di anticorpi umanizzati
1) Generazione di topi transgenici per i loci IgH e IgK
umani (hIgH-TG, hIgK-TG)
2) Inattivazione mirata dei loci endogeni IgH e IgK
(mIgH-KO, mIgK-KO)
3) Incrocio tra i topi dei diversi ceppi per ottenere un topo
hIgH-TG, hIgK-TG; mIgH-KO, mIgK-KO che
esprimera’ le catene H e K delle Ig umane
4)
Clonaggio animale: la tecnica
Somatic cells (source of nuclei)
Cloned sheep
Specie animali clonate a tutt’oggi:
•
•
•
•
•
pecora
topo
mucca
capra
maiale
Possibili applicazioni della ricombinazione
omologa in animali da fattoria
• Modelli di malattie umane piu’ vicini all’uomo
(es. fibrosi cistica)
• Rimozione di geni indesiderabili (es. il gene che codifica la
proteina prionica PrP: pecore e mucche resistenti allo
scapie/BSE)
Clonare gli esseri umani?