SHBG
®
IRMA-Count SHBG
English
Intended Use: IRMA-Count SHBG is a
solid-phase immunoradiometric assay
designed for the quantitative
measurement of sex hormone binding
globulin (SHBG) in serum. It is intended
strictly for in vitro diagnostic use as an aid
in the differential diagnosis of hirsutism.
Catalog number: RKSH1 (100 tubes)
The 100-tube kit contains less
than 20 microcuries
(740 kilobecquerels) of
125
radioactive I anti-SHBG.
Summary and Explanation of
the Test
Sex hormone-binding globulin (SHBG) is a
glycoprotein, synthesized in the liver,
which binds testosterone and
5α-dihydrotestosterone with high affinity,
and estradiol with somewhat lower
1,9
affinity. It has a single steroid
hormone-binding site, a molecular mass of
approximately 80,000 to 100,000 daltons,
and consists of two subunits, roughly
equal in size.
SHBG typically circulates at higher
concentrations in women than in men, due
to the higher ratio of estrogens to
androgens in women. For the same
reason, SHBG levels in late pregnancy or
after estrogen administration may be
especially elevated. Administration of
androgens tends to be associated with
decreased SHBG levels.
Testosterone circulates primarily
protein-bound, principally to SHBG, but
also to albumin and cortisol-binding
globulin. Since variations in the carrier
protein levels may affect the concentration
of testosterone in circulation, SHBG levels
are commonly measured as a supplement
to total testosterone determinations. The
"free androgen index" (FAI), calculated as
the ratio of total testosterone to SHBG,
has proved to be a useful indicator of
abnormal androgen status in conditions
1,4,7,11
such as hirsutism.
Principle of the Procedure
IRMA-Count SHBG is an
immunoradiometric assay based on
ligand-coated tubes and monoclonal
125
antibodies, one I-labeled, the other
ligand-labeled. SHBG in the patient
sample is captured by the ligand-labeled
monoclonal, in a reaction proceeding with
liquid-phase kinetics. Separation is then
achieved by the ligand-coated
tube/anti-ligand bridge method. Finally,
the bound fraction is reacted with the
radiolabeled antibody, and the tube is
washed to remove excess tracer. In the
procedure, counting the tube in a gamma
counter yields a number that is
proportional to the amount of SHBG
present in the patient sample.
Reagents to pipet: 3
Total Incubation Time: 90 minutes
Total counts of at iodination:
approximately 300,000 cpm
Warnings and Precautions
For in vitro diagnostic use.
Reagents: Store at 2–8°C in a refrigerator
designated for incoming radioactive
materials. Dispose of in accordance with
applicable laws.
Do not use reagents beyond their
expiration dates.
Some components supplied in this kit may
contain human source material and/or
other potentially hazardous ingredients
which necessitate certain precautions.
Follow universal precautions, and handle
all components as if capable of
transmitting infectious agents. Source
materials derived from human blood were
tested and found nonreactive for syphilis;
for antibodies to HIV 1 and 2; for hepatitis
B surface antigen; and for antibodies to
hepatitis C.
Sodium azide, at concentrations less than
0.1 g/dL, has been added as a
preservative. On disposal, flush with large
volumes of water to prevent the buildup of
potentially explosive metal azides in lead
and copper plumbing.
Water: Use distilled or deionized water.
2
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Radioactivity
A copy of any radioisotope license
certificate (Specific or General) issued to a
US customer must be on file with Siemens
Healthcare Diagnostics before kits or
components containing radioactive
material can be shipped. These
radioactive materials may be acquired by
any customer with the appropriate Specific
license. Under a General license these
radioactive materials may be acquired
only by physicians, veterinarians in the
practice of veterinary medicine, clinical
laboratories and hospitals — and strictly
for in vitro clinical or laboratory tests not
involving external or internal
administration of the radioactive material
or its radiation to human beings or other
animals. Its acquisition, receipt, storage,
use, transfer and disposal are all subject
to the regulations and a (General or
Specific) license of the U.S. Nuclear
Regulatory Commission or a State with
which the NRC has entered into an
agreement for the exercise of regulatory
control.
Handle radioactive materials according to
the requirements of your General or
Specific license. To minimize exposure to
radiation, the user should adhere to
guidelines set forth in the National Bureau
of Standards publication on the Safe
Handling of Radioactive Materials
(Handbook No. 92, issued March 9, 1964)
and in subsequent publications issued by
State and Federal authorities.
Wipe up spills promptly and
decontaminate affected surfaces. Avoid
generation of aerosols. Dispose of solid
radioactive waste according to license
requirements. General licensees (holders
of NRC Form 483) may dispose of solid
radioactive waste as nonradioactive
waste, after removing labeling. Specific
licensees (NRC Form 313) should refer to
Title 10, Code of Federal Regulations,
Part 20. Licensees in Agreement States
should refer to the appropriate regulations
of their own state. General licensees may
dispose of liquid radioactive waste of the
type contained in this product through a
laboratory sink drain. Licensees must
remove or deface labels from empty
containers of radioactive materials before
disposal of solid waste. Specific licensees
may dispose of small quantities of liquid
radioactive waste of the type used in this
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
product through a laboratory sink drain.
Refer to the appropriate regulations
applicable to your laboratory.
Materials Supplied:
Initial Preparation
Ligand-Labeled SHBG MAb (SHR1)
22 mL of ligand-labeled monoclonal
antibody, with preservative. Stable at
2–8°C for 60 days after opening, or until
the expiration date marked on the vial.
RKSH1: 1 vial.
125
I SHBG MAb (SHR2)
Lyophilized, iodinated monoclonal
anti-SHBG antibody, with preservative.
Reconstitute each vial by adding 11 mL
distilled or deionized water. Mix by gentle
inversion. Stable at 2–8°C for 30 days
after reconstitution, or until the expiration
date marked on the vial.
RKSH1: 2 vials.
SHBG Calibrators (SHR3–9)
Seven vials, labeled A through G, of
lyophilized SHBG calibrators in a buffered
matrix, with preservative. At least 30
minutes before use, reconstitute the zero
calibrator A with 3.0 mL distilled or
deionized water, and the remaining
calibrators B through G with 1.0 mL
each. Mix by gentle swirling or inversion.
Stable for 2 months (aliquotted) at –20°C.
RKSH1: 1 set.
The calibrators have lot-specific values of
approximately 0, 1, 3, 10, 30, 90 and
180 nmol/L of SHBG. Refer to the vial
labels for exact SHBG concentrations.
Intermediate calibration points may be
obtained by mixing calibrators in suitable
proportions.
Ligand-Coated Tubes (PST)
Polystyrene tubes coated with ligand and
packaged in zip-lock bags. Store
refrigerated and protected from moisture,
carefully resealing the bags after opening.
Stable at 2–8°C until the expiration date
marked on the bag. Color: clear.
RKSH1: 100 tubes.
SHBG Anti-Ligand (SHILB)
2.8 mL of anti-ligand, reactive with the
ligand-labeled monoclonal antibody and
with the ligand-coated tubes. Stable at
2–8°C for 30 days after opening, or until
3
the expiration date marked on the vial.
Note that the anti-ligand supplied in the
IRMA-Count SHBG kit is not
interchangeable with those supplied in
other IRMA-Count kits. Color: blue.
RKSH1: 2 vials.
Buffered Wash Solution Concentrate
(2TSBW)
60 mL of a concentrated buffered saline
solution, with surfactants. Using a transfer
container, dilute the vial of concentrate
with 600 mL distilled or deionized water,
for a total volume of 660 mL. Stable at
2–8°C for 6 months after preparation.
RKSH1: 1 vial.
SHBG Controls (SHCO1–2)
Two vials labeled SHBG Control 1 and 2,
containing lyophilized SHBG in a buffered
matrix. At least thirty minutes before use,
reconstitute each vial by adding exactly
1.0 mL distilled or deionized water. Mix by
gentle inversion. Stable for 2 months
(aliquotted) at –20°C. Refer to SHBG
control package insert for values in
nmol/L.
RKSH1: 1 set.
Materials Required But Not
Provided
Gamma counter — compatible with
standard 12x75 mm tubes
Rack shaker — set at approximately 200
strokes per minute
Reagent Preparation
Distilled or deionized water
Pipet — for delivering 11 mL
Volumetric pipet — for delivering 3 mL and
1 mL
Graduated cylinder — for transferring
600 mL
Plastic storage container with lid — for
preparation and storage of Buffered Wash
Solution
Dispenser: 2.0 mL — for the Buffered
Wash Solution
Foam decanting rack — available from
Siemens Healthcare Diagnostics (catalog
number: FDR).
3-cycle log-log graph paper
Specimen Collection
The patient need not be fasting, and no
special preparations are necessary.
13
Collect blood by venipuncture into plain
tubes, noting the time of collection. Allow
the specimen to clot, then separate the
serum from the cells.
Lipemia may interfere with the assay.
Lipemic samples should be clarified by
ultracentrifugation.
Hemolyzed samples may indicate
mistreatment of a specimen before receipt
by the laboratory; hence the results should
be interpreted with caution.
EDTA plasma is unsuitable for use.
Heparinized plasma has no effect on the
assay.
Blood collection tubes from different
manufacturers may yield differing values,
depending on materials and additives,
including gel or physical barriers, clot
activators and/or anticoagulants. IRMACount SHBG has not been tested with all
possible variations of tube types. Consult
the section on Alternate Sample Types for
details on tubes that have been tested.
Volume Required: 10 µL of serum per
tube
Storage: 2–8°C for 7 days, or 2 months at
–20°C.
Before assay, allow samples to come to
room temperature (15–28°C) and mix by
gentle swirling or inversion. Aliquot, if
necessary, to avoid repeated thawing and
freezing. (Do not attempt to thaw
specimens by heating them in a
waterbath.)
Immunoassay
Micropipet: 10 µL. For the 10 µL sample
addition, use a disposable-tip pipet, rather
than a positive-displacement pipet, to
minimize the risk of carryover.
Immunometric Assay
Procedure
Repeating dispensers or micropipets:
50 µL and 200 µL
1
4
All components must be at room
temperature (15–28°C) before use.
Label fourteen Ligand-Coated Tubes
A (nonspecific binding) and B through
G ("maximum binding") in duplicate.
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Label additional ligand-coated tubes,
also in duplicate, for controls and
patient samples.
Optionally, label two plain (uncoated)
12x75 mm polystyrene tubes T (total
counts) in duplicate, and set them
aside until step 8.
Calibrators
Approximate
nmol/L
T*
—
A (NSB)
0
B
1
C
3
D
10
E
30
F
90
G ("MB")
180
Anti-Ligand, be careful to avoid
carryover contamination.
6
Shake for 30 minutes on a rack
shaker.
7
Decant and drain thoroughly. Add
2 mL of Buffered Wash Solution to
each tube. Wait 1 to 2 minutes, then
decant thoroughly.
Removing all visible moisture will
greatly enhance precision. After the
wash, using a foam decanting rack,
decant the contents of all tubes. Then
strike the tubes sharply on absorbant
paper to shake off all residual
droplets.
8
Note: The values of the calibrators
are lot-specific. Refer to the calibrator
vial labels for values in nmol/L.
Pipet 10 µL of each calibrator, control
and patient sample into the tubes
prepared.
Pipet directly to the bottom.
Samples expected to contain SHBG
concentrations greater than the
highest calibrator (180 nmol/L) should
be diluted in the zero calibrator. The
use of disposable-tip micropipets is
recommended, to avoid carryover
from sample to sample. Automatic
pipettor-diluters should not be used
unless the possibility of carryover has
been evaluated and found to be
insignificant.
3
Add 200 µL of Ligand-Labeled SHBG
MAb to all tubes except the T tubes.
Shake the rack.
Pipet directly to the bottom. A
repeating dispenser is recommended
for this step, and for the addition of
SHBG Anti-Ligand at step 5 and tracer
at step 8.
4
Incubate for 30 minutes at room
temperature (15–28°C).
5
Add 50 µL of Anti-Ligand (BLUE) to all
tubes except the T tubes.
Pipet directly to the top of the
reaction mixture. In dispensing the
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
125
I SHBG MAb to
Pipet directly to the bottom, and
make sure that sample and tracer are
thoroughly mixed, without foaming. No
more than 10 minutes should elapse
during the dispensing of the tracer. A
repeating dispenser is recommended
for this step and for the addition of
Anti-Ligand at step 5. Set the
(optional) T tubes aside for counting
(at step 11); they require no further
processing.
* Optional
2
Add 200 µL of
every tube.
9
Shake for 30 minutes on a rack
shaker.
10 Decant and drain thoroughly. Add
2 mL of Buffered Wash Solution to
each tube. Wait 1 to 2 minutes, then
decant thoroughly. Again add 2 mL of
Buffered Wash Solution, wait 1 to
2 minutes, then decant and drain
thoroughly.
Removing all visible moisture will
greatly enhance precision. After the
second wash, decant the contents of
all tubes (except the T tubes), using a
foam decanting rack and allow them
to drain for 2 or 3 minutes. Then strike
the tubes sharply on absorbant paper
to shake off all residual droplets.
11 Count for 1 minute in a gamma
counter.
In multi-head gamma counters, the
(optional) Total Counts tubes should
be separated from the remaining
assay tubes by at least one space, to
minimize the possibility of spillover.
5
Calculation and Quality Control
To calculate SHBG concentrations from a
log-log representation of the calibration
curve, first correct the counts per minute
(CPM) of each pair of tubes by subtracting
the average CPM of the nonspecific
binding tubes (calibrator A):
Net Counts = (Average CPM) minus (Average
NSB CPM)
Then determine the binding (%B/B180 here
called "%B/MB") of each pair of tubes as a
percent of "maximum binding," with the
NSB-corrected counts of the highest
calibrator (calibrator G) taken as 100%:
Percent Bound = (Net Counts / Net MB Counts)
× 100
Using the 3-cycle log-log graph paper, plot
Percent Bound versus Concentration for
each of the nonzero calibrators B through
G, and draw a curve approximating the
path of these points. (Connect the
calibration points with arcs or straight line
segments. Do not attempt to fit a single
straight line to the data.) SHBG
concentrations for controls and unknowns
within range of the nonzero calibrators
may then be estimated from the calibration
curve by interpolation. An additional plot of
Percent Bound versus Concentration for
the three or four lowest calibrators on
linear-linear graph paper (not supplied)
may be used for interpolation near zero
dose. For samples assayed under dilution,
multiply by the appropriate dilution factor.
Comments: Although other approaches
are acceptable, data reduction by the
method just described has certain
advantages from the standpoint of quality
control. In particular, it yields a calibration
curve that is relatively linear in both log-log
and linear-linear representations, and
relatively stable from assay to assay. It
also yields valuable QC parameters,
namely, Percent Bound (%B/B180 or
"%B/MB") values for the nonzero
calibrators.
A still more informative graph, conveying a
sense of within-assay reproducibility as a
function of concentration, can be obtained
by plotting the Percent Bound values of
individual calibrator tubes, rather than first
averaging the CPM of replicates. It is good
QC practice to construct the
recommended log-log plot of the
6
calibration curve, even where the
calculation of results is handled by
computer.
Alternatives: Although Percent Bound
can be calculated directly from Average
CPM, correction for nonspecific binding
usually produces a calibration curve that is
more nearly linear throughout its range. A
calibration curve can also be constructed
by plotting CPM or Average CPM directly
against Concentration on either log-log or
linear-linear graph paper. (Semi-log graph
paper should not be used.) This approach
has the virtue of simplicity, but is less
desirable from the standpoint of quality
control.
Computerized Data Reduction: "Pointto-point" methods, including linear and
cubic spline fits, are suitable for use with
the IRMA-Count SHBG system. However,
since point-to-point methods provide little
assistance in monitoring the integrity of an
assay, it is important to prepare the
recommended log-log plot of the
calibration curve, either manually or by
computer, as a quality control step.
Data reduction techniques based on the
logistic model may also be applicable.
Within this family, curve fitting routines
based on the 4- or 5-parameter logistic are
the most suitable candidates. Bear in
mind, however, that some algorithms
currently in use may not converge
successfully, even when the logistic model
is true to the data. If a logistic method is
adopted, it is essential to verify its
appropriateness for each day's assay by
monitoring the backcalculation of the
calibrators, and other parameters. In
addition, a plot of the calibration curve in a
log-log representation is highly
recommended, as this is more informative
than the conventional semi-log plot.
Sample Handling: The instructions for
handling and storing patient samples and
components should be carefully observed.
Dilute patient samples expected to contain
SHBG concentrations greater than the
highest calibrator (180 nmol/L) with the
zero calibrator before assay. All samples,
including the calibrators and controls,
should be assayed at least in duplicate. It
is important to use a disposable-tip
micropipet, changing the tip between
samples, in order to avoid carryover
contamination. Positive-displacement
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
pipets and automatic pipettor-diluters
should only be used if the possibility of
carryover has been evaluated and found
to be insignificant. Pairs of control tubes
may be spaced throughout the assay to
help verify the absence of significant drift.
Inspect the results for agreement within
tube pairs.
Gamma Counter: To minimize the
possibility of spillover in multi-well gamma
counters, the (optional) total counts tubes
should be separated by one or more
spaces from the other assay tubes.
125
Alternatively, add only 50 µL of the I
SHBG MAb to each of the T (total counts)
tubes at step 8, and multiply the observed
counts per minute in these tubes by 4.
Controls: Controls or serum pools with at
least two SHBG concentration levels (low
and high) should routinely be assayed as
unknowns, and the results charted from
day to day as described in Westgard JO,
et al. A multi-rule chart for quality control.
Clin Chem 1981;27:493-501. Repeat
samples are a valuable additional tool for
monitoring interassay precision.
QC Parameters: We recommend keeping
track of these performance measures:
T = Total Counts (as counts per minute)
%NSB = 100 × (Average NSB Counts / Total
Counts)
%MB = 100 × (Net MB Counts / Total Counts)
And the Percent Bound ("%B/MB") values
of all but the highest of the nonzero
calibrators, for example:
%C/MB = 100 × (Net Calibrator "C" Counts / Net
MB Counts)
Record Keeping: It is good laboratory
practice to record for each assay the lot
numbers of the components used, as well
as the dates when they were first
reconstituted or opened.
Further Reading: See Dudley RA, et al.
Guidelines for immunoassay data
reduction. Clin Chem 1985; 31:1264-71.
Example Run: For illustration only; not for
calculating results from another run.
Because the calibrator values are
lot-specific, concentrations listed in the
right-most column may not match the
values of the calibrators supplied in your
shipment. (See "Example Run" table.)
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Expected Values
To determine SHBG reference ranges for
men and nonpregnant women, a total of
233 serum samples were collected from
adults with normal total testosterone
levels. All samples were assayed by the
IRMA-Count SHBG procedure, with the
results tabulated below.
Group
Central 95% Median
(nmol/L)
(nmol/L)
n
Males
10–73
31
122
Females
(nonpregnant)
16–120
52
111
Consider these limits as guidelines only.
Each laboratory should establish its own
reference ranges.
Interpretation of Results
Decreased SHBG levels are often found in
hirsutism, acne vulgaris and the polycystic
9
ovary syndrome. Wilke and Utley, for
example, report decreased SHBG levels in
31% of a series of 22 hirsute patients;
while Cunningham and McKenna, in a
study of 92 women with hirsutism, found
5,11
suppressed SHBG levels in 32%.
SHBG levels may be modestly reduced in
hypothyroidism, acromegaly, Cushing's
1,9
disease and hyperprolactinemia. SHBG
also tends to be suppressed in obesity
and after the administration of androgens,
notably testosterone, or drugs, like
danazol, which compete with androgens
1,4,8,9,10
for binding sites on SHBG.
Glucocorticoids and growth hormone have
likewise been associated with decreased
9
SHBG levels.
Elevated SHBG may be encountered in
1,4
hyperthyroidism and hepatic cirrhosis.
High levels are also found in a variety of
3,10
other conditions, such as pregnancy.
Increases may sometimes be seen after
the administration of estrogens – e.g. in
the form of certain types of oral
contraceptive – or as a consequence of
hepatic enzyme induction by drugs such
1,3,7,9,10
as phenytoin.
The use of dexamethasone in the
treatment of women with hyperandrogenic
hirsutism typically leads to an increase in
4,5
SHBG concentrations.
7
Limitations
As is true for thyroid hormone-binding
globulin (TBG) and other transport
proteins, SHBG results should be
interpreted in conjunction with measures
of the hormones which it binds, notably
testosterone. Combining such information
in the form of a free androgen index (FAI)
— computed as the ratio of total
testosterone to SHBG — has been
reported to yield better discrimination of
women with hyperandrogenic hirsutism
from healthy women than the use of
1,5,9,11
SHBG levels on their own.
Performance Data
See Tables and Graphs for data
representative of the IRMA-Count SHBG
kit's performance. Results are expressed
in nmol/L.
Calibration Range:
Approximately 1 – 180 nmol/L
The calibrator values are lot-specific.
Analytical Sensitivity: 0.04 nmol/L
Intraassay Precision (Within-Run):
Statistics were calculated for samples
from the results of 20 replicates in a single
run. (See "Intraassay Precision" table.)
Interassay Precision (Run-to-Run):
Statistics were calculated for samples
assayed in 20 different runs. (See
"Interassay Precision" table.)
Specificity: The antibody is highly specific
for SHBG. (See "Specificity" table.)
End-of-run Effect: None up to
approximately 200 tubes. (See "End-ofrun Effect" table.)
Linearity: Samples were assayed under
various dilutions. (See "Linearity" table for
representative data.)
Recovery: Samples spiked 1 to 19 with
three SHBG solutions (100, 200 and
410 nmol/L) were assayed. (See
"Recovery" table for representative data.)
Bilirubin: Presence of bilirubin in
concentrations up to 200 mg/L has no
effect on results, within the precision of the
assay.
Hemolysis: Presence of packed red blood
cells in concentrations up to 30 µL/mL has
no effect on results, within the precision of
the assay.
8
Alternate Sample Type: To assess the
effect of alternate sample types, blood
was collected from 35 volunteers into
plain, heparinized, EDTA and Becton
®
Dickinson SST vacutainer tubes. All
samples were assayed by the IRMACount SHBG procedure, with the following
results. EDTA plasma is not suitable for
use.
(EDTA) = 0.48 (Serum) + 4.4 nmol/L
r = 0.952
(Heparin) = 1.02 (Serum) + 1.5 nmol/L
r = 0.994
(SST) = 0.93 (Plain Tubes) + 2.7 nmol/L
r = 0.991
Means:
61 nmol/L (Serum)
34 nmol/L (EDTA)
64 nmol/L (Heparin)
59 nmol/L (SST)
Method Comparison: The assay was
compared to a commercially available
immunoassay for SHBG (Kit A) on 51
patient samples. By linear regression:
(IRMA-Count) = 1.01 (Kit A) + 3.0 nmol/L
r = 0.984
Means:
54.8 nmol/L (IRMA-Count)
51.1 nmol/L (Kit A)
References
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globulin in clinical perspective. Acta Obstet
Gynecol Scand 1987;66:255-62. 2) Cheng CY,
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proteins as indicators of the metabolic effects of
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Cunningham SK, et al. The relationship between
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conditions. Ann Clin Biochem 1985;22:489-97.
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usefulness of plasma SHBG and androgen
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Dunn JF, Nisula BC, Rodbard D. Transport of
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and corticosteroid-binding globulin in human
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Lapidus L, Lindstedt G, et al. Concentrations of
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
sex-hormone binding globulin and corticosteroid
binding globulin in serum in relation to
cardiovascular risk factors and to 12-year
incidence of cardiovascular disease and overall
mortality in postmenopausal women. Clin Chem
1986;32:146-52. 9) Lindstedt G, et al. Sex
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Five, Cardiff 1988; 48-56. 11) Wilke TJ, Utley
DJ. Total testosterone, free-androgen index,
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testosterone by analog RIA compared in hirsute
women and in otherwise-normal women with
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clinical significance. Ann Clin Biochem
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Clinical Laboratory Standards. Procedures for
the collection of diagnostic blood specimens by
venipuncture; approved standard. 4th ed.
NCCLS Document H3-A4, Wayne, PA: NCCLS,
1998.
Technical Assistance
In the United States, contact Siemens
Healthcare Diagnostics Technical
Services department. Tel: 877.229.3711.
To place an order: Tel: 800.255.3232.
Outside the United States, contact your
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Diagnostics Inc. is certified to ISO 13485:2003.
Tables and Graphs
Example Run
Tube
1
T7
Duplicate Average
CPM2
CPM3
Net
CPM4
Approx.
Percent SHBG
5
Bound nmol/L6
220,145
221,104
222,062
A
(NSB)8
341
376
359
0
B
1,723
1,724
1,724
1,365
1.0%
1
C
4,453
4,671
4,562
4,203
3.2%
3
D
13,597
14,074
13,836
13,477
10.1%
10
E
37,373
37,619
37,496
37,137
27.9%
30
F
87,724
88,262
87,993
87,634
65.9%
90
G
132,582
132,963 132,604
9
("MB") 133,344
100%
180
0
10
Unknowns
X1
12,880
13,143
13,012
12,653
9.5%
9.4
X2
65,911
67,535
66,723
66,364
49.9%
30
X3
105,825
108,072 107,713 81.0%
110,318
125
Quality Control Parameters:11
T7 = 221,104 cpm
%NSB8 = 0.16%
%MB9 = 60.1%
Intraassay Precision (nmol/L)
Mean1
SD2
CV3
1
10.8
0.3
2.8%
2
31.9
1.2
3.8%
3
105
5.6
5.3%
Interassay Precision (nmol/L)
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Mean1
SD2
CV3
1
11.7
1.0
8.5%
2
29
2.3
7.9%
3
92
7.2
7.9%
9
Specificity
Recovery (nmol/L)
Compound1
Apparent
Conc.3
Added2
Alpha-fetoprotein
(AFP)
Cortisol
400 IU/mL
ND
100,000 ng/mL
ND
11-Deoxycortisol
4,000 ng/mL
5αDihydroxytestosterone
Estradiol
Testosterone
1
ND
20,000 ng/mL
ND
3,600 pg/mL
ND
Human serum albumin
(HSA)
Solution1 Observed2 Expected3 %O/E4
5 g/dL
ND
20,000 ng/mL
ND
2
—
28
—
—
A
31
32
97%
B
37
37
100%
C
49
47
104%
—
50
—
—
A
52
53
98%
B
56
58
97%
C
66
68
97%
4
ND: not detectable
End-of-run Effect (nmol/L)
Tubes1
22–31
Tubes
84–93
Tubes
146–155
Tubes
208–217
1
7.8
7.2
7.2
7.1
2
34
33
32
31
3
59
57
54
56
4
79
84
78
78
5
142
139
135
127
Linearity (nmol/L)
Dilution
1
2
3
1
2
Observed Expected
3
4
%O/E
16 in 165
50
—
—
8 in 16
27
25
108%
4 in 16
13.7
12.5
110%
2 in 16
7.1
6.3
113%
106%
1 in 16
3.3
3.1
16 in 16
63
—
—
8 in 16
31
32
97%
4 in 16
16.6
15.8
105%
2 in 16
8.7
7.9
110%
1 in 16
4.3
3.9
110%
16 in 16
105
—
—
8 in 16
53
53
100%
104%
4 in 16
27
26
2 in 16
13.0
13.1
99%
1 in 16
7.1
6.6
108%
Deutsch. Example Run: 1Röhrchen, 2Duplikat
CPM, 3Mittelwert CPM, 4Netto CPM, 5Prozent
Bindung, 6Ca. SHBG, nmol/L, 7Total, 8%NSB,
9
%MB, 10Unbekannte,
11
Qualitätskontrollparameter. Intraassay
Precision: 1Mittelwert, 2SD
(Standardabweichung), 3CV
(Variationskoeffizient). Interassay Precision:
1
Mittelwert, 2SD (Standardabweichung), 3CV
(Variationskoeffizient). Linearity: 1Verdünnung,
2
Beobachtet (B), 3Erwartet (E), 4% B/E, 516 in
16. Recovery: 1Lösung, 2Beobachtet (B),
3
Erwartet (E), 4% B/E. Specificity: 1Verbindung,
2
zugesetzte Menge, 3Gemessene Konzentration,
4
NN: Nicht nachweisbar. End-of-Run Effect:
1
Röhrchen.
Español. Example Run: 1Tubo, 2Duplicado
CPM, 3Media CPM, 4 CPM Netas, 5Porcentaje
de unión, 6SHBG, aprox., nmol/L, 7Total,
8
%NSB, 9%MB, 10Desconocidos, 11Parámetros
del control de calidad. Intraassay Precision:
1
Media, 2DS, 3CV. Interassay Precision:
1
Media, 2DS, 3CV. Linearity: 1 Dilución,
2
Observado (O), 3Esperado (E), 4%O/E, 516 en
16. Recovery: 1Solución, 2Observado (O),
3
Esperado (E), 4%O/E. Specificity:
1
Compuesto, 2Cantidad añadida, 3Concentración
aparente, 4ND: no detectable. End-of-Run
Effect: 1Tubos.
Français. Exemple de série: 1Tube, 2Duplicate
CPM, 3 CPM moyen, CPM corrigé,
5
Pourcentage lié, 6Approx. SHBG, nmol/L,
7
Total, , 8%NSB, 9%MB, 10Patients, 11Paramètres
Contrôle de Qualité. Précision intra dosage:
1
Moyenne, 2SD, 3CV. Précision inter dosage:
1
Moyenne, 2SD, 3CV. Linéarité: 1Dilution,
2
Observé (O), 3Attendu (A), 4%O/A, 516 dans 16.
Récupération: 1Solution, 2Observé (O), 3Attendu
(A), 4%O/A. Spécificité: 1Composé, 2ajouté,
3
Concentration apparente, 4ND: non détectable.
Effet de position: 1Tubes.
Italiano. Example Run: 1Provetta, 2CPM in
duplicato, 3CPM Medio, 4CPM Netti,
5
Percentuale di Legato, 6Appross. SHBG,
nmol/L, 7Totale, 8%NSB, 9%MB, 10 Campioni
Non Noti, 11Parametri per il Controllo di Qualità.
10
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Intraassay Precision: 1Media, 2SD (Deviazione
Standard), 3CV (Coefficiente di Variazione).
Interassay Precision: 1Media, 2SD (Deviazione
Standard), 3CV (Coefficiente di Variazione).
Linearity: 1Diluizione, 2Osservato (O), 3Atteso
(A), 4%O/A, 516 in 16. Recovery: 1Soluzione,
2
Osservato (O), 3Atteso (A), 4%O/A. Specificity:
1
Composto, 2quantità aggiunta, 3Concentrazione
apparente, 4ND: non determinabile. End-of-Run
Effect: 1Provette.
Português Exemplo de ensaio: 1Tubo,
2
Duplicado CPM, 3Média de CPM, 4 CPM
Líquida, 5Percentagem de Ligação, 6SHBG
Aprox., nmol/L, 7Total, 8%NSB, 9%MB,
10
Desconhecidas, 11Parâmetros do controlo de
qualidade. Precisão Intra-ensaio: 1Média,
2
Desvio padrão, 3Coeficiente de variação.
Precisão Inter-ensaio: 1Média, 2Desvio padrão,
3
Coeficiente de variação. Linearidade:
1
Diluição, 2Observado (O), 3Esperado (E),
4
%O/E, 516 em 16. Recuperação: 1Solução,
2
Observado (O), 3Esperado (E), 4%O/E.
Especificidade: 1Composto, 2Quantidade
adicionada, 3Concentração Aparente, 4ND: não
detectável. Efeito Fim-de-Série: 1Tubos.
Deutsch
SHBG erreicht bei Frauen regelmäßig
höhere Spiegel als bei Männern, da das
Verhältnis von Östrogenen zu
Androgenen bei Frauen höher ist. Aus
diesem Grund kann die SHBGKonzentration in der Spätschwangerschaft
oder nach Östrogengabe besonders hohe
Werte erreichen. Die Gabe von
Androgenen hingegen führt regelmäßig zu
erniedrigten SHBG-Spiegeln.
Testosteron liegt im Blutstrom
hauptsächlich an Proteine gebunden vor,
meist an SHBG, aber auch an Albumin
und Cortisol-bindendem Globulin. Da
Unterschiede in der Konzentration der
Transportproteine den Testosteronspiegel
beeinflussen können, ist es üblich, zur
Ergänzung der Gesamt Testosteron
Bestimmung, den SHBG-Spiegel zu
bestimmen. Der „Freie Androgen-Index“
(FAI), der als Quotient der
Konzentrationen des GesamtTestosterons und SHBG berechnet wird,
ist ein wertvoller Indikator zum Nachweis
eines abnormen Androgenstatus, wie z. B.
1,4,7,11
Hirsutismus.
Methodik
IRMA-Count SHBG
Anwendung: Der IRMA-Count SHBG ist
ein immunradiometrischer Festphasen
Assay zur quantitativen Bestimmung des
Sexualhormon-bindenden Globulin
(SHBG) im Serum. Der Assay ist
ausschließlich in der In-vitro- Diagnostik
im Zusammenhang mit der
Differentialdiagnose von Hirsutismus
einzusetzen.
Artikelnummern: RKSH1 (100 Tests)
Die Packung mit 100 Röhrchen
enthält weniger als 20 Mikrocurie
125
(740 Kilobequerel) an Iradioaktivem Anti-SHBG.
Klinische Relevanz
Sexualhormon-bindendes Globulin
(SHBG) ist ein in der Leber synthetisiertes
Glykoprotein, das Testosteron und 5αDihydrotestosteron mit hoher und
1,9
Östradiol mit geringer Affinität bindet. Es
hat eine einzige Bindungsstelle für die
Sexualhormone, ein Molekulargewicht von
80 000–100 000 Dalton und besteht aus
zwei, etwa gleich großen, Untereinheiten.
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Der IRMA-Count SHBG ist ein
immunradiometrischer Assay mit ligandbeschichteten Röhrchen und
125
monoklonalen Antikörpern, einer Imarkiert, der andere Ligand-markiert.
SHBG in der Patientenprobe wird in einer
Reaktion, die in flüssiger Phase abläuft,
von den Ligand-markierten monoklonalen
Antikörpern gebunden. Die
Brückenbildung zwischen dem Ligand auf
der Röhrchenwand und dem Ligandmarkierten Antikörper erfolgt über den
anti-Liganden. Schließlich wird die
125
Reaktion der I-markierten Antikörper mit
der (am Röhrchen) gebundenen Fraktion
eingeleitet, überschüssiger Tracer aus
dem Röhrchen gewaschen und die
Röhrchen im Gamma-Counter gemessen.
Die Counts sind der SHBG Konzentration
in der Probe proportional.
Zu pipettierende Reagenzien: 3
Testdauer: 90 minuten
Totalaktivität zum Zeitpunkt der
Markierung: ca. 300 000 cpm
11
Hinweise und
Vorsichtsmaßnahmen
Zur In-vitro-Diagnostik.
Reagenzien: Die Packung mit den
Reagenzien sollte bei 2–8°C in einem
Kühlschrank gelagert werden, der für
radioaktives Material ausgewiesen ist. Die
Entsorgung muss nach den jeweils
gültigen Gesetzen erfolgen.
Die Reagenzien dürfen nur bis zum
Verfallsdatum verwendet werden.
Einige Komponenten des Kits können
Material humanen Ursprungs und/oder in
anderer Weise gefährliche Inhaltsstoffe
enthalten, die es unbedingt notwendig
machen die folgenden
Vorsichtsmaßnahmen einzuhalten.
Die generell geltenden
Vorsichtsmaßnahmen sind einzuhalten
und alle Komponenten als potenziell
infektiös zu behandeln. Alle aus
menschlichem Blut gewonnenen
Materialien wurden auf Syphilis,
Antikörper gegen HIV-1 und HIV-2,
Hepatitis-B-Oberflächenantigen und
Hepatitis-C-Antikörper untersucht und
negativ befundet.
Bestimmten Komponenten wurde
Natriumazid (<0,1 g/dl) hinzugefügt. Um
die Bildung von explosiven Metallaziden in
Blei- und Kupferrohren zu vermeiden,
sollten die Reagenzien nur zusammen mit
großen Wassermengen in die Kanalisation
gespült werden.
Wasser: Destilliertes bzw. deionisiertes
Wasser benutzen.
Radioaktivität
Der Umgang mit radioaktivem Material ist
in Deutschland genehmigungspflichtig.
Deshalb muss der Siemens Healthcare
Diagnostics eine Kopie der aktuellen
gültigen Umgangsgenehmigung des
Kunden vorliegen, bevor radioaktive
Reagenzien versendet werden dürfen. Die
Strahlenschutzverordnung ist zu
beachten.
Das radioaktive Material ist gemäß der
jeweiligen Umgangsgenehmigung zu
handhaben.
Die Strahlenexposition ist zu minimieren.
Spritzer sind sofort aufzuwischen und die
betroffene Oberfläche zu dekontaminieren. Aerosolbildung ist zu vermeiden.
12
Flüssiger und fester radioaktiver Abfall
sind unter Beachtung der gültigen
Richtlinien zu entsorgen.
Bestandteile der Testpackung:
Vorbereitung
Ligand-markierte SHBG Antikörper
(SHR1)
22 ml ligand-markierte monoklonale
Antikörper (mit Konservierungsmittel). Bei
2–8°C für 60 Tage nach dem Öffnen oder
bis zum Verfallsdatum auf der Flasche
haltbar.
RKSH1: 1 Flasche.
125
I SHBG Antikörper (SHR2)
Lyophilisierte, jodierte monoklonale antiSHBG Antikörper (mit
Konservierungsmittel). Jede Flasche mit
11 ml destilliertem oder deionisiertem
Wasser rekonstituieren. Durch
vorsichtiges Umdrehen mischen. Bei
2–8°C für 30 Tage nach der
Rekonstitution oder bis zum Verfallsdatum
auf der Flasche haltbar.
RKSH1: 2 Flaschen.
SHBG Standards (SHR3–9)
7 Flaschen, A – G, mit lyophilisierten
SHBG Standards in einer gepufferten
Matrix. Mindestens 30 Minuten vor dem
Testbeginn, den 0-Standard A mit 3,0 ml
destilliertem oder deionisiertem Wasser,
und die restlichen Standards B – G mit je
1,0 ml rekonstituieren. Durch vorsichtiges
Umdrehen oder Wirbeln mischen. Für 2
Monate bei –20°C (portioniert) haltbar
RKSH1: 1 Set.
Die Standards haben chargen-spezifische
Werte von ca. 0, 1, 3, 10, 30, 90 und
180 nmol/l SHBG. Die exakten
Konzentrationen können den Etiketten auf
den Flaschen entnommen werden.
Weitere Standardkurvenpunkte können
durch Mischen der Standards hergestellt
werden.
Ligand-beschichtete Röhrchen (PST)
Ligand-beschichtete Polystyrol-Röhrchen,
verpackt in wiederverschließbaren
Plastikbeuteln (mit Konservierungsmittel).
Kühl lagern, vor Feuchtigkeit schützen und
nach dem Öffnen wieder sorgfältig
verschließen. Lagerung bei 2–8°C bis zum
Verfallsdatum. Farbe: klar.
RKSH1: 100 Röhrchen.
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
SHBG Anti-Ligand (SHILB)
2,8 ml anti-Ligand, reagierend mit den
Ligand-markierten monoklonalen
Antikörpern und den Ligand-beschichteten
Röhrchen. Bei 2–8°C für 30 Tage nach
dem Öffnen oder bis zum Verfallsdatum
auf der Flasche haltbar. Der in dem IRMA
Count SHBG Testbesteck mitgelieferte
anti-Ligand ist nicht mit denen anderer
IRMA-Count Testbestecke austauschbar.
Farbe: Blau.
RKSH1: 2 Flaschen.
Gepufferte Waschlösung, Konzentrat
(2TSBW)
60 ml konzentrierte, gepufferte
Salzlösung, mit Detergenz. Unter
Zuhilfenahme eines Transferbehälters
jede Flasche Konzentrat mit 600 ml
destilliertem oder deionisiertem Wasser
lösen, das Endvolumen beträgt 660 ml.
Bei 2–8°C für 6 Monate nach Herstellung
stabil.
RKSH1: 1 Flasche.
SHBG Kontrollen (SHCO1–2)
2 Flaschen beschriftet als SHBG
Kontrollen 1 und 2, mit lyophilisiertem
SHBG in einer gepufferten Matrix.
Mindestens 30 Minuten vor dem
Testbeginn jede Flasche mit exakt 1,0 ml
destilliertem oder deionisiertem Wasser
rekonstituieren. Durch vorsichtiges
Umdrehen mischen. Für 2 Monate bei
–20°C (portioniert) haltbar. Die Werte
können der Packungsbeilage SHBG
Kontrollen entnommen werden.
RKSH1: 1 Set.
Erforderliche Laborgeräte und
Hilfsmittel
Gammacounter – kompatibel mit
12x75 mm Röhrchen
Schüttler – ca. 200 Zyklen pro Minute
einstellen
Reagenzienvorbereitung
Destilliertes oder deionisiertes Wasser
Pipette – für 11 ml
Volumetrische Pipetten – für 1 ml und 3 ml
Messzylinder – zum Abmessen von
600 ml
Plastikbehälter mit Verschluss – zur
Herstellung und Lagerung der gepufferten
Waschlösung
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Immunoassay
Mikropipette: 10 µl. Für die Zugabe von
10 µl Probe wird die Verwendung einer
Pipette mit Einmalspitzen (keine
Verdrängungspipetten) empfohlen, um
Verschleppungen zu vermeiden.
Dispenser oder Mikropipetten: 50 µl und
200 µl
Dispenser – Für die Zugabe von 2,0 ml
der gepufferten Waschlösung
Dekantierständer – erhältlich bei Siemens
Healthcare Diagnostics (Artikelnummer:
FDR).
Logarithmisches Papier, 3 Dekaden
Probengewinnung
Es ist keine besondere Vorbereitung der
Patienten nötig. Blutentnahme durch
13
Venenpunktion in Röhrchen ohne
Zusätze (Antikoagulantien),
Abnahmezeitpunkt notieren. Probe
gerinnen lassen, Trennung des Serums
von den Blutzellen
Lipämie kann den Assay stören.
Lipämische Proben sollten durch
Ultrazentrifugation geklärt werden.
Bei hämolysierten Proben besteht die
Möglichkeit einer unsachgemäßen
Handhabung vor Eintreffen im Labor,
daher sind die Ergebnisse mit Vorsicht zu
interpretieren.
EDTA Plasma ist für den Gebrauch
ungeeignet.
Heparin Plasma hat keinen Einfluss auf
den Assay.
Blutentnahmeröhrchen von verschiedenen
Herstellern können differierende Werte
verursachen. Dies hängt von den
verwendeten Materialien und Additiven
(Gel oder physische Trennbarrieren,
Gerinnungsaktivatoren und /oder
Antikoagulantien) ab. IRMA-Count SHBG
sind nicht mit allen möglichen
Röhrchenvariationen ausgetestet worden.
Details der getesteten Röhrchenarten sind
dem Kapitel "Alternative Probenarten" zu
entnehmen.
Erforderliche Menge: 10 µl Serum pro
Röhrchen
Lagerung: Bei 2–8°C für 7 Tage, oder bei
–20°C für 2 Monate.
Die Proben vor Testbeginn auf
Raumtemperatur (15–28°C) bringen und
13
durch vorsichtiges Umdrehen und Wirbeln
mischen. Um wiederholtes Einfrieren und
Auftauen zu vermeiden bei Bedarf
portionieren. (Gefrorene Proben dürfen
nicht durch Erhitzen im Wasserbad
aufgetaut werden.)
automatische Pipettor-Dilutoren
sollten nur verwendet werden, wenn
eine mögliche Verschleppung
untersucht und für vernachlässigbar
befunden wurde.
3
Immunometrische
Testdurchführung
Direkt auf den Boden des
Röhrchens pipettieren. Die
Verwendung eines Dispensers wird
für diesen Schritt und für die Zugabe
von SHBG Anti-Ligand im Schritt 5
und dem Tracer im Schritt 8
empfohlen.
Alle Testkomponenten vor Testbeginn auf
Raumtemperatur (15–28°C) bringen.
1
Jeweils 2 Ligand-beschichtete
Röhrchen mit A (unspezifische
Bindung, 0-Standard) und von B bis G
(Maximalbindung) beschriften. Jeweils
2 weitere Ligand-beschichtete
Röhrchen für Kontrollen und
Patientenproben beschriften.
Optional, 2 unbeschichtete 12x75 mm
Polystyrol-Röhrchen mit T
(Totalaktivität) beschriften und bis
zum Schritt 8 beiseite stellen.
Standards
ca.
nmol/l
T*
—
A (NSB)
0
B
1
C
3
D
10
E
30
F
90
G ("MB")
180
4
Für 30 Minuten bei Raumtemperatur
(15–28°C) inkubieren.
5
50 µl Anti-Ligand (BLAU) in alle
Röhrchen, außer T Röhrchen,
hinzufügen.
Direkt oben auf die
Reaktionsmischung pipettieren.
Beim Verteilen des anti-Liganden
Kontamination vermeiden.
6
30 Minuten auf einem Schüttler
inkubieren.
7
Vollständig dekantieren und trocknen
lassen. 2 ml gepufferte Waschlösung
in jedes Röhrchen geben, 1–2
Minuten stehen lassen, dann
vollständig dekantieren.
Vollständiges Entfernen der
Flüssigkeit verbessert die Präzision
deutlich. Nach dem Waschen mit Hilfe
eines Dekantierständers alle
Röhrchen dekantieren. Anschließend
werden die Röhrchen kräftig auf
Fließpapier ausgeklopft, um alle
restlichen Tröpfchen zu entfernen.
* Optional
Bitte beachten: Die Konzentrationen
der Standards sind chargenspezifisch.
Die Werte können den Etiketten auf
den Standardflaschen entnommen
werden.
2
Jeweils 10 µl der Standards,
Kontrollen und Patientenproben in die
vorbereiteten Röhrchen pipettieren.
Direkt auf den Boden des
Röhrchens pipettieren.
Patientenproben mit Konzentrationen
oberhalb des Messbereichs von
180 nmol/l sollten vor der Messung
mit 0-Standard verdünnt werden. Um
Verschleppung zu vermeiden, wird die
Verwendung von EinmalPipettenspitzen empfohlen.
Verdrängungspipetten sowie
14
In jedes Röhrchen 200 µl Ligandmarkierte SHBG Antikörper (außer T)
pipettieren. Den Ständer schütteln.
8
125
200 µl I SHBG Antikörper in jedes
Röhrchen hinzufügen.
Direkt auf den Boden pipettieren.
Vergewissern Sie sich, dass Probe
und Tracer ohne Schaumbildung gut
gemischt sind. Das Verteilen des
Tracers sollte nicht länger als 10
Minuten dauern. Die Verwendung
eines Dispensers wird für diesen
Schritt und für die Zugabe des antiLiganden bei Schritt 5 empfohlen. Die
T-Röhrchen bis zur Messung (siehe
Schritt 11) beiseite stellen; sie
bedürfen keiner weiteren Behandlung.
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
9
30 Minuten auf einem Schüttler
inkubieren.
10 Vollständig dekantieren und trocknen
lassen. 2 ml gepufferte Waschlösung
in jedes Röhrchen geben, 1–2
Minuten stehen lassen, dann
vollständig dekantieren. Erneut 2 ml
gepufferte Waschlösung hinzugeben,
1 – 2 Minuten warten und vollständig
dekantieren und trocknen lassen.
Vollständiges Entfernen der
Flüssigkeit verbessert die Präzision
deutlich. Nach dem 2. Waschgang,
mit Hilfe eines Dekantierständers alle
Röhrchen (außer die T-Röhrchen)
dekantieren und 2–3 Minuten
umgedreht stehen lassen.
Anschließend werden die Röhrchen
kräftig auf Fließpapier ausgeklopft, um
alle restlichen Tröpfchen zu entfernen.
11 Für 1 Minute im Gamma Counter
messen.
In Mehrkanal-Gamma-Countern
sollten die T-Röhrchen mindestens 1
Position Abstand von den übrigen
Teströhrchen haben, um ein
“Spillover” zu vermeiden.
Berechnung und
Qualitätskontrolle
Um die Konzentrationen aus der Log-Log
Darstellung der Standardkurve abzulesen
werden zunächst der Mittelwert jedes
Röhrchenpaars, bereinigt um den
Mittelwert der NSB (Standard A) Counts
pro Minute (cpm) berechnet:
Netto Counts = (Mittelwert CPM) minus
(Mittelwert NSB CPM)
Anschließend wird die Bindung jedes
Röhrchenpaars als Prozent der
Maximalbindung (MB, Bmax) bestimmt
(%B/MB). Hierzu werden die mittleren
CPM des G-Standards korrigiert um die
mittlere NSB als 100% gesetzt:
Prozentbindung = (Netto Counts / Netto MB
Counts) × 100
Die Prozentbindungen der Standards
werden gegen die Konzentration auf
Logarithmenpapier mit je 3 Dekaden
aufgetragen und durch eine Kurve mit
bestmöglicher Annäherung an diese
Punkte verbunden. (Die einzelnen
Standardkurvenpunkte sollten jeweils mit
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
einem Bogen oder einer geraden Linie
aber nicht durch eine gerade Linie durch
alle Punkte verbunden werden.) SHBG
Konzentrationen innerhalb des
Konzentrationsbereichs der Standards
können an der Kurve durch Interpolation
abgelesen werden. Die Prozentbindungen
der drei niedrigsten Standards können
zusätzlich auf linearem Papier gegen die
Konzentration aufgetragen werden, um
durch Interpolation Ergebnisse in der
Nähe von 0 genauer zu ermitteln. Proben,
die unter Verdünnung gemessen wurden,
müssen mit dem entsprechenden
Verdünnungsfaktor multipliziert werden.
Hinweis: Obwohl auch andere Verfahren
akzeptabel sind, hat die beschriebene
Berechnung der Daten Vorteile im Sinne
der Qualitätskontrolle. Man erhält eine
Standardkurve, die sowohl in der Log-Log
als auch in der Lin-Lin Darstellung
weitgehend linear verläuft und sich von
Ansatz zu Ansatz nur wenig verändert.
Man erhält so auch wichtige Parameter für
die Qualitätskontrolle wie die
Prozentbindungen der Standards mit
Konzentrationen ungleich 0 (%B/Bmax oder
"%B/MB").
Mehr Informationen über die Intra-AssayPräzision als Funktion der Konzentration
vermittelt die direkte Darstellung der
Prozentbindung jedes einzelnen
Standardröhrchens und nicht des
Mittelwertes. Auch wenn die Berechnung
durch ein Computer-Programm erfolgt, ist
die grafische Log-Log Darstellung der
Standardkurve (manuell oder automatisch)
als ein weiterer Schritt der
Qualitätskontrolle empfehlenswert.
Alternative Berechnung: Obwohl die
Berechnung der Prozentbindung auch
direkt aus dem Mittelwert der CPM
erfolgen kann, führt die Korrektur um die
NSB normalerweise eher zu einer über
den gesamten Messbereich linear
verlaufenden Kurve. Eine Standardkurve
kann auch durch das direkte Auftragen
der CPM, bzw. mittleren CPM gegen die
Konzentration auf Log-Log oder Lin-Lin
Papier erstellt werden.
(Halblogarithmisches Papier sollte nicht
verwendet werden.) Dieses Verfahren ist
zwar einfacher, aber weniger hilfreich aus
Sicht der Qualitätskontrolle.
Computergestützte Berechnung:
"Punkt-zu-Punkt" Methoden, insbesondere
15
lineare und kubische-spline
Berechnungen können für den IRMA
Count SHBG angewendet werden. Auch
wenn die Berechnung durch ein
Computerprogramm erfolgt, ist die
grafische Log-Log Darstellung der
Standardkurve (manuell oder automatisch)
als ein weiterer Schritt der
Qualitätskontrolle empfehlenswert.
Für die Berechnung der Daten sind auch
sog. logistische Verfahren anwendbar.
Aus dieser Gruppe sind die 4- oder 5Parameter Logistik am besten geeignet.
Es ist zu berücksichtigen, dass manche
der üblichen Algorithmen sich nicht
erfolgreich annähern, selbst wenn
logistische Modelle die Daten richtig
erfassen. Wird ein logistisches Verfahren
angenommen, ist es in jedem Fall
erforderlich, die Korrektheit des täglichen
Ansatzes mit Hilfe der Rückberechnung
der Standards und anderer Parameter zu
beurteilen. Zusätzlich wird die grafische
Darstellung in Log-Log-Form empfohlen,
da diese mehr Informationen bietet als die
konventionelle halblogarithmische
Darstellung.
Proben-Handhabung: Die Anweisungen
zur Handhabung und Lagerung von
Proben und Komponenten müssen
beachtet werden. Patientenproben mit
erwarteten Konzentrationen über dem
höchsten Standard (180 nmol/l) sollten vor
dem Einsatz in den Test mit 0-Standard
verdünnt werden. Alle Proben, inklusive
Standards und Kontrollen, sollten in
Doppelbestimmung gemessen werden.
Um Verschleppung zu vermeiden ist es
wichtig, Pipetten mit Einwegspitzen zu
verwenden und diese zwischen den
Proben zu wechseln.
Verdrängungspipetten, sowie
automatische Pipettor-Dilutoren sollten nur
verwendet werden, wenn eine mögliche
Verschleppung untersucht und für
vernachlässigbar befunden wurde.
Kontrollpaare sollten an verschiedenen
Stellen des Testansatzes platziert werden,
um eine eventuelle Drift zu erkennen. Die
Einzelergebnisse der Duplikate sollten auf
Übereinstimmung überprüft werden.
Gamma Counter: In Mehrkanal-GammaCountern sollten die T-Röhrchen
mindestens 1 Position Abstand von den
übrigen Teströhrchen haben, um ein
“Spillover” zu vermeiden. Alternativ
125
können auch nur 50 µl des I SHBG
16
Antikörpers in die T-Röhrchen im Schritt 8
pipettiert und anschließend die CPM mit
dem Faktor 4 multipliziert werden.
Kontrollen: Kontrollen mit mindestens 2
SHBG Konzentrationen (niedrig und hoch)
sollten routinemäßig als unbekannte
Proben eingesetzt und von Tag zu Tag
protokolliert werden.
Wiederholungsmessungen von Proben
sind ein wertvolles Hilfsmittel in der
Beurteilung der Interassay Präzision.
Qualitätskontroll-Parameter: Es wird
empfohlen die folgenden Parameter zu
protokollieren:
T = Totalaktivität (als Counts pro Minute)
%NSB = 100 × (Mittelwert NSB Counts / Total
Counts)
%MB = 100 × (Netto Counts / Total Counts)
und die Prozentbindungen (%B/Bmax oder
"%B/MB") aller Standards mit Ausnahme
des höchsten Standards, zum Beispiel:
%C/MB = 100 × (Netto Counts Standard "C" /
Netto Counts MB)
Aufzeichnungen: Es ist gute Laborpraxis
die Chargennummern, sowie das Datum
der ersten Öffnung bzw. Rekonstitution
der verwendeten Komponenten zu
protokollieren.
Literatur: Siehe auch: Dudley RA, et al.
Guidelines for immunoassay data
reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71.
Auswertebeispiel: Dieses Beispiel dient
nur zur Veranschaulichung und ist nicht
dazu geeignet, damit Werte aus einem
anderen Testansatz zu ermitteln. Aufgrund
der Chargenabhängigkeit der Standardkonzentrationen müssen die in der
rechten Spalte der Tabelle gelisteten
Konzentrationen nicht mit den Konzentrationen in Ihrer Lieferung übereinstimmen. (siehe Tabelle "Example Run").
Referenzwerte
Um die SHBG Referenzwerte für Männer
und nicht schwangere Frauen zu
bestimmen, wurden Proben von
insgesamt 233 Erwachsenen mit normalen
Gesamt Testosteron Spiegeln
entnommen. Alle Proben wurden im
IRMA-Count SHBG Verfahren, mit den
nachfolgend tabellierten Ergebnissen
gemessen.
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Gruppe
Grenzen der Methode
zentraler
95% Bereich Median
(nmol/l)
(nmol/l)
n
Männer
10–73
31
122
Frauen (nicht
schwanger)
16–120
52
111
Diese Grenzwerte sind lediglich als
Richtlinien aufzufassen. Jedes Labor
sollte seine eigenen Referenzbereiche
etablieren.
Interpretation der Ergebnisse
Erniedrigte SHBG Spiegel werden häufig
bei Hirsutismus, Akne vulgaris und dem
9
PCO-Syndrom gefunden. Wilke und
Utley, berichteten z.B. über erniedrigte
SHBG Spiegel bei 31% von 22
Hirsutismus-Patienten, während
Cunningham und McKenna, in einer
Studie mit 92 weiblichen HirsutismusPatienten in 32% erniedrigte SHBG
5,11
Spiegel fanden.
SHBG Spiegel können bei Hypothyreose,
Akromegalie, Morbus Cushing und
Hyperprolaktinämie im geringen Maße
1,9
reduziert sein. Ebenso neigt SHBG zu
erniedrigten Werten bei Fettleibigkeit und
nach Gabe von Androgenen, besonders
Testosteron, oder Medikamenten wie
Danazol, welches mit Androgenen um die
1,4,8,9,10
Bindung an SHBG konkurriert.
Glucocorticoide und Wachstumshormone
konnten auf ähnliche Weise mit
erniedrigten SHBG Spiegeln in
9
Verbindung gebracht werden.
Erhöhtes SHBG kann auch bei
Hyperthyreose und Leberzirrhose
1,4
auftreten. Hohe Spiegel werden auch
bei verschiedenen anderen Zuständen,
3,10
wie der Schwangerschaft, gefunden.
Anstiege können manchmal auch bei der
Gabe von Östrogenen beobachtet
werden, z.B. bei bestimmten Formen oral
applizierter Empfängnisverhütungsmittel –
oder als Folge der Induktion hepatischer
Enzyme durch Medikamente wie
1,3,7,9,10
Phenytoin.
Die Behandlung des hyperandrogenen
Hirsutismus bei Frauen mittels
Dexamethason führt typischerweise zu
einem Anstieg der SHBG
4,5
Konzentrationen.
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Wie beim Thyroxin-Bindendem-Protein
(TBG) und anderen Transportproteinen,
sollten SHBG Ergebnisse in Verbindung
mit der Messung der Hormone, die es
bindet, interpretiert werden, hier vor allem
Testosteron. Die Zusammenführung
solcher Informationen in Form des Freien
Androgen Index (FAI) – berechnet als
Verhältnis Gesamt Testosteron/SHBG –
wurde als bessere Diskriminierung
zwischen gesunden Frauen und Frauen
mit hyperandrogenem Hirsutismus
beschrieben als der alleinigen Gebrauch
1,5,9,11
der SHBG Spiegel.
Leistungsdaten
Im folgenden Abschnitt sind Daten
gezeigt, die für die Leistung des IRMACount SHBG repräsentativ sind. Die
Ergebnisse sind als nmol/l ausgedrückt.
Messbereich:
ca. 1 – 180 nmol/l
Die Werte der Standards sind chargenspezifisch.
Analytische Sensitivität: 0,04 nmol/l
Intraassay-Präzision: Statistik aus einem
einzelnen Testansatz mit 20
Einzelmessungen. (Siehe Tabelle
„Intraassay-Precision“.)
Interassay-Präzision: Statistik aus 20
verschiedenen Testansätzen. (Siehe
Tabelle „Interassay-Precision“.)
Spezifität: Hochspezifischer SHBGAntikörper. (siehe Tabelle „Spezifität“.)
"End of Run" Effekt: Tritt bis ca. 200
Röhrchen nicht auf. (Siehe Tabelle "Endof-Run Effect").
Linearität: Proben wurden in
verschiedenen Verdünnungen getestet.
(Repräsentative Daten entnehmen Sie
bitte der Tabelle „Linearität“.)
Wiederfindung: Proben wurden 1:19 mit
3 SHBG Lösungen (100, 200 und
410 nmol/l) versetzt und gemessen.
(Repräsentative Daten entnehmen Sie
bitte der Tabelle „Recovery“.)
Bilirubin: Bilirubin hat in Konzentrationen
bis zu 200 mg/l keinen Einfluss auf die
Ergebnisse, der größer als die Impräzision
des Assays selbst ist.
Hämolyse: Erythrozytenkonzentrate
haben in Konzentrationen bis zu 30 µl/ml
17
keinen Einfluss auf die Messung, der
größer als die Impräzision des Assays
selbst ist.
diagnóstico in vitro y se usa en la
diagnosis diferencial del hirsutismo.
Alternativer Probentyp: Um den Effekt
eines alternativen Probentyps
einzuschätzen, wurde Blut von 35
Freiwilligen in Röhrchen ohne Zusatz,
Heparin, EDTA- und Becton Dickinson
®
SST Vacutainer- Rörchen gesammelt
entnommen. Alle Proben wurden im
IRMA-Count SHBG gemessen. EDTAPlasma ist nicht zur Verwendung
geeignet. Durch lineare Regression:
El kit de 100 tubos contiene
menos de 20 microcurios
125
(740 kilobecquerelios) de I antiSHBG radioactivo.
(EDTA) = 0,48 (Serum) + 4,4 nmol/l
r = 0,952
(Heparin) = 1,02 (Serum) + 1,5 nmol/l
r = 0,994
(SST) = 0,93 (einfachen Röhrchen) + 2,7 nmol/l
r = 0,991
Mittelwerte:
61 nmol/l (Serum)
34 nmol/l (EDTA)
64 nmol/l (Heparin)
59 nmol/l (SST)
Methodenvergleich: Der Assay wurde
mit einem kommerziell erhältlichen
Immunoassay für SHBG (Kit A) an 51
Patientenproben verglichen. Berechnung
der linearen Regression:
(IRMA-Count) = 1,01 (Kit A) + 3,0 nmol/l
r = 0,984
Mittelwerte:
54,8 nmol/l (IRMA-Count)
51,1 nmol/l (Kit A)
Anwendungsberatung
Bei Rückfragen wenden Sie sich bitte an
Ihre Niederlassung.
www.siemens.com/diagnostics
Das Qualitätsmanagement-System der Siemens
Healthcare Diagnostics Inc. ist zertifiziert nach
DIN EN ISO 13485:2003.
Español
SHBG IRMA-Count
Utilidad del análisis: SHBG IRMA-Count
es un ensayo inmunoradiométrico en fase
sólida, diseñado para la determinación
cuantitativa de la globulina transportadora
de hormonas sexuales (SHBG) en suero.
Su utilidad es estrictamente la del
18
Referencia: RKSH1 (100 tubos)
Resumen y Explicación
del Test
La globulina transportadora de hormonas
sexuales (SHBG), es una glicoproteína
sintetizada en el hígado que se une a la
testosterona y a la 5α-dihidrotestosterona
con gran afinidad, y al estradiol con una
1,9
afinidad en cierto modo menor. Tiene un
único sitio de unión de hormonas
esteroideas, una masa molecular
aproximadamente de 80 000 a 100 000
daltons, y consiste en dos subunidades
aproximadamente iguales en tamaño.
Típicamente la SHBG circula en
concentraciones más altas en mujeres
que en hombres, debido a un ratio más
elevado de estrógenos/andrógenos en
mujeres. Por la misma razón, los niveles
de SHBG al final de la gestación o
después de la administración de
estrógenos pueden ser especialmente
elevados. La administración de
andrógenos tiende a estar asociada con
descensos en los niveles de SHBG.
Esencialmente la testosterona circula
unida a proteína, principalmente a la
SHBG, pero también a la albúmina y a la
globulina transportadora de cortisol.
Puesto que variaciones en los niveles de
las proteínas transportadoras pueden
afectar a la concentración de testosterona
circulante, los niveles de SHBG
comúnmente se miden como suplemento
de las determinaciones de testosterona. El
“índice androgénico libre” (FAI), calculado
como el ratio de testosterona total/SHBG,
ha probado ser un indicador útil del
estado androgénico anormal en
1,4,7,11
condiciones tales como el hirsutismo.
Principio del Test
SHBG IRMA-Count es un ensayo
inmunoradiométrico basado en tubos
recubiertos por ligando y anticuerpos
125
monoclonales, uno marcado con I y el
otro con ligando. La SHBG de la muestra
del paciente SHBG es capturado por el
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
anticuerpo monoclonal marcado con
ligando, en una reacción con cinética en
fase líquida. La separación después se
consigue mediante la unión tipo puente
entre el ligando que recubre el tubo y el
anti-ligando. Finalmente, la fracción unida
reacciona con el anticuerpo marcado
radiactivamente y el tubo se lava para
eliminar el exceso de trazador. Siguiendo
el procedimiento, la lectura de los tubos
en un contador gamma ofrece un número
que es proporcional a la cantidad de
SHBG presente en la muestras del
paciente.
Reactivos a pipetear: 3
Tiempo total de incubación: 90 minutos
Cuentas totales en la iodización:
aproximadamente 300 000 cpm
Advertencias y Precauciones
Para uso diagnóstico in vitro
Reactivos: Almacenar a 2–8°C en una
cámara preparada para almacenar
material radiactivo. Desechar de acuerdo
a la legislación en vigor.
No usar los reactivos después de su fecha
de caducidad.
Algunos componentes suministrados en el
kit pueden contener material de origen
humano y/o otros componentes
potencialmente peligrosos que necesiten
ciertas precauciones.
Siga las precauciones universales y
manipule todos los componentes como si
fueran capaces de transmitir agentes
infecciosos. Los materiales derivados de
sangre humana han sido analizados y son
negativos para sífilis; para anticuerpos
frente al HIV 1 y 2; para el antígeno de
superficie de hepatitis B y para los
anticuerpos de hepatitis C.
Se ha usado Azida sodica, en
concentraciones menores de 0,1 g/dl,
como conservante. Para su eliminacion,
lavar con grandes cantidades de agua
para evitar la constitucion de residuos de
azidas metalicas, potencialmente
explosivas, en las canerias de cobre y
plomo.
Agua: Usar agua destilada o desionizada.
Radiactividad
Una copia de cualquier certificado de
licencia de radioisótopos (específico o
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
general) emitido a la aduana de los
EE.UU. se registrará en los ficheros de
Siemens Healthcare Diagnostics antes de
que se puedan enviar kits o componentes
conteniendo material radiactivo. Estos
materiales radiactivos pueden adquirirse
por cualquier cliente con la licencia
específica apropiada. Con una licencia
general, estos materiales radiactivos
pueden adquirirse sólo por médicos,
veterinarios en la práctica de la medicina
veterinaria, laboratorios clínicos y
hospitales — y estrictamente para la
clínica in vitro o tests de laboratorio que
no conlleven la administración interna o
externa de material radiactivo o su
radiación a humanos u otros animales. Su
adquisición, recepción, almacenaje, uso,
trasferencia y desecho están regulados y
se expenderá una licencia (general o
específica) de la Comisión Nuclear de
EE.UU. o de un Estado con el NRC para
su consiguiente control.
Manejar los materiales radiactivos de
acuerdo a los requerimientos de su
licencia general o específica. Para
minimizar la exposición a la radiación, el
usuario debe adherirse al cuarto conjunto
de guías publicadas por el National
Bureau of Standards con el nombre Safe
Handling of Radioactive Materials
(Handbook No. 92, issued March 9, 1964)
y en las consiguientes publicaciones de
las autoridades Federales o Estatales.
Limpiar y decontaminar rápidamente las
superficies afectadas. Evitar la generación
de aerosoles. Eliminar los residuos sólidos
radiactivos de acuerdo con los
requerimientos de su licencia. Licencias
generales (NRC Form 483) pueden
eliminar sus residuos sólidos radiactivos
como residuos no radiactivos, después de
retirar las etiquetas. Licencias específicas
(NRC Form 313) se deben referir al Título
10, Código de Regulaciones Federales,
Parte 20. Las licencias en Estados
Asociados deben referirse a las
normativas de su correspondiente Estado.
Licencias generales pueden eliminar sus
residuos líquidos radiactivos contenidos
en este tipo de productos como cualquier
otro material líquido, quitando las
etiquetas de los contenedores y
procesándolos como residuos sólidos.
Licencias específicas pueden eliminar
pequeñas cantidades de residuos líquidos
radiactivos contenidos en este tipo de
19
productos como cualquier otro material
líquido. Refiérase a la normativa aplicable
a su laboratorio.
de caducidad marcada en la bolsa
Color: claro.
RKSH1: 100 tubos.
Materiales Suministrados:
Preparación Inicial
Anti-ligando SHBG (SHILB)
2,8 ml de anti-ligando, reactivo a los
anticuerpos monoclonales marcados con
ligando y a los tubos recubiertos por
ligando. Estable a 2–8°C durante 30 días
después de abrise ó hasta la fecha de
caducidad marcada en el vial. Tener en
cuenta que el anti-ligando suministrado
con el kit SHBG IRMA-Count kit no es
intercambiable con aquellos sumnistrados
con otros kits IRMA-Count.
Color: azul.
RKSH1: 2 viales.
Anticuerpo monoclonal marcado con
ligando (SHR1)
22 ml de anticuerpo monoclonal marcado
con ligando, con conservante. Estable a
2–8°C durante 60 días después de la
apertura ó hasta la fecha de caducidad
marcada en el vial.
RKSH1: 1 vial.
Anticuerpo monoclonal marcado con
I SHBG (SHR2)
Anticuerpo anti-SHBG monoclonal iodado,
liofilizado, y con conservante. Reconstituir
cada vial añadiendo 11 ml de agua
destilada o desionizada. Mezclar mediante
inversiones suaves. Estable a 2–8°C
durante 30 días después de la
reconstitución ó hasta la fecha de
caducidad marcada en el vial.
RKSH1: 2 viales.
125
Calibradores de SHBG (SHR3–9)
Siete viales, etiquetados de la A a la G, de
calibradores de SHBG liofilizados, con
una matriz tamponada y con conservante.
Al menos 30 minutos antes del uso,
reconstituir el calibrador cero A con
3,0 ml de agua destilada o desionizada, y
el resto de los calibradores (del B al G)
con 1 ml. Mezclar mediante agitación o
inversión suave. Estable durante 2 meses
(alicuotado) a –20°C.
RKSH1: 1 juego.
Los calibradores tienen valores
específicos de lote entre
aproximadamente 0, 1, 3, 10, 30, 90 y
180 nmol/l de SHBG. Mirar las etiquetas
de los viales para las concentraciones
exactas. Los puntos intermedios de
calibración pueden obtenerse mediante la
mezcla de los calibradores en las
proporciones adecuadas.
Tubos recubiertos por ligando (PST)
Tubos de poliestireno recubiertos de
ligando, empaquetados en bolsas con
cierre hermético. Almacenar refrigeredas y
protegidas de la humedad cerrando
cuidadosamente las bolsas después de la
apertura. Estable a 2–8°C hasta la fecha
20
Solución de lavado tamponada
concentrada (2TSBW)
60 mL de una solución salina tamponada
concentrada, con surfactantes. Diluír el
concentrado del vial con 600 ml de agua
destilada o desionizada hasta un volumen
total de 660 ml. Estable a 2–8°C durante 6
meses después de la preparación.
RKSH1: 1 vial.
Controles de SHBG (SHCO1–2)
Dos viales etiquetados como Control de
SHBG 1 y 2, que contienen SHBG
liofilizada en una matriz tamponada. Al
menos 30 minutos antes del uso,
reconstituir cada vial añadiendo
exactamente 1,0 ml de agua destilada o
desionizada. Mezclar mediante
inversiones suaves. Estable durante 2
meses (alicuotado) a –20°C. Consultar el
protocolo del control de SHBG para los
valores en nmol/L.
RKSH1: 1 juego.
Materiales no suministrados
Contador Gamma — compatible con
tubos estándar de 12x75 mm
Agitador — fijar a 200 rpm
Preparación del reactivo
Agua destilada o desionizada
Pipeta — para dispensar 11 ml
Pipeta volumétrica — para dispensar de
3 ml a 1 ml
Probeta graduada — para transferir
600 mL
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Contenedor de plástico con tapa — para
la preparación de la Solución de Lavado
Tamponada
Inmunoensayo
Micropipeta: 10 µl. Para la adición de
10 µl de muestras, utilizar una punta de
pipeta desechable para evitar el riesgo del
arrastre.
Dispensadores de repetición o
micropipetas: 50 µl y 200 µl
Dispensador: 2,0 ml — para la Solución
de Lavado Tamponada
Gradilla de espuma para decantar —
disponible en Siemens Healthcare
Diagnostics (referencia: FDR).
Papel de gráficas log-log de 3 ciclos
Conservación: 2–8°C durante 7 días ó 2
meses a –20°C.
Antes del ensayo, llevar todas las
muestras a temperatura ambiente (15–
28°C) y mezclar por inversión. Alicuotar, si
es necesario, para evitar la repetición de
congelación y descongelación. (No
intentar la descongelación de muestras
congeladas calentándolas en un baño de
agua.)
Procedimiento del Ensayo
Inmunométrico
Todos los componentes deben alcanzar la
temperatura ambiente (15–28°C) antes de
su uso.
1
Recogida de la muestra
El paciente no necesita estar en ayunas
así como tampoco cualquier otro tipo de
preparación. Recoger la sangre por
13
venipunción en tubos secos, anotando la
hora de extracción. Permitir la formación
del coágulo en la muestra y luego separar
el suero de las células.
Marcar catorce tubos A recubiertos
con ligando (unión no específica) y
desde B a G (“unión máxima”) por
duplicado. Marcar también por
duplicado, tubos recubiertos con
ligando para controles y muestras de
pacientes.
Opcionalmente, marcar por duplicado,
dos tubos de poliestireno (no
recubiertos) de 12 x 75 mm, y dejarlos
apartados hasta el paso 8.
La lipemia puede interferir con el ensayo.
Las muestras lipémicas se deben aclarar
por ultracentrifugación.
Las muestras hemolizadas podrían indicar
una mala manipulación de la muestra
antes de ser recibida por el laboratorio; en
este caso, los resultados deben
interpretarse con precaución.
Calibradores
Aproximado
nmol/l
T*
—
A (NSB)
0
B
1
C
3
El EDTA plasma no es apropiado para
este ensayo.
D
10
El plasma heparinizado no tiene ningún
efecto sobre el ensayo.
E
30
F
90
G ("MB")
180
Los tubos para recoger sangre de
distintos fabricantes pueden producir
valores diferentes, dependiendo del
material del tubo y de los aditivos,
incluyendo barreras de gel o barreras
físicas, activadores de la coagulación y/o
anticoagulantes. La SHBG IRMA-Count
no ha sido analizado con todos los
distintos tipos de tubos. Para obtener
detalles sobre los tipos tubos que se han
analizado, consulte la sección de Tipos de
Muestras Alternativos.
Volumen requerido 10 µl de suero por
tubo.
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
* Opcional
Advierta: Los valores de los
calibradores son específicos de lote.
Mirar las etiquetas de los viales de los
calibradores para los valores en
nmol/l.
2
Pipetear 10 µl de cada calibrador,
controles y muestras de suero de
pacientes en los tubos preparados al
efecto.
Pipetear directamente en el fondo
del tubo. Las muestras que se
sospeche que contienen
concentraciones de SHBG superiores
21
a la del calibrador más alto
(180 nmol/L) deben diluírse con el
calibrador cero. Se recomienda el uso
de micropipetas con puntas
desechables para evitar el arrastre de
una muestra a otra. Las pipetas de
dilución automáticas no se deben usar
a menos que la posibilidad de arrastre
haya sido evaluada y sea
insignificante.
3
Añadir 200 µl de anticuerpos antiSHBG marcados con ligando a todos
los tubos excepto a los T. Agitar la
gradilla.
Pipetear directamente en el fondo
del tubo. Se recomienda un
dispensador de repetición para este
paso, y para la adición del anti-ligando
de SHBG en el paso 5 y del trazador
en el paso 8.
4
Incubar durante 30 minutes a
temperatura ambiente (15–28°C).
5
Añadir 50 µl de anti-ligando (AZUL) a
todos los tubos excepto a los T.
Pipetear directamente sobre la
mezcla de reacción. Tener cuidado
en la dispensación del anti-ligando
para evitar la contaminación por
arrastre.
6
Agitar durante 30 minutos sobre una
gradilla agitadora.
7
Decantar y dejar escurrir
completamente. Añadir 2,0 ml de la
Solución de Lavado Tamponada a
cada tubo. Esperar 1 a 2 minutos,
luego decantar.
Eliminando toda la humedad visible,
se mejorará enormemente la
precisión. Después del lavado,
decantar el contenido de todos los
tubos utilizando una gradilla de
espuma. Luego golpear los tubos
enérgicamente sobre un papel
absorbente para eliminar las gotas
residuales.
8
Añadir 200 µl de anticuerpo anti125
SHBG marcado con I a cada tubo.
Pipetear directamente en el fondo
del tubo, y asegurarse de que la
muestra y el trazador están
completamente mezclados y sin
espuma. No han de transcurrir más de
10 minutos en la dispensación del
trazador. Se recomienda un
22
dispensador de repetición para este
paso y para la adición del anti-ligando
en el paso 5. Dejar apartados los
tubos T para el contaje (enel paso
11); éstos no requieren mayor
procesamiento.
9
Agitar durante 30 minutos sobre un
agitador de gradillas.
10 Decantar y dejar escurrir
completamente. Añadir 2 ml de la
Solución Amortiguadora de Lavado a
cada tubo. Esperar 1 a 2 minutos,
luego decantar. De nuevo, añadir 2 ml
de Solución de Lavado Tamponada,
esperar de 1 a 2 minutos, y después
decantar y escurrir enérgicamente.
Eliminando toda la humedad visible,
se mejorará enormemente la
precisión. Después del segundo
lavado, decantar el contenido de los
tubos (excepto los tubos T), utilizando
una gradilla de espuma, y dejar que
se escurran durante 2 o 3 minutos
Luego golpear los tubos
enérgicamente sobre un papel
absorbente para eliminar las gotas
residuales.
11 Contar durante 1 minuto en un
contador gamma.
En los contadores gamma
multicabezas, los tubos de Cuentas
Totales (opcional) deberán separarse
del resto de los tubos de ensayo por
cuando menos un espacio, para
minimizar la posibilidad de derrames a
los otros tubos.
Cálculos y Control de Calidad
Para calcular las concentraciones de
SHBG a partir de la representación log-log
de la curva de calibración, corregir
primero las cuentas por minuto (CPM) de
cada par de tubos, restando las CPM
promedio de los tubos de unión no
específica (calibrador A).
Cuentas netas = (Media CPM) menos
(Media NSB CPM)
Luego determinar el porcentaje de unión
(%B/B180 aquí llamado “%B/MB”) de cada
par de tubos como tanto por ciento de
“unión máxima,” con las cuentas NSB
corregidas del calibrador más alto
(calibrator G) tomadas como 100%:
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Porcentaje de Unión = (Cuentas netas / Cuentas
MB netas) × 100
Utilizando papel de gráficas log-log de 3
ciclos, trazar el Porcentaje de Unión
versus la Concentración para cada uno de
los calibradores no cero, del B al G, y
dibujar una curva que se aproxime a la
trayectoria de estos puntos. (Conectar los
puntos de calibración con arcos o
segmentos de líneas rectas. No intentar
acomodar una sola línea recta a los
datos.) Las concentraciones de SHBG de
los controles y los problemas, que se
encuentran dentro del rango de los
calibradores no cero, pueden ser
calculadas a partir de la curva de
calibración por interpolación. Se puede
utilizar una representación adicional del
Porcentaje de Unión frente a la
Concentración de los tres o cuatro
calibradores más bajos sobre un papel
gráfico lineal-lineal (no suministrado) para
la interpolación de las dósis cercanas al
cero. En el caso de muestras diluídas,
multiplicar por el factor de dilución
apropiado.
Comentarios: Aunque otros enfoques
son aceptables, la reducción de datos por
el método recién descrito tiene ciertas
ventajas desde el punto de vista de
control de calidad. En particular,
proporciona una curva de calibración que
es relativamente lineal en
representaciones tanto log-log como
lineal-lineal, y relativamente estable de
ensayo a ensayo. También proporciona
valiosos parámetros de Control de
Calidad, es decir, valores de Porcentaje
de Unión (%B/B180 ó "%B/MB") para los
calibradores no cero.
Se puede obtener una gráfica todavía
más informativa, dando un sentido de
reproducibilidad dentro del ensayo como
una función de la concentración, trazando
directamente los valores de Porcentaje de
Unión de los tubos de los calibradores,
más que calculando el promedio de las
CPM de los replicados. Es una buena
práctica de control de calidad el realizar
una representación logarítmica de la curva
de calibración, incluso de los resultados
tratados por ordenador.
Alternativas: Aunque el Porcentaje de
Unión se puede calcular directamente de
las CPM Promedio, la corrección para
unión no específica generalmente
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
produce una curva de calibración que es
más lineal a lo largo de su rango. Una
curva de calibración también puede
construirse trazando las CPM o CPM
Promedio directamente contra la
Concentración en papel de gráfica log-log
o lineal-lineal. (No debe emplearse papel
de gráfica semilogarítmico.) Este enfoque
tiene la virtud de la simplicidad, pero es
menos deseable desde el punto de vista
del control de calidad.
Tratamiento Informático de los Datos:
los métodos "punto a punto", incluyendo el
ajuste lineal y el spline cúbico, son
adecuados para la SHBG IRMA-Count.
Sin embargo, como los métodos punto a
punto ofrecen poca ayuda en la
monitorización de la integridad de un
ensayo, es importante preparar el gráfico
log-log recomendado de la curva de
calibración, ya sea manualmente o
mediante ordenador, como un paso del
control de calidad.
Las técnicas de tratamiento de datos
basadas en los modelos logísticos
también pueden ser aplicados. Dentro de
esta familia, las rutinas de ajuste de
curvas basadas en 4- o 5- parámetros
logísticos, son más adecuadas. Ha de
recordarse, sin embargo, algunos de los
algoritmos en uso actuales pueden no
converger exitosamente, incluso cuando
el modelo logístico se cumple para los
datos. Si se adopta un método logístico,
es esencial verificar si éste es apropiado
para el ensayo diario, controlando el
cálculo inverso de los calibradores y otros
parámetros. Además, la representación
log-log de la curva de calibración está
muy recomendada, ya que es más
informativa que la representación
semilogarítmica convencional.
Manipulación de la Muestra: Las
instrucciones para manipular y almacenar
las muestras de pacientes y los
componentes deberán observarse
cuidadosamente. Antes de analizar, diluir
las muestras de los pacientes que se
espera que contengan concentraciones
de SHBG mayores que la del calibrador
más alto (180 nmol/l) con el calibrador
cero. Todas las muestras, incluyendo los
calibradores y controles, deberán
someterse a ensayo cuando menos por
duplicado. Es importante utilizar puntas
desechables, cambiando las puntas entre
muestras, paa evitar la contaminación por
23
arrastre. Se deberán usar pipetas de
desplazamiento positivo y pipetoresdilutores automáticos sólo si se ha
evaluado la posibilidad de arrastre y se ha
determinado que esta sería insignificante.
Se pueden espaciar pares de tubos de
control a lo largo del ensayo para ayudar
a verificar la ausencia de arrastre
significativo. Inspeccionar los resultados
para comprobar el acuerdo entre pares de
tubos.
Contador Gamma: Para minimizar la
posibilidad de derrames en los contadores
gamma de múltiples pozos, los tubos de
cuentas totales opcionales deberán estar
separados de los otros tubos del ensayo
por uno o más espacios.
Alternativamente, agregar sólo 50 µl del
125
anticuerpo antiSHBG marcado con I
SHBG a cada uno de los tubos T (cuentas
totales) en el paso 8 y multiplicar las
cuentas por minuto observadas en estos
tubos por 4.
Controles: Los controles o pools de
sueros con al menos dos niveles de
concentración de SHBG (bajo y alto)
deberán ensayarse rutinariamente como
desconocidos y los resultados se deberán
trazar diariamente como se describe en
Westgard JO, et al. A multi-rule chart for
quality control. Clin Chem 1981; 27:493501. Las muestras de repetición son una
valiosa herramienta adicional para el
seguimiento de la precisión Interensayo.
Parámetros de Control de Calidad:
Recomendamos controlar estos
parámetros de rendimiento:
T = Cuentas totales (como CPM)
%NSB = 100 × (Media cuentas NSB / Cuentas
totales)
%MB = 100 × (Cuentas netos MB / Cuentas
totales)
Y los valores de Unión Porcentual
(“%B/MB”) de todos menos los
calibradores no cero mas altos, por
ejemplo:
%C/MB = 100 × (Cuentas netas calibrador “C” /
Cuentas netos MB)
Mantenimiento de Registros: Es una
buena práctica de laboratorio registrar
para cada ensayo los números de lote de
los componentes usados, así como las
fechas en las que fueron abiertos por
primera vez y reconstituidos.
24
Lectura Adicional: Ver Dudley RA, et al.
Guideline for immunoassay data
reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71.
Ejemplo: Sólo como ilustración, no se
puede utilizar para calcular resultados.
Debido a que los calibradores tienen
valores específicos de lote, las
concentraciones listadas en la colunma
derecha pueden no coincidir con los
valores de los calibradores suministrados
con su envío. (Ver la tabla “Example Run”)
Valores Experados
Para determinar los rangos de normalidad
de la SHBG en mujeres y mujeres no
embarazadas, se recogió un total de 233
muestras de adultos con niveles normales
de testosterona. Todas las muestras
fueron analizadas con el ensayo SHBG
IRMA-Count SHBG, con los resultados
que aparecen en la siguiente tabla.
Central 95% Mediana
(nmol/L)
(nmol/L)
Grupo
n
Hombres
10–73
31
122
Mujeres (no
embarazadas)
16–120
52
111
Considerar estos límites sólo como
orientativos. Cada laboratorio debe
establecer sus propios rangos de
normalidad.
Interpretación de los
Resultados
El descenso de los niveles de SHBG se
encuentra a menudo en el hirsutismo,
acné común y síndrome poliquístico
9
ovárico. Wilke y Utley, por ejemplo,
informan de niveles disminuídos de SHBG
en el 31% de una serie de 22 pacientes
hirsutas; mientras Cunningham y
McKenna, en un estudio de 92 mujeres
con hirsutismo, encontró niveles
5,11
suprimidos de SHBG en el 32%.
Los niveles de SHBG pueden verse
ligeramente reducidos en hipotiroidismo,
acromegalia, enfermedad de Cushing e
1,9
hiperprolactinemias. La SHBG también
tiende a estar suprimida en obesidad y
después de la administración de
andrógenos, principalmente la
testosterona, o grogas como el danazol,
que compiten con los andrógenos por
1,4,8,9,10
Los
unirse a la SHBG.
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
glucocorticoides y la hormona de
crecimiento han estado igualmente
asociados con el descenso de los niveles
9
de SHBG.
Las SHBG elevadas se pueden encontrar
1,4
en el hipertiroidismo y cirrosis hepática.
Los niveles elevados también se
encuentran en una gran variedad de
condiciones diferentes, tales como el
3,10
embarazo. Los aumentos se pueden
ver a veces después de la administración
de estrógenos – ej. en forma de ciertos
tipos de anticoceptivos orales – ó como
consecuencia de inducción enzimática
hepática mediante drogas como la
1,3,7,9,10
fenitoína.
El uso de la dexametasona en el
tratamiento de mujeres con hirsutismo
hiperandrogénico típicamente conduce al
aumento en las concentraciones de
4,5
SHBG.
Limitaciones
Al igual que la hormona transportadora de
tiroglobulina (TBG) y otras proteínas de
transporte, los resultados de SHBG deben
interpretarse junto con las
determinaciones de las hormonas que
une, principalmente la testosterona.
Combinando dicha información en la
formula del índice androgénico (FAI) —
ratio entre la testosterona total y la SHBG
— se discrimina mejor a las mujeres con
hirsutismo hiperandrogénico de las
mujeres sanas, que sólo con los niveles
1,5,9,11
de SHBG.
Características Analíticas
Ver las Tablas y Gráficas para los datos
representatives del comportamiento del kit
SHBG IRMA-Count. Los resultados están
expresados en nmol/l.
Rango de calibración:
Aproximadamente de 1 – 180 nmol/l
Los valores de los calibradores son
específicos de lote.
Sensibilidad Analítica: 0,04 nmol/l
Precisión Intraensayo: Las estadísticas
se calcularon con los resultados de 20
replicados de muestras ensayadas en una
sola tanda. (Ver "Precisión Intraensayo".)
Precisión Interensayo: Las estadísticas
se calcularon con muestras ensayadas en
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
20 tandas diferentes. (Ver tabla de
"Precisión Interesnayo".)
Especificidad: El anticuerpo es altamente
específico para for SHBG. (Ver tabla
“Especificidad".)
Efecto deriva: Ninguno hasta
aproximadamente 200 tubos. (Ver tabla
"Efecto Deriva”.)
Linealidad: Se ensayaron muestras
sometidas a varias diluciones. (Ver los
datos representativos en la tabla
“Linealidad”.)
Recuperación: Se ensayaron muestras,
de la 1 a la 19, sobrecargadas con tres
soluciones de SHBG (100, 200 y
410 nmol/l). (Ver los datos representativos
en la tabla "Recuperación".)
Bilirrubina: hasta concentraciones de
200 mg/L no tiene efecto sobre los
resultados, dentro de la precisión del
ensayo.
Hemólisis: hasta concentraciones de
30 µl/ml no tiene efecto sobre los
resultados, dentro de la precisión del
ensayo.
Tipo de Muestra Alternativa: para
evaluar el efecto de los diferentes tipos de
muestras alternativos, se recogió sangre
de 35 voluntarios en tubos normales,
tubos con Heparina, tubos con EDTA y
®
tubos vacutainer SST de Becton
Dickinson. Todas las muestras fueron
analizadas con el procedimiento SHBG
IRMA-Count con los siguientes resultados.
El plasma con EDTA no deberia ser usado
como muestra.
(EDTA) = 0,48 (Suero) + 4,4 nmol/l
r = 0,952
(Heparina) = 1,02 (Suero) + 1,5 nmol/l
r = 0,994
(SST) = 0,93 (tubos simples) + 2,7 nmol/l
r = 0,991
Medias:
61 nmol/l (Suero)
34 nmol/l (EDTA)
64 nmol/l (Heparin)
59 nmol/l (SST)
Comparación de los métodos: El
ensayo se comparó con un inmunoensayo
de SHBG comercialmente disponible (Kit
A) utilizando muestras de 51 pacientes.
Por regresión lineal:
(IRMA-Count) = 1,01 (Kit A) + 3,0 nmol/l
r = 0,984
25
Medias:
54,8 nmol/l (IRMA-Count)
51,1 nmol/l (Kit A)
Asistencia técnica
Póngase en contacto con el distribuidor
nacional.
www.siemens.com/diagnostics
El Sistema de Calidad de Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. está certificado por la ISO
13485:2003.
Français
IRMA-Count SHBG
Domaine d'utilisation : IRMA-Count
SHBG est un dosage
radioimmunométrique destiné à la mesure
quantitative de la protéine de liaison
SHBG (Sex Hormone Binding Globulin)
dans le sérum. Il est réservé à un usage
diagnostic in vitro et constitue une aide au
diagnostic différentiel de l'hirsutisme.
Référence catalogue : RKSH1 (100 tubes)
Le coffret de 100 tubes contient
moins de 20 microcuries
(740 kilobecquerels) d'anticorps
anti-SHBG marqué à l'iode 125.
La testostérone circule à l'origine sous
une forme liée principalement à la SHBG,
mais peut aussi être fixée sur d'autres
molécules (albumine). Comme la variation
de la protéine porteuse peut influencer les
concentration de testostérone circulante,
le taux de SHBG est en général mesuré
lors d'un dosage de testostérone. L'index
calculé (FAI : Free Androgen Index),
rapport de la testostérone totale en
fonction de la SHBG, est un indicateur
précieux lors de l'interprétation d'un bilan
androgénique anormal comme dans
1,4,7,11
l'hirsutisme.
Principe du test
IRMA-Count SHBG est un dosage
radioimmunométrique utilisant des tubes
revêtus de ligand et utilisant des anticorps
monoclonaux anti-SHBG: un anticorps
monoclonal anti-SHBG, marqué à l'iode
125, et un anticorps monoclonal antiSHBG marqué par un second ligand : la
SHBG de l'échantillon est capturéee par
cet anticorps dans une cinétique en phase
liquide, la séparation est assurée par une
liaison ligand-antiligand fixant à la paroi du
tube en polystyrène la SHBG liée. Cette
fraction liée va réagir avec le second
anticorps marqué à l'iode 125, puis le tube
est lavé pour éliminer l'excès de traceur.
Les CPM comptés dans un compteur
gamma sont proportionnels à la quantité
de SHBG présente dans l'échantillon.
Introduction
Réactifs à distribuer : 3
La SHBG (Sex Hormone Binding Globulin)
est une glycoprotéine, synthétisée au
niveau du foie, sur laquelle se fixe la
testostérone et la 5α-dihydrotestostérone
1,9
avec une forte affinité et l'estradiol avec
une affinité moindre. Il s'agit d'une
hormone de poids moléculaire d'environ
80 000 à 100 000 D composée de deux
sous-unités de tailles voisines.
Temps d'incubation totale : 90 minutes
La SHBG circule normalement à des
concentrations plus importantes chez les
femmes que chez les hommes en raison
d'un ratio estrogènes/androgènes plus
élevé chez la femme. Pour la même
raison, les taux de SHBG, lors de la
grossesse ou après traitement
estrogénique, peuvent être spécialement
élevés. L'administration d'androgènes
tend à être associée avec des taux de
SHBG diminués.
26
Activité totale en début de marquage :
environ 300 000 cpm
Précautions d'emploi
Réservé à un usage diagnostique in vitro.
Réactifs : Conserver à +2/+8°C dans un
réfrigérateur autorisé à recevoir du
matériel radioactif. Éliminer les déchets
conformément aux lois en vigueur.
Ne pas utiliser les réactifs au delà de leur
date d'expiration.
Certains composants fournis avec ce
coffret peuvent contenir des agents
humains et/ou d'autres éléments
potentiellement infectieux qui nécessitent
certaines précautions.
Respecter les précautions d'emploi et
manipuler tous les composants du coffret
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
comme des produits potentiellement
infectieux. Les réactifs dérivés de produits
humains et utilisés dans ce coffret ont subi
un test sérologique pour la Syphilis et des
tests de dépistage pour les anticorps antiVIH1 et 2, anti-HCV et pour l'antigène de
surface de l'hépatite B, qui se sont tous
avérés négatifs.
De l'azide de sodium à des concentrations
inférieures à 0,1 g/dl a été ajouté comme
conservateur ; lors de l'élimination,
l'évacuer avec de grandes quantités d'eau
pour éviter une accumulation d'azides
métalliques explosifs dans les
canalisations.
Eau : Utiliser de l'eau distillée ou
désionisée.
Radioactivité
Ce coffret de réactif est reservé à l'usage
in vitro (Autorisation DGSNR).
Règles de base de protection contre les
rayonnements ionisants et précautions
d'emploi.
Ce produit radioactif ne peut être reçu,
acheté, détenu ou utilisé que par des
personnes autorisées à cette fin et dans
des laboratoires dotés de cette
autorisation. Cette solution ne peut en
aucun cas être administrée à l'homme ou
aux animaux. Respecter impérativement
les dates de péremption indiquées sur
l'emballage extérieur et sur les étiquettes
des différents réactifs du coffret. Tous les
réactifs, dont les tubes revêtus
d'anticorps, doivent être conservés à
+ 4/+ 8° C dans leur conditionnement
d'origine avant d'être utilisés. L'achat, la
possession, l'utilisation et l'échange de
matières radioactives sont soumis aux
réglementations en vigueur dans le pays
de l'utilisateur. Les règles de base de
protection contre les rayonnements
ionisants doivent être respectées selon
des procédures en vigueur. Ne pas
pipeter des solutions radioactives avec la
bouche. Eviter le contact direct avec la
peau ou les muqueuses de tout produit
radioactif en utilisant des blouses et gants
de protection. Toute manipulation de
matières radioactives se fera dans un
local ad hoc éloigné de tout passage. Les
produits radioactifs seront stockés dans
leur conditionnement d'origine dans un
local approprié. Un cahier de réception et
de stockage de produits radioactifs sera
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
tenu à jour. Le matériel de laboratoire et la
verrerie qui ont été contaminés doivent
être éliminés au fur et à mesure afin
d'éviter une contamination croisée de
plusieurs isotopes. Chaque contamination
ou perte de substance radioactive devra
être réglée selon les procédures établies.
Toute mise aux déchets de matière
radioactive se fera en accord avec les
réglementations en vigueur. Ne pas
manger, ni boire, ni fumer, ni appliquer
des cosmétiques dans les laboratoires où
des produits radioactifs sont utilisés. Les
réactifs radioactifs ne peuvent être vendus
qu'à des personnes habilitées à manipuler
des substances radioactives.
Matériel Fourni :
Préparation Initiale
Anticorps anti-SHBG marqué par un
ligand (SHR1)
22 ml d'anticorps monoclonal anti SHBG
marqué par un ligand, avec conservateur.
Stable à +2/+8°C pendant 60 jours après
ouverture ou jusqu'à la date donnée sur le
flacon.
RKSH1 : 1 flacon.
125
Anticorps anti-SHBG marqué à l'iode
(SHR2)
Anticorps monoclonal anti-SHBG marqué
125
à l'iode , lyophilisé, avec conservateur.
Reconstituer chaque flacon avec 11 ml
d'eau distillée ou déionisée. Mélanger
doucement par inversion. Stable à
+2/+8°C pendant 30 jours après
reconstitution ou jusqu'à la date
d'expiration indiquée sur le flacon.
RKSH1 : 2 flacons.
Standards SHBG (SHR3–9)
Sept flacons, étiquetés de A à G, de
standard SHBG lyophilisés dans une
matrice tampon : au moins 30 minutes
avant emploi, reconstituer le flacon de
standard zéro A avec 3 ml d'eau distillée
ou désionisée, et 1 ml pour les autres
flacons de standard, de B à G, chacun,
avec conservateur. Stable pendant 2 mois
(aliquotés) à –20 °C.
RKSH1 : 1 jeu.
Les standards ont des valeurs spécifiques
à chaque lot d'environ 0, 1, 3, 10, 30, 90
et 180 nmol/l de SHBG. Se reporter à
l'étiquetage des flacons pour les valeurs
exactes. Des points intermédiaires
27
peuvent être obtenus en mélangeant des
standards dans des proportions
compatibles.
Tubes revêtus de ligand (PST)
Tubes en polystyrène revêtus d'un ligand
conditionnés dans des sachets
hermétiques à glissière. Les conserver
réfrigérés et protégés de l'humidité, bien
refermer les sachets après utilisation.
Stable à +2–8°C jusqu'à la date
d'expiration notée sur le sachet.
Couleur: clair.
RKSH1 : 100 tubes.
Anti-Ligand (SHILB)
2,8 ml d' anti-ligand, réagissant avec le
ligand lié à l'anticorps anti SHBG et le
ligand fixé sur les tubes polystyrène.
Stable à +2/+8°C 30 jours après ouverture
ou jusqu'à la date d'expiration notée sur le
flacon. Noter que ce réactif anti-ligand
n'est pas interchangeable avec ceux
fournis dans les autres coffrets IRMACount. Couleur: bleue.
RKSH1 : 2 flacons.
Solution de tampon de lavage
concentrée (2TSBW,)
60 ml d'une solution tampon saline
concentrée, avec surfactants. Utiliser un
récipient de transfert, diluer le contenu de
chaque flacon avec 600 ml d'eau distillée,
pour obtenir un volume total de 660 ml.
Stable à +2/+8°C 6 mois après
préparation.
RKSH1 : 1 flacon.
2 Contrôles SHBG (SHCO1–2)
2 flacons notés contrôles SHBG 1 et 2,
contenant de la SHBG lyophilisés en
matrice tamponnée. Reconstituer au
moins 30 minutes avant emploi avec
exactement 1,0 ml d'eau distillée ou
désionisée, agiter doucement. Stable
pendant 2 mois (aliquotés) à –20 °C. Se
référer à la fiche des contrôles pour leurs
valeurs exactes en nmol/l.
RKSH1 : 1 jeu.
Matériel requis mais non fourni
Compteur Gamma – permettant
l'utilisation de tubes standards 12x75 mm
Agitateur – environ 200 tpm
Préparation des réactifs
Eau distillée ou désionisée
28
Pipette de 11 ml
Pipette volumétrique de 3 ml et 1 ml
Eprouvette graduée — pour distribuer
600 ml
Flacon de conservation en plastique avec
couvercle— pour la préparation et le
stockage de la solution de tampon de
lavage
Immunodosage
Micropipettes: 10 µl. Pour l'ajout de 10 µl
d'échantillon, utiliser une micropipette à
embout jetable, pour éviter toute
contamination entre les tubes
échantillons.
Micropipettes ou multipettes: 50 µl et
200 µl
Distributeur – pour distribuer 2,0 ml de
solution de tampon de lavage
Un portoir de décantation – disponible
chez Siemens Healthcare Diagnostics
(Référence catalogue : FDR).
Papier graphe Log-log 3-cycles
Recueil des échantillons
Le patient n'a pas besoin d'être à jeun et
aucune préparation spéciale n'est requise.
13
Prélever le sang par ponction veineuse
sur tubes secs en évitant l'hémolyse,
séparer le sérum des cellules. Noter
l'heure de prélèvement.
Une forte lipémie peut interférer dans ce
dosage : les échantillons fortement
lipémiques devront être clarifier par
ultracentrifugation.
Des échantillons hémolysés peuvent être
révélateurs d'une préparation inadéquate
du prélèvement avant son envoi au
laboratoire ; il faudra donc interpréter les
résultats avec prudence.
Le plasma EDTA ne convient pas pour ce
dosage.
Le plasma hépariné n'a pas d'effet dans
ce dosage.
Des tubes pour prélèvements sanguins
provenant de fabricants différents peuvent
donner des résultats différents, selon les
matériaux et additifs utilisés, y compris
gels ou barrières physiques, activateurs
de la coagulation et/ou anticoagulants. Le
coffret IRMA-Count SHBG n'a pas été
testé sur tous les types de tubes
possibles. Veuillez consulter le chapitre
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
intitulé Autres Types d'Échantillons pour
plus de renseignements sur les tubes qui
ont été évalués.
Distribuer directement au fond du
tube. Les échantillons de patients
suspectés de contenir des
concentrations de SHBG supérieures
au standard le plus élevé
(180 nmol/ml) doivent être dilués avec
le standard zéro avant le dosage. Il
est bon d'utiliser des embouts de
micropipettes jetables, de changer
d'embout entre les échantillons de
manière à éviter toute contamination.
Les pipettes à « capillaire » et les
pipetteurs-diluteurs automatiques ne
doivent être utilisés que si le risque de
contamination a été évalué et jugé
insignifiant.
Volume nécessaire : 10 µl de sérum par
tube
Conservation : 7 jours à +2/+8°C ou
jusqu'à 2 mois à –20°C.
Avant le dosage, laisser les échantillons
parvenir à température ambiante (15°C–
28°C) et mélanger par légères rotations
ou retournements. Aliquoter, si
nécessaire, afin d'éviter de répéter les
cycles congélation / décongélation. Ne
pas tenter de décongeler les spécimens
congelés à l'aide d'un bain-marie.
3
Protocole de dosage
Immunométrique
Distribuer directement au fond du
tube. Agiter le portoir. Une multipette
est recommandée pour cet ajout ainsi
que l'addition d'anti-ligand puis du
traceur.
Chaque composant doit être à
température ambiante avant utilisation
(15°C–28°C).
1
Etiqueter 14 tubes coatés d'anticorps
anti-SHBG en duplicate, A (liaison non
spécifique) et de B à G (liaison
maximale LM). Etiqueter les tubes
coatés d'anticorps supplémentaires,
également en duplicate, pour les
échantillons de patients et les
contrôles.
Etiqueter 2 tubes (non coatés)
12 x 75 mm en polypropylène pour
l'activité totale.
Standards
Approx.
nmol/l
T*
—
A (LNS)
0
B
1
C
3
D
10
E
30
F
90
G ("LM")
180
* Optionnel
Note: Les concentrations des
standards sont spécifiques d'un lot. Se
référer aux étiquettes des flacons pour
les valeurs exactes en nmol/l.
2
Pipeter 10 µl de chaque standard,
contrôle et échantillon sérique de
patient dans les tubes préparés.
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Ajouter 200 µl d'anticorps anti-SHBG
marqué à un ligand dans chaque tube
(sauf tubes T).
4
Incuber 30 minutes à température
ambiante (15–28°C).
5
Ajouter 50 µl de l'anti-ligand (bleu) à
tous les tubes (sauf tubes T).
Pipeter juste au dessus du niveau
du liquide, faire attention au risque
de contamination !
6
Incuber 30 minutes sous agitation.
7
Décanter complètement. Ajouter à
chaque tube 2 ml de solution tampon
de lavage. Attendre 1 à 2 minutes et
décanter parfaitement.
Eliminer toute trace d'humidité pour
améliorer la précision. Après le
second lavage, utiliser un portoir de
décantation et laisser égoutter
pendant 2 ou 3 minutes. Retourner
alors vigoureusement les tubes sur du
papier absorbant afin d'éliminer les
gouttelettes résiduelles.
8
Ajouter 200 µl du traceur anti SHBG
marqué à l'iode 125 à chaque tube.
Distribuer directement au fond du
tube. Une multipette est
recommandée. Les tubes T peuvent
être mis de côté jusqu'au comptage
(étape 11); ils n'ont besoin d'aucun
autre traitement.
29
Le temps d'addition du traceur ne doit
pas dépasser 10 minutes.
9
Incuber 30 minutes sous agitation.
10 Décanter complètement. Ajouter à
chaque tube 2 ml de solution tampon
de lavage. Attendre 1 à 2 minutes et
décanter parfaitement. Ajouter de
nouveau 2 ml de solution tampon de
lavage, attendre 1 à 2 minutes et
décanter totalement.
Eliminer toute trace d'humidité pour
améliorer la précision. Après le
second lavage, utiliser un portoir de
décantation, décanter le contenu de
chacun des tubes (excepté les tubes
T) et laisser égoutter pendant 2 ou 3
minutes. Retourner alors
vigoureusement les tubes sur du
papier absorbant afin d'éliminer les
gouttelettes résiduelles.
11 Compter 1 minute dans un compteur
gamma.
Pour les compteurs gamma multipuits, les tubes T (optionnels) doivent
être séparés des autres tubes par au
moins un espace, afin de minimiser
les risques de contamination.
Calcul des Résultats et
Contrôle de Qualité
Pour calculer les concentrations de SHBG
à partir d'une courbe standard
représentée en log-log, il faut, dans un
premier temps, corriger les coups par
minute (cpm) de chaque paire de tubes en
soustrayant la moyenne des cpm des
tubes à liaison non spécifique
(standard A):
CPM corrigés = (Moyenne cpm) moins
(Moyenne cpm LNS)
Puis déterminer pour chaque doublet la
capacité de liaison en pourcentage
(%B/B180, ici nommée "%B/LM") de liaison
maximale (LM), corrigée des cpm dus au
LNS des tubes G tubes considérés à
100%:
% liaison = (cpm corrigés / cpm corrigés LM) ×
100
Utiliser le papier log-log 3 cycles pour la
construction de la courbe, en portant sur
l'axe des ordonnées les pourcentages de
liaison, et sur l'axe des abscisses les
valeurs des standards différents de zéro.
30
Tracer la courbe qui passe
approximativement par ces points. Relier
les points par des arcs ou des segments
de droite. Ne pas chercher à réaliser une
seule droite à partir des résultats. Les
concentrations des contrôles et des
inconnus dans le domaine de mesure du
standard zéro peuvent être lues à partir de
la droite par interpolation. Il est possible
de tracer un autre graphe à partir des 3
premiers standards pour apprécier les
valeurs proches de zéro.
Commentaires : Bien que d'autres
approches de calcul soit aussi
acceptables, la réduction des données
avec la méthode indiquée ci-dessus a
certains avantages du point de vue du
contrôle de qualité. En particulier, elle
donne une courbe d'étalonnage qui est
relativement linéaire avec les
représentations log-log et linéaire-linéaire,
et est relativement stable d'une dosage à
l'autre. Elle donne également des
paramètres déterminants pour le contrôle
de qualité, plus précisément, les valeurs
de % de liaison (%B/B180 ou "%B/LM) pour
les standards différents de zéro.
Un graphique encore plus utile, donnant
une idée de la reproductibilité intra-essai,
peut être obtenu en représentant
directement le pourcentage de liaison de
chaque standard, par exemple sans faire
un calcul de valeur moyenne à partir des
cpm des doublets.
Alternatives : Le pourcentage de liaison
peut être aussi calculé directement à partir
de la moyenne des cpm, la correction par
la liaison non spécifique produit
habituellement une courbe de calibration
qui est pratiquement linéaire sur tout le
domaine. Une courbe de calibration peut
être aussi créée en portant directement
sur l'ordonnée les cpm ou la moyenne des
cpm et en abscisse la concentration sur
du papier log-log ou linéaire-linéaire (le
papier semi-log ne doit pas être utilisé).
Cette méthode à l'avantage de sa
simplicité mais elle est moins
recommandée pour ce qui concerne le
Contrôle de Qualité.
Traitement informatique des données :
Les méthodes "Point-par-point", incluant
les fonctions de lissage linéaire, peuvent
être utilisées ; bien qu'elles ne permettent
qu'une faible assistance pour le suivi de la
qualité des tests, il est important de tracer
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
en log-log, selon les recommandations, la
courbe d'étalonnage, soit manuellement
soit informatiquement, en considérant que
c'est une étape du Contrôle de Qualité.
Le traitement des données utilisant des
fonctions polynomiales de 4ème ou 5ème
degré est aussi possible et est adapté.
Garder à l'esprit, cependant, que certains
algorithmes actuellement utilisés peuvent
ne pas être adaptés. Si une de ces
méthodes semble adaptée, il est essentiel
de vérifier qu'elle reste appropriée dans le
temps, par recalcul des concentration de
standards et d'autres paramètres. De plus,
un tracé log-log de la courbe de
calibration est fortement recommandé car
il est plus informatif que le tracé habituel
en semi-log.
Traitement des échantillons : Les
recommandations données concernant
l'utilisation et la conservation des sérums
doivent être respectées. Les échantillons
de patients suspectés de contenir des
concentrations de SHBG supérieures au
standard le plus élevé (180 nmol/mL)
doivent être dilués avec le standard zéro
avant le dosage. Tous les échantillons,
standards et contrôles inclus, doivent être
dosés en duplicate. Il est important
d'utiliser des micropipettes à embouts
jetables, de changer d'embout entre les
échantillons de manière à éviter toute
contamination. Les pipettes de transfert et
les pipeteurs diluteurs automatiques ne
doivent être utilisés que si le risque de
transmission de contamination a été
évalué et considéré comme insignifiante.
Les doublets de tubes de contrôles
doivent être espacés au long de la série
de dosage afin de vérifier l'absence de
dérive significative. Vérifier la
concordance des résultats entre les
doublets de tubes.
Compteur Gamma : Pour minimiser
l'éventualité d'une contamination dans le
compteur gamma multipuits, il convient de
séparer les tubes d'activité totale T des
autres tubes par au moins un espace. En
alternative, il est possible d'ajouter
uniquement 50 µl (au lieu de 200 µl)et de
multiplier par 4 le nombre de cpm obtenus
comme activité totale.
Contrôles : Les contrôles ou des pools de
sérum avec au moins deux niveaux de
concentration de SHBG (bas et élevé)
doivent être dosés en routine comme
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
inconnus, et les résultats notés jour après
jour comme décrit par exemple dans
Westgard JO, et al. A multi-rule chart for
quality control. Clin Chem 1981;27:493501. Un redosage d'échantillon peut être
précieux pour suivre la précision inter
essai.
Paramètres du Contrôle de Qualité :
Nous recommandons de garder une trace
de ces résultats de performances:
T = Activité totale (cpm)
%LNS = 100 × (Moyenne des cpm du LNS /
cpm Totaux)
%LM = 100 × (cpm corrigés LM / cpm totaux)
Et toutes les valeurs de pourcentage de
liaison (%B/B180 ou "%B/LM") sauf la plus
élevée des standards différents de zéro,
par exemple:
%C/LM = 100 × (cpm standard C corrigé / cpm
LM corrigé)
Conservation des données : Il est bon
d'enregistrer pour chaque dosage les
numéros de lots et la date de
reconstitution et/ou ouverture des
composants utilisés.
Bibliographie : Se reporter à Dudley RA,
et al. Guidelines for immunoassay data
reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71.
Exemple de série : A titre d'exemple
uniquement, et non pour calculer des
résultats provenant d'une autre série.
Comme les valeurs des standards sont
lot-dépendantes, les concentrations
indiquées peuvent être différentes de
celles de vos livraisons. (Voir le tableau «
Example Run ».)
Valeurs de référence
Afin de déterminer les valeurs de
référence pour les hommes et pour les
femmes (hors grossesse), un total de 233
échantillons d'adultes présentant des taux
de testostérone normaux ont été dosés
avec le coffret IRMA-Count SHBG pour
donner les valeurs suivantes.
Groupe
Dom.Centré
95%
Médiane
(nmol/l)
(nmol/l)
n
Hommes
10–73
31
122
Femmes (hors
grossesse)
16–120
52
111
31
Utiliser ces valeurs à titre indicatif
uniquement. Chaque laboratoire devra
établir ses propres valeurs de référence.
Interprétation des résultats
Des taux abaissés de SHBG sont ainsi
souvent mis en évidence dans des
pathologies telles que l'hirsutisme, l'acné
ou le syndrôme des ovaires
9
polykystiques. Wilke et Utley, par
exemple, ont rapporté que les taux de
SHBG étaient abaissés dans 31% des cas
sur une population de 22 patientes
atteintes d'hirsutisme: Cunningham et
McKenna démontrant pour leur part, dans
une étude réalisée sur 92 patientes
atteintes d'hirsutisme, un taux abaissé
5,11
dans 32% des cas.
Les taux de SHBG sont également
faiblement abaissés dans l'hypothyroïdie,
l'acromégalie, la maladie de Cushing et
1,9
l'hyperprolactinémie. La SHBG, enfin,
tend à disparaître dans l'obésité et après
un traitement à base d'androgènes, en
particulier la testostérone, ou de
médicaments comme le danazol qui
entrent en compétition avec les
androgènes pour les sites de fixation sur
1,4,8,9,10
En outre, les
la SHBG.
glucocorticoïdes et l'hormone de
croissance ont été associés à des taux
9
abaissés de SHBG.
Des taux élevés de SHBG peuvent être
rencontrés dans des cas d'hyperthyroïdie
1,4
ou de cirrhose du foie. Des taux élevés
sont également rapportés dans de
nombreuses autres conditions comme la
3,10
grossesse en particulier. Des
augmentations peuvent survenir parfois
après l'administration à la patiente
d'estrogènes, par exemple certains types
de contraceptifs oraux, ou comme
conséquence d'une induction enzymatique
hépatique par des médicaments comme la
1,3,7,9,10
phénytoïne.
L'utilisation de la déxaméthasone dans le
traitement de la femme atteinte
d'hirsutisme entraînera également
traditionnellement une augmentation des
4,5
concentrations.
Limites
Index d'androgène libre : Les résultats
d'un dosage de SHBG doivent être
interprétés avec les résultats d'autres
dosages hormonaux, en particulier de la
32
testostérone. La combinaison de ces
informations permet l'obtention d'un index
d'androgène libre (FAI), rapport
testostérone totale sur SHBG. Ce rapport
est d'une aide bien plus précieuse que le
dosage de la seule SHBG dans la
différenciation entre les patientes atteintes
d'hirsutisme et celles en bonne
1,5,9,11
santé.
Performances du test
Se reporter aux tableaux et graphiques
pour avoir les données représentatives du
dosage IRMA-Count SHBG. Les résultats
sont donnés en nmol/l.
Intervalle de linéarité :
Approximativement 1 – 180 nmol/l
Les standards ont des valeurs lotspécifiques.
Sensibilité analytique : 0,04 nmol/l
Précision intra-dosage (au sein d'une
même série) : Les statistiques ont été
réalisées sur les résultats de 20 replicata
d'échantillons dosés au cours d'une même
série. (Voir le tableau « Intraassay
Precision ».)
Précision inter-dosage (entre plusieurs
séries) : Les statistiques ont été réalisées
sur des échantillons dosés dans 20 séries
différentes. (Voir le tableau « Interassay
Precision ».)
Spécificité : L'anticorps utilisé est
hautement spécifique de SHBG. (Voir le
tableau « Specificity ».)
Effet de la position des tubes : Aucun
jusqu'à 200 tubes. (Voir le tableau « Endof-Run Effect ».)
Test de dilution : Des échantillons ont
été dosés à différentes concentrations.
(Voir le tableau « Linearity » pour des
données représentatives.)
Test de récupération : Des échantillons
ont été mélangés dans la proportion 1 à
19 avec 3 solutions de SHBG solutions
(100, 200 et 410 nmol/l) puis dosés (Voir
le tableau « Recovery » pour des données
représentatives.)
Bilirubine : La présence de bilirubine ne
présente aucun effet sur les résultats ni
sur la précision du dosage si la
concentration ne dépasse pas 200 mg/l.
Hémolyse : La présence d'agrégat
d'hématies jusqu'à une concentration de
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
30 µl/ml, n'a aucun effet sur les résultats
quant à la précision du dosage.
Autres types d'échantillons : Afin de
déterminer l'éventuelle interférence des
anticoagulants sur le dosage, du sang de
35 volontaires sains a été recueilli sur
tubes vacutainers secs, héparinés, EDTA
®
et sur tubes vacutainer SST Becton
Dickinson. Tous les échantillons ont été
dosés avec le dosage Coat-A-Count
SHBG IRMA avec les résultats suivants.
Le plasma EDTA est impropre à l'emploi.
(EDTA) = 0,48 (Sérum) + 4,4 nmol/l
r = 0,952
(Héparine) = 1,02 (Sérum) + 1,5 nmol/l
r = 0,994
(SST) = 0,93 (tubes ordinaires) + 2,7 nmol/l
r = 0,991
Moyennes :
61 nmol/l (Sérum)
34 nmol/l (EDTA)
64 nmol/l (Héparine)
59 nmol/l (SST)
Comparaison de méthodes : Ce dosage
a été comparé à un autre coffret
commercial SHBG (Kit A) sur 51 patients.
Par régression linéaire :
(IRMA-Count) = 1,01 (Kit A) + 3,0 nmol/l
r = 0,984
Moyennes :
54,8 nmol/l (IRMA-Count)
51,1 nmol/l (Kit A)
Assistance technique
Contacter votre distributeur national.
www.siemens.com/diagnostics
Le Système Qualité de Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. est certifié ISO 13485:2003.
Italiano
IRMA-Count SHBG
Uso progettato: Il dosaggio IRMA-Count
SHBG è un dosaggio immunoradiometrico
in fase solida per la determinazione
quantitativa della globulina legante gli
ormoni sessuali (SHBG) nel siero. E' a
solo uso diagnostico in vitro quale ausilio
nella diagnosi differenziale di irsutismo.
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Codice: RKSH1 (100 provette)
Il kit da 100 determinazioni
contiene meno di 20 microcurie
(740 kilobecquerel) di anti-SHBG
125
radioattivo marcato con I .
Riassunto e Spiegazione del
Test
La globulina legante gli ormoni sessuali
(SHBG) è una glicoproteina sintetizzata
nel fegato, che lega il testosterone de il
5α-diidrotestosterone con affinità elevata,
1,9
e l'estradiolo con un'affinità inferiore. Ha
un sito unico di legame degli ormoni
steroidei, una massa molecolare da circa
80 000 a 100 000 dalton, ed è formato da
due sottounità, più o meno delle stesse
dimensioni.
L'SHBG circola tipicamente a
concentrazioni più elevate nelle donne
rispetto agli uomini, a causa della
maggiore concentrazione di estrogeni
rispetto agli androgeni. Per la stessa
ragione, i livelli di SHBG nell'ultimo
trimestre di gravidanza o dopo
somministrazione di estrogeni possono
essere particolarmente elevati. La
somministrazione di androgeni tende ad
essere associata a livelli più bassi di
SHBG.
Il testosterone circola principalmente
legato alle proteine, principalmente
all'SHBG, ma anche all'albumina ed alla
globulina legante il cortisolo. Poiché le
variazioni nei livelli di proteine di trasporto
possono intaccare la concentrazione di
testosterone in circolo, i livelli di SHBG
vengono comunemente misurati in
aggiunta alle determinazioni di
testosterone totale. “L'indice di androgeni
liberi” (FAI), calcolato come rapporto tra il
testosterone totale e l'SHBG, si è rivelato
un utile indicatore di uno stato
androgenico anomalo in condizioni quali
1,4,7,11
l'irsutismo.
Procedura del Dosaggio
Il Dosaggio IRMA-Count SHBG è un
dosaggio immunoradiometrico basato su
provette coattate con ligando ed anticorpi
monoclonali, uno dei quali è marcato con
125
I l'altro è marcato con ligando. L'SHBG
presente nel campione del paziente viene
catturato dall'anticorpo monoclonale
marcato con ligando in una reazione che
33
procede con la cinetica in fase liquida. La
separazione viene raggiunta dal metodo
basato sulla provetta coattata/ponte anti
ligando. Infine, la frazione legata viene
fatta reagire con l'anticorpo radiomarcato
e la provetta viene lavata per rimuovere il
tracciante in eccesso. Nel dosaggio, la
conta della provetta in un gamma counter
produce un numero che è proporzionale al
quantitativo di SHBG presente nel
campione.
Reagenti da Dispensare: 3
Tempo Totale di Incubazione: 90 minuti
Conte totali alla iodinazione:
circa 300 000 cpm
Avvertenze e Precauzioni
Ad uso diagnostico in vitro.
Reagenti: Conservare a 2–8°C in un
frigorifero appositamente destinato al
materiale radioattivo. Eliminare secondo le
normative di legge vigenti.
Non utilizzare reagenti oltre la data di
scadenza.
Alcuni componenti forniti in questo kit
possono contenere materiale di origine
umana e/o altri ingredienti potenzialmente
pericolosi che necessitano di precauzioni
di utilizzo.
Seguire le precauzioni universali, e
manipolare tutti i componenti come se
potessero trasmettere agenti infettivi.
Sono stati dosati i materiali di origine
umana e sono stati trovati non reattivi per
la Sifilide; per gli anticorpi anti-HIV 1 e 2;
per l'Antigene di Superficie dell'Epatite B;
e per anticorpi Anti-Epatite C.
E' stata aggiunta Sodio Azide a
concentrazioni inferiori a 0,1 g/dL come
conservante. Al momento
dell'eliminazione, irrorare con molta acqua
per evitare la formazione di azidi
metalliche potenzialmente esplosive nelle
tubature di piombo e di rame.
Acqua: Utilizzare solo acqua distillata o
deionizzata.
Radioattività
Una copia di tutti i certificati di
Autorizzazione per radioisotopi (Specifica
o Generica) rilasciata ad un cliente
americano deve essere conservata in file
presso la Siemens Healthcare Diagnostics
prima che i kit o i componenti contenenti
34
materiale radioattivo possano essere
spediti. Questi materiali radioattivi
possono essere acquisiti da qualsivoglia
cliente in possesso dell'Autorizzazione
Specifica. Con l'Autorizzazione Generica
questi materiali radioattivi possono essere
acquistati solo da medici, veterinari che
esercitino la professione, laboratori clinici
ed ospedalieri – e solo per l'esecuzione di
test clinici o di laboratorio in vitro che non
implichino somministrazione interna o
esterna del materiale radioattivo o delle
sue radiazioni alle persone o animali. La
sua acquisizione, ricevimento,
conservazione, utilizzo, trasferimento ed
eliminazione sono soggette a
regolamentazioni e ad Autorizzazione
(Generica o Specifica) della Commissione
Statunitense per il Nucleare o dello Stato
con il quale l'NRC abbia stipulato un
accordo per l'esercizio del controllo
regolatorio.
Manipolare i materiali radioattivi secondo
quanto previsto dall'Autorizzazione
Generica o Specifica. Per minimizzare
l'esposizione alle radiazioni, l'utilizzatore
deve attenersi alle linee guida stabilite dal
National Bureau of Standards publication
su “Safe Handling of Radioactive
Materials” “Norme per una corretta
manipolazione dei Materiali
Radioattivi”.(Guida N° 92, pubblicata il 9
Marzo 1964) e successive edizioni
pubblicate dallo Stato e dalle Autorità
Federali.
Assorbire immediatamente le fuoriuscite e
decontaminare le superfici contaminate.
Evitare la formazione di aerosol. Eliminare
i rifiuti solidi radioattivi secondo quanto
previsto dall'Autorizzazione. Le licenze
generiche (possessori di NRC Form 483)
possono eliminare i rifiuti radioattivi solidi
come non radioattivi, dopo aver rimosso
l'etichetta. I detentori di autorizzazioni
specifiche (NRC Form 313) devono fare
riferimento al Titolo 10, Codice delle
Regolamentazioni Federali Parte 20. I
detentori di Autorizzazioni negli Stati che
hanno stipulato un accordo con l'NRC
dovrebbero far riferimento alle
regolamentazioni idonee dei loro stati. I
detentori di Autorizzazioni Generali
possono eliminare i rifiuti radioattivi liquidi
del tipo contenuto in questo prodotto
attraverso il lavello del laboratorio. I
detentori di autorizzazione devono
eliminare o rendere illeggibili le etichette
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
dei contenitori vuoti di materiali radioattivi
prima di eliminare i rifiuti solidi. I detentori
di autorizzazioni specifiche possono
eliminare piccoli quantitativi di rifiuti
radioattivi liquidi del tipo utilizzato in
questo prodotto attraverso il lavello del
laboratorio. Fare riferimento alle
regolamentazioni appropriate applicabili al
Vostro laboratorio.
Materiali Forniti:
Preparazione Iniziale
SHBG MAb Marcato con Ligando
(SHR1)
22 mL di un anticorpo monoclonale
marcato con ligando, con conservanti.
Stabile a 2–8°C per 60 giorni dopo
l'apertura o fino alla data di scadenza
indicata sull'etichetta.
RKSH1: 1 flacone.
125
SHBG MAb marcato con I (SHR2)
Un anticorpo monoclonale anti-SHBG
liofilo e iodinato, con conservanti.
Ricostituire ciascun flacone aggiungendo
11 mL di acqua distillata o deionizzata.
Mescolare capovolgendo la provetta.
Stabile a 2-8°C per 30 giorni dopo la
ricostituzione, o fino alla data di scadenza
indicata sull'etichetta.
RKSH1: 2 flaconi.
Calibratori SHBG (SHR3–9)
Sette flaconi, etichettati dalla A alla G, di
calibratori SHBG liofili in una
matrice/tampone, con conservanti.
Almeno 30 minuti prima dell'utilizzo
ricostituire il calibratore zero A con
3,0 mL di acqua distillata o deionizzata ed
i rimanenti calibratori dalla B alla G con
1,0 mL ciascuno. Mescolare
capovolgendo la provetta. Stabile per 2
mesi (aliquotati) a –20°C.
RKSH1: 1 set.
I calibratori hanno valori lotto specifici di
circa 0, 1, 3, 10, 30, 90 e 180 nmol/L di
SHBG. Fare riferimento alle etichette dei
flaconi per le concentrazioni esatte di
SHBG. I punti intermedi della calibrazione
possono essere ottenuti mescolando i
calibratori in proporzioni idonee.
Provette Coattate con Ligando (PST)
Provette di polistirene coattate con ligando
e confezionate in buste a cerniera.
Conservare refrigerate al riparo
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
dall'umidità, richiudendole dopo l'utilizzo.
Stabile a 2–8°C fino alla data di scadenza
indicata sulla confezione. Colore: chiaro
RKSH1: 100 provette.
SHBG Anti-Ligando (SHILB)
2,8 mL di anti-ligando, reattivo con
l'anticorpo monoclonale marcato con
ligando e le provette coattate con ligando.
Stabile a 2–8°C per 30 giorni dopo
l'apertura, o fino alla data di scadenza
indicata sull'etichetta. Attenzione, l'antiligando fornito nel kit IRMA-Count SHBG
non è interscambiabile con quelli forniti
negli altri kit IRMA-Count. Colore: blu.
RKSH1: 2 flaconi.
Soluzione di Lavaggio Concentrata
(2TSBW)
60 mL di una soluzione/tampone salina
concentrata con surfactanti. Utilizzando un
contenitore per il trasferimento, diluire il
flacone del concentrato con 600 mL di
acqua distillata o deionizzata, per un
volume totale di 660 mL. Stabile a 2–8°C
per 6 mesi dopo la preparazione.
RKSH1: 1 flacone.
Controlli SHBG (SHCO1–2)
Due flaconi etichettati SHBG Controllo 1 e
2, contententi SHBG liofilo in una
matrice/tampone. Almeno 30 minuti prima
dell'utilizzo, ricostituire ciascun flacone
aggiungendo esattamente 1,0 mL di
acqua distillata o deionizzata. Mescolare
capovolgendo. Stabile per 2 mesi
(aliquotato) a –20°C. Fare riferimento alla
metodica dei controlli SHBG per i valori in
nmol/L.
RKSH1: 1 set.
Materiali Richiesti Ma Non
Forniti
Gamma counter — compatibile con
provette standard da 12x75 mm
Rack shaker — settato a circa 200 colpi al
minuto
Preparazione dei Reagenti
Acqua distillata o deionizzata
Pipetta – per la dispensazione di 11 mL
Pipetta volumetrica – per la dispensazione
di 3 mL ed 1 mL
Cilindro graduato – per il trasferimento di
600 mL
35
Contenitore di plastica con coperchio –
per la preparazione e la conservazione
della Soluzione di Lavaggio
Immunodosaggio
Micropipetta: 10 µL. Per l'aggiunta di
10 µL di campione, utilizzare una pipetta
con puntale monouso, piuttosto che una
pipetta a trasferimento positivo, per
minimizzare il rischi di carryover.
Dispensatori a Ripetizione o Micropipette:
50 µL e 200 µL
Dispensatore: 2,0 mL — per la Soluzione
di Lavaggio
Prima del dosaggio, consentire ai
campioni di raggiungere temperatura
ambiente ((15–28°C) e mescolare
scuotendo leggeremente. Aliquotare, se
necessario per evitare cicli ripetuti di
congelamento e scongelamento. (Non
tentare di scongelare i campioni
riscaldandoli in un bagnetto ad acqua)
Dosaggio Immunometrico
Tutti i componenti devono essere a
temperatura ambiente (15–28°C) prima
dell'utilizzo.
1
Foam per la decantazione — disponbile
presso Siemens Healthcare Diagnostics
(Codice: FDR).
Carta per grafici log-log a 3-cicli
Prelievo dei Campioni
Etichettare con A quattordici provette
Coattate con Ligando (legame non
specifico) e dalla B alla G ("legame
massimo") in duplicato. Etichettare
altre provette coattate con ligando,
anch'esse in duplicato, per i controlli
ed i campioni.
Etichettare con T (opzionale) due
provette semplici, (non coattate) da
12x75 mm di polipropilene (conte
totali) in duplicato, e metterle da parte
al punto 8.
Non è necessario che il paziente sia a
digiuno, non sono necessarie preparazioni
13
particolari. Prelevare il sangue in
provette semplici, annotando l'ora del
prelievo. Consentire ai campioni di
coagularsi, quindi separare il siero dalle
cellule.
La lipemia può interferire con il dosaggio.
Campioni lipemici dovrebbero essere
schiariti con un'ultracentrifuga.
Calibratori
Circa
nmol/L
T*
—
A (NSB)
0
B
1
I campioni emolizzati possono indicare un
trattamento non idoneo del campione
prima dell'arrivo al laboratorio; per questo
motivo, i risultati devono essere
interpretati con prudenza.
Non può essere utilizzato plasma EDTA.
Campioni di plasma eparinizzato non
hanno effetto sul dosaggio.
Provette per il prelievo di sangue di
produttori diversi possono dare valori
differenti, a seconda dei materiali e degli
additivi usati, incluso gel o barriere fisiche,
attivatori di coaguli e/o anticoagulanti.
IRMA-Count SHBG non é stato verificato
con tutte le possibili variazioni di tipi di
provette. Consultare la sezione
riguardante Campioni Alternativi per
dettagli sulle provette testate.
Volume Richiesto: 10 µL di siero per
provetta.
Conservazione: 2–8°C per 7 giorni, o
2 mesi a –20°C.
36
C
3
D
10
E
30
F
90
G ("MB")
180
* Opzionali
Nota: I valori dei calibratori sono
lotto-specifici. Fare riferimento alle
etichette dei flaconi per i valori in
nmol/L.
2
Dispensare 10 µL di ciascun
calibratore, controllo e campione nelle
provette preparate.
Pipettare direttamente al fondo.
Campioni con concentrazioni attese di
SHBG superiori al calibratore più
elevato (180 nmol/L) dovrebbero
essere diluite nel calibratore zero. Si
consiglia l'utilizzo di micropipette con
puntali monouso per evitare il
carryover da un campione all'altro.
Non devono essere utilizzati
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
pipettatori-diluitori automatici se non è
stata valutata e ritenuta insignificante
la possibilità che si verifichi il
carryover.
3
Aggiungere 200 µL di MAb SHBG
marcato con Ligando a tutte le
provette ad eccezione delle provette
T. Scuotere il rack.
Pipettare direttamente al fondo. Si
consiglia l'utilizzo di un dispensatore a
ripetizione per questo passaggio e per
l'aggiunta di Anti-Ligando SHBG al
punto 5 e del tracciante al punto 8.
4
Incubare per 30 minuti a temperatura
ambiente (15–28°C).
5
Aggiungere 50 µL di Anti-Ligando
(BLUE) a tutte le provette ad
eccezione delle provette T.
Pipettare direttamente in cima alla
miscela di reazione. Durante la
dispensazione dell'Anti-Ligando fare
attenzione ad evitare la
contaminazione da carryover
6
Scuotere per 30 minuti su uno
shaker.
7
Decantare ed asciugare
completamente. Aggiungere 2 mL di
Soluzione di Lavaggio ad ogni
provetta. Attendere da 1 a 2 minuti,
quindi decantare completamente.
Rimuovere tutta l'umidità visibile
aumentando così la precisione. Dopo
il lavaggio, utilizzando un rack per la
decantazione, decantare il contenuto
di tutte le provette. Tamponarle su
carta assorbente per eliminare
completamente i liquidi.
8
Aggiungere 200 µL di SHBG MAb
125
marcato con I ad ogni provetta.
Pipettare direttamente al fondo
della provetta, ed assicurarsi che il
campione ed il tracciante siano
completamente mescolati senza
formazione di schiuma. Non devono
passare più di 10 minuti nella
dispensazione del tracciante. Si
consiglia l'utilizzo di un dispensatore
per questo punto e per l'aggiunta
dell'Anti-Ligando al punto 5. Mettere
da parte le provette T per la conta (al
punto 11); non sono necessari ulteriori
passaggi.
9
Scuotere per 30 minuti su shaker.
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
10 Decantare ed asciugare
completamente. Aggiungere 2 mL di
una Soluzione di Lavaggio ad ogni
provetta. Attendere 1 o 2 minuti,
quindi decantare completamente.
Rimuovere tutta l'umidità visibile
aumentando così la precisione. Dopo
il secondo lavaggio, decantare il
contenuto di tutte le provette (ad
eccezione delle provette T).
Utilizzando un foam per la
decantazione fare in modo che le
provette si asciughino per 2 o 3
minuti. Tamponarle su carta
assorbente per eliminare
completamente i liquidi.
11 Contare per 1 minuto in un gamma
counter.
In gamma counter multi-testina, le
provette delle Conte Totali (opzionali)
dovrebbero essere separate dalle
provette del dosaggio rimanenti da
almeno uno spazio, per minimizzare la
possibilità di fuoriuscite.
Calcolo dei Risultati e Controllo
di Qualità
Per calcolare le concentrazioni di SHBG
da una rappresentazione log-log della
curva di calibrazione, correggere
inizialmente le conte al minuto (CPM) di
ciascuna coppia di provette sottraendo i
CPM medi delle provette senza legame
specifico (calibratore A):
Conte Nette = (Media dei CPM) Meno (Media
CPM NSB)
Quindi determinare la percentuale di
legato (%B/B180 qui chiamato "%B/MB") di
ciascuna coppia di provette come
percentuale del “legame massimo” con le
conte corrette con NSB del calibratore più
alto (calibratore G) prese al 100%
Percentuale di Legato = (Conte Nette / Conte
Nette MB) × 100
Utilizzando una carta per grafici log-log a
3 cicli, tracciare la Percentuale di Legato
vs. la Concentrazione per ciascuno dei
calibratori non zero dalla B alla G e
tracciare la curva lungo il percorso di
questi punti. (Collegare i punti della
calibrazione con archi o segmenti. Non
tentare di utilizzare un'unica linea retta).
Le concentrazioni di SHBG per i controlli
ed i campioni non noti entro il range dei
37
calibratori non zero possono essere
calcolate dalla curva di calibrazione per
interpolazione. Un ulteriore tracciato del
Legato Percentuale verso la
Concentrazione per i tre dei quattro
calibratori più bassi su carta per grafici
linear-linear (non fornita) può essere
utilizzato per interpolazione prossima alla
dose zero. Per campioni dosati sotto
diluizione, moltiplicare per il fattore di
diluizione appropriato.
Commenti: Benché altri approcci siano
accettabili, il calcolo dei dati con il metodo
appena descritto ha alcuni vantaggi dal
punto di vista del controllo di qualità. In
particolare, produce una curva di
calibrazione che è relativamente lineare
sia in rappresentazioni log-log che linearlinear e relativamente stabile da un
dosaggio all'altro. Produce anche validi
parametri di QC, tra cui, i valori di Legato
Percentuale (%B/B180 o "%B/MB") per i
calibratori non zero.
Un grafico che contiene ancora più
informazioni, quale una pseudo
riproducibilità intra-dosaggio in funzione
della concentrazione, può essere ottenuto
tracciando i valori di Legato Percentuale
dei singoli calibratori piuttosto che
effettuare inizialmente la media dei CPM
dei replicati. Si consiglia di costruire il
grafico log-log della curva di calibrazione,
anche dove il calcolo dei risultati viene
gestito dal computer
Alternative: Benché La Percentuale di
Legato possa essere calcolata
direttamente dai CPM Medi, la correzione
per il legame non specifico produce
normalmente una curva di calibrazione
che sia più vicina alla linearità lungo il suo
range. Una curva di calibrazione può
anche essere costruita tracciando i CPM o
i CPM Medi Direttamente verso la
Concentrazione sia su un grafico log-log
che linear-linear. (Non deve essere
utilizzato un grafico semi-log). Questo
approccio ha la virtù della semplicità, ma è
meno desiderabile dal punto di vista del
controllo di qualità.
Calcolo Computerizzato dei Dati: Sono
accettabili metodi "Punto-a-punto", incluse
linee spline cubiche e lineari; ma poiché
sono poco d'aiuto nel monitoraggio
dell'integrità del dosaggio, è importante
preparare la rappresentazione log-log
della curva di calibrazione, sia
38
manualmente che con il computer come
step del controllo di qualità.
Possono essere utilizzate anche le
tecniche di calcolo dei dati basate sul
modello logistico. All'interno di questa
famiglia, le routine di curve-fitting basate
sulla logistica a 4 o 5 parametri sono i
candidati più idonei. Tuttavia, alcuni
algoritmi ad oggi in uso possono non
convergere in modo uniforme, anche
quando il modello logistico è in accordo
con i dati. Se viene adottato un metodo
logistico, è essenziale verificarne
l'appropriatezza per la routine giornaliera
monitorando il calcolo dei calibratori e di
altri parametri. Inoltre, si consiglia una
rappresentazione log-log della curva di
calibrazione, poiché fornisce più
informazioni della rappresentazione
convenzionale semi-log.
Manipolazione dei Campioni:
Le istruzioni per la manipolazione e la
conservazione dei campioni e dei
componenti del kit devono essere
scrupolosamente osservate. Diluire i
campioni di SHBG con concentrazioni
attese più elevate del calibratore più alto,
(180 nmol/L), con il calibratore zero, prima
di dosarli. Tutti i campioni, inclusi i
calibratori ed i controlli debbono essere
dosati almeno in duplicato. E' importante
utilizzare una micropipetta con puntali
monouso, cambiando il puntale tra i
campioni per evitare la contaminazione da
carry-over. E' possibile utilizzare pipette a
dislocazione positiva e pipettatori-diluitori
automatici solo se è già stata esclusa la
possibilità che si verifichi il carry-over.
Coppie di provette dei controlli possono
essere intervallate all'interno del dosaggio
per verificare l'assenza di deviazioni
significative. Controllare i risultati per
verificare la concordanza all'interno delle
coppie di provette.
Gamma Counter: Per minimizzare la
possibilità di fuoriuscite in gamma counter
multi-pozzetto, le provette delle conte
totali (opzionali) dovrebbero essere
separate da uno o più spazi dalle altre
provette del dosaggio. In alternativa,
aggiungere solo 50 µL del MAb SHBG
125
marcato con I a ciascuna delle provette
T (conte totali) al punto 8, e moltiplicare le
conte per minuto osservate in queste
provette per 4.
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Controlli: Pool di controlli o di sieri con
almeno due livelli di concentrazione di
SHBG (bassa ed elevata) dovrebbero
essere dosati di routine come campioni
non noti ed i risultati annotati di giorno in
giorno. Come descritto in Westgard JO, et
al. A multi-rule chart for quality control.
Clin Chem 1981;27:493-501. La
ripetizione dei campioni è un valido
strumento nel monitoraggio della
precisione inter-dosaggio.
Parametri di QC: Consigliamo di
annotare le prestazioni rilevate:
T = Conte Totali (conte al minuto)
%NSB = 100 × (Conte NSB Medie / Conte
Totali)
%MB = 100 × (Conte Nette / Conte Totali)
Ed i valori delle Percentuali di Legato
("%B/MB") di tutti i calibratori più alti ad
eccezione di quelli zero, ad esempio
%C/MB = 100 × (Conte Nette del Calibratore "C"
/ Conte Nette MB)
Archivio Dati: Si consiglia per ogni
dosaggio di annotare i numeri di lotto dei
componenti utilizzati, le date di
ricostituzione o di apertura.
Ulteriori Letture: Vedi Dudley Ra et al.
Guidelines for immunoassay data
reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71.
Seduta Esemplificativa: A solo scopo
esemplificativo; e non per calcolare i
risultati di un'altra seduta. I valori dei
calibratori sono lotto-specifici, le
concentrazioni elencate nella colonna più
a destra possono non essere in linea con i
valori dei calibratori forniti nel kit. (vedi
tabella "Example Run").
Valori Attesi
Per determinare i range di riferimento
dell'SHBG per uomini e donne non in
gravidanza, sono stati prelevati un numero
totale di campioni di siero di 233 da adulti
con livelli normali di testosterone totale.
Tutti i campioni sono stati dosati con il
dosaggio IRMA-Count SHBG con i risultati
di seguito tabulati.
Gruppo
Range
Centrale al Valore
Mediano
95%
(nmol/L) (nmol/L)
n
Maschi
10–73
31
122
Donne non gravide
16–120
52
111
Considerare questi limiti soltanto come
linee guida. Ogni laboratorio dovrebbe
stabilire i propri range di riferimento.
Interpretazione dei Risultati
Livelli più bassi di SHBG sono spesso
riscontrati nell'irsutismo, nell'acne volgare
9
e nella sindrome dell'ovaio policistico.
Wilke e Utley, ad esempio, riportano livelli
diminuiti di SHBG nel 31% delle serie di
22 pazienti con irsutismo; mentre
Cunningham e McKenna in uno studio su
92 donne affette da irsutismo, hanno
riscontrato livelli soppressi di SHBG nel
5,11
32% dei casi.
I livelli di SHBG possono essere
modestamente ridotti nell'ipotiroidismo e
nell'acromegalia. Nella malattia di Cushing
1,9
e nell'iperprolattinemia. L'SHBG tende
anche ad essere soppressa nell'obesità e
dopo somministrazione di androgeni, in
modo particolare testosterone, o farmaci,
quali il donazolo che compete con gli
androgeni per i siti di legame
1,4,8,9,10
I glucocorticoidi e
sull'SHBG.
l'ormone della crescita sono stati associati
9
a livelli diminuiti di SHBG.
Livelli elevati di SHBG possono essere
incontrati nell'ipertiroidismo e nella cirrosi
1,4
epatica. Livelli alti sono anche riscontrati
in una varietà di altre condizioni, quali la
3,10
gravidanza. Aumenti possono
qualchevolta essere riscontrati dopo
somministrazione di estrogeni – i.e. sotto
forma di alcuni tipi di contraccettivi orali –
o quale conseguenza dell'induzione degli
enzimi epatici attraverso farmaci quali la
1,3,7,9,10
fenitoina.
L'utilizzo del dessametasone nella terapia
su donne affette da irsutismo
iperandrogenico porta tipicamente ad un
4,5
aumento nella concentrazione di SHBG.
Limiti
Cosiccome avviene per la globulina
legante gli ormoni tiroidei, (TBG) ed in
altre proteine di trasporto, i risultati
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
39
dell'SHBG devono essere interpretati
unitamente a determinazioni degli ormoni
che l'SHBG lega, specificatamente il
testosterone. Combinando tale
informazione sotto forma di indice degli
androgeni liberi (FAI) – computato come
rapporto del testosterone totale verso
l'SHBG – è stata riscontrata una migliore
discriminazione tra donne con irsutismo
iperandrogenico e donne sane di quanto
non si sia verificato con l'utilizzo di livelli di
1,5,9,11
SHBG da soli.
Prestazioni del Dosaggio
Vedi Tabelle e Grafici per dati
rappresentativi delle prestazioni del
dosaggio IRMA-Count SHBG. I risultati
sono espressi in nmol/L.
Range di Calibrazione:
Circa da 1 – 180 nmol/L
I valori dei calibratori sono lotto-specifici.
Sensibilità analitica: 0,04 nmol/L
Precisione Intra-Dosaggio (All'interno
della stessa seduta): Sono state
calcolate statistiche per campioni dai
risultati di 20 replicati in un'unica seduta.
(Vedi tabella “Intraassay Precision”.)
Precisione Inter-Dosaggio (Da una
seduta all'altra): Sono state calcolate
statistiche per campioni dai risultati di 20
sedute diverse. (Vedi tabella “Interassay
Precision”.)
Specificità: L'anticorpo è molto specifico
per l'SHBG. (Vedi tabella "Specificity".)
Tipo di Campione Alternativo: Per
determinare l'effetto di tipi di Campione
Alternativi, è stato prelevato del sangue
da 35 volontari in provette semplici,
eparinizzate, EDTA e Becton Dickinson
®
vacutainer SST . Tutti i campioni sono
stati dosati con il dosaggio IRMA-Count
SHBG, con i seguenti risultati. Il plasma
EDTA non è idoneo per l'uso.
(EDTA) = 0,48 (Siero) + 4,4 nmol/L
r = 0,952
(Eparina) = 1,02 (Siero) + 1,5 nmol/L
r = 0,994
(SST) = 0,93 (tubi semplici) + 2,7 nmol/L
r = 0,991
Valore medio:
61 nmol/L (Siero)
34 nmol/L (EDTA)
64 nmol/L (Eparina)
59 nmol/L (SST)
Comparazione di Metodi: Il dosaggio è
stato comparato ad un immunodosaggio
disponibile in commercio per l'SHBG
(Kit A) su 51 campioni di pazienti.
Mediante regressione lineare:
(IRMA-Count) = 1,01 (Kit A) + 3,0 nmol/L
r = 0,984
Valore Medio:
54,8 nmol/L (IRMA-Count)
51,1 nmol/L (Kit A)
Assistenza Tecnica
All'estero: Si prega di contattare il proprio
Distributore Nazionale.
www.siemens.com/diagnostics
Effetto Fine-Seduta: Nessuno fino a circa
200 provette. (Vedi tabella "End-of-Run
Effect".)
Il Sistema Qualità della Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. è certificato ISO 13485:2003.
Linearità: I campioni sono stati dosati a
varie diluizioni. (Vedi tabella “Linearity” per
dati rappresentativi.)
Português
Recupero: Sono stati dosati campioni
diluiti 1:19 con tre soluzioni di SHBG (100,
200 e 410 nmol/L). (Vedi tabella
“Recovery” per dati rappresentativi.)
Bilirubina: La presenza di bilirubina in
concentrazioni fino a 200 mg/L non ha
nessun effetto sui risultati entro il range di
precisione del dosaggio.
Emolisi: La presenza di globuli rossi
impaccati in concentrazioni fino a
30 µL/mL non ha effetto sui risultati entro il
range di precisione del dosaggio.
40
IRMA-Count SHBG
Utilização: O IRMA-Count SHBG é um
ensaio imunoradiométrico de fase sólida
concebido para a medição quantitativa da
globulina de ligação das hormonas
sexuais (SHBG) no soro. Destina-se
unicamente a utilização de diagnóstico in
vitro como auxiliar no diagnóstico
diferencial do hirsutismo.
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Números de catálogo: RKSH1 (100 tubos)
O kit de 100 tubos contém menos
de 20 microcuries
(740 quilobecquerels) de anti125
SHBG I radioactiva.
Sumário e explicação do teste
A globulina de ligação das hormonas
sexuais (SHBG) é uma glicoproteína,
sintetizada no fígado, que liga a
testosterona e a 5α-dihidrotestosterona
com elevada afinidade, e o estradiol com
1,9
uma afinidade ligeiramente inferior. Tem
um único local de ligação de hormonas
esteróides, uma massa molecular de
aproximadamente 80 000 a 100 000
daltons, e consiste em duas subunidades,
praticamente iguais em termos de
tamanho.
A SHBG circula tipicamente em
concentrações mais elevadas nas
mulheres do que nos homens, devido ao
nível mais elevado dos estrogénios
relativamente aos androgénios nas
mulheres. Pela mesma razão, os níveis de
SHBG na fase final da gravidez ou após a
administração de estrogénios podem ser
especialmente elevados. A administração
de androgénios tende a estar associada a
níveis mais reduzidos de SHBG.
A testosterona circula primariamente
ligadas às proteínas, principalmente à
SHBG, mas também à albumina e à
globulina de ligação do cortisol. Uma vez
que as variações dos níveis de proteína
portadora podem afectar a concentração
de testosterona em circulação, os níveis
de SHBG são normalmente medidos
complementarmente às determinações da
testosterona total. O "índice de
androgénio livre” (FAI), calculado como
coeficiente da testosterona total
relativamente à SHBG, revelou-se um
indicador útil de estados anormais de
androgénio em condições como o
1,4,7,11
hirsutismo.
Princípio do Procedimento
O IRMA-Count SHBG é um ensaio
imunoradiométrico baseado em tubos
revestidos a ligandos e anticorpos
125
monoclonais, um marcado com I e o
outro marcado com ligando. A SHBG na
amostra de paciente é capturada pelo
monoclonal marcado com ligando, numa
reacção prosseguindo com cinética de
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
fase líquida. A separação é então
conseguida pelo método da ponte tubo
revestido com ligando/anti-ligando.
Finalmente, é induzida uma reacção entre
a fracção ligada e o anticorpo marcado
radioactivamente, e o marcador em
excesso é removido por lavagem do tubo.
No procedimento, a contagem do tubo
num contador gama produz um número
proporcional à quantidade de SHBG
presente na amostra do paciente.
Reagentes para Pipetar: 3
Tempo Total de Incubação: 90 minutos
Contagens Totais na Marcação com o
Iodo: aproximadamente 300 000 cpm
Avisos e Precauções
Para uso de diagnóstico in vitro.
Reagentes: Conservar a 2–8°C num
frigorífico destinado a materiais
radioactivos. Eliminar de acordo com a
legislação aplicável.
Não utilizar reagentes após o prazo de
validade.
Alguns componentes fornecidos com este
dispositivo podem conter matéria de
origem humana e/ou outros ingredientes
potencialmente perigosos que necessitem
de algumas precauções.
Manipular todos os materiais que possam
transmitir agentes infecciosos, tomando
as devidas precauções. As matérias
primas, obtidas a partir de soro humano,
foram testadas, revelando resultados
negativos para a sífilis, para os anticorpos
do vírus da imunodeficiência humana
(HIV) 1 e 2; para o antigénio de superfície
da hepatite B e para os anticorpos da
hepatite C.
Foi adicionada azida de sódio como
conservante, em concentrações inferiores
a 0,1 g/dL; a fim de evitar acumulações de
azidas metálicas explosivas em
canalizações de cobre e chumbo, os
reagentes devem ser drenados através do
esgoto apenas depois de diluídos em
grandes volumes de água.
Água: Utilizar água destilada ou
desionizada.
Radioactividade
Uma cópia da licença de utilização de
radioisótopos (Específica ou Geral)
emitida para um determinado cliente, deve
41
estar em poder da Siemens Healthcare
Diagnostics antes do envio de kits ou
componentes que contenham material
radioactivo. Estes materiais radioactivos
podem ser adquiridos por qualquer cliente
que possua a necessária licença
Específica. Com uma licença Geral, estes
produtos radioactivos só podem ser
adquiridos por médicos, veterinários na
prática de medicina veterinária,
laboratórios clínicos e hospitais. E
estritamente para uso clinico in vitro ou
testes laboratoriais que não envolvam a
administração externa ou interna do
material radioactivo ou a sua radiação
para seres humanos ou outros animais. A
sua aquisição, prescrição,
armazenamento, utilização, transporte e
eliminação estão sujeitos aos
regulamentos legais e a licença (Geral ou
Específica) emitida pela Comissão
Reguladora Nuclear ou por um Estado
com o qual a NRC (Comissão Reguladora
Nuclear) tenha estabelecido um protocolo
para o exercício de actividades de
regulação.
Tratar os materiais radioactivos de acordo
com a regulamentação da sua licença,
específica ou generalista. De modo a
minimizar a exposição à radiação deve o
utilizador seguir as instruções da
publicação do Departamento Nacional de
Padrões (Utilização segura de materiais
radioactivos-Livro No. 92, publicado em
Março de 1964) e publicações seguintes
do Estado e Autoridades Federais.
Limpar imediatamente os derrames e
descontaminar as superfícies afectadas.
Evitar os aerossóis. Eliminar os resíduos
sólidos radioactivos de acordo com os
requisitos da licença. Os detentores de
licenças gerais (titulares da licença NRC
483) podem eliminar os resíduos sólidos
radioactivos como resíduos não
radioactivos depois de remover os rótulos.
Os detentores de licenças Especificas
(Licença NRC 313) devem ter em conta o
Capitulo 10 do Artigo 20 do Código de
Regulamentações Federais. Os
detentores de licenças nos Estados com
os quais exista um protocolo devem
cumprir a legislação em vigor aprovada
para o seu território. Os detentores de
licenças gerais podem eliminar os
resíduos líquidos radioactivos do tipo
usado neste produto através de um
esgoto de laboratório. As entidades
42
licenciadas devem remover ou tornar
irreconhecíveis os rótulos das
embalagens vazias de materiais
radioactivos antes de os eliminar como
resíduos sólidos. Os detentores de
licenças específicas podem eliminar
pequenas quantidades de resíduos
líquidos radioactivos do tipo usado neste
produto através de um esgoto normal de
laboratório. Devem ser cumpridas as
normas em vigor aplicáveis ao seu
laboratório.
Materiais fornecidos:
Preparação inicial
Anticorpos monoclonais de SHBG
marcados com ligando (SHR1)
22 mL de anticorpo monoclonal marcado
com ligando, com conservante. Estável a
uma temperatura de 2–8°C durante 60
dias depois de aberto, ou até ao prazo de
validade indicado no frasco.
RKSH1: 1 frasco.
125
Anticorpos monoclonais SHBG I
(SHR2)
Anticorpo monoclonal anti-SHBG iodado
liofilizado, com conservante. Reconstituir
cada frasco adicionando 11 mL de água
destilada ou desionizada. Misturar por
inversão suave. Estável a uma
temperatura de 2–8°C durante 30 dias
depois de reconstituído, ou até ao prazo
de validade indicado no frasco.
RKSH1: 2 frascos.
Calibradores SHBG (SHR3–9)
Sete frascos, rotulados de A a G, de
calibradores SHBG liofilizados numa
matriz tamponizada, com conservante.
Pelo menos 30 minutos antes da
utilização, reconstituir o calibrador zero A
com 3,0 mL de água destilada ou
desionizada, e cada um dos restantes
calibradores de B a G com 1,0 mL cada.
Misturar com movimentos suaves ou por
inversão. Estável durante 2 meses
(aliquotado) a uma temperatura de –20°C.
RKSH1: 1 conjunto.
Os calibradores têm valores específicos
de lote de aproximadamente 0, 1, 3, 10,
30, 90 e 180 nmol/L de SHBG. Consultar
os rótulos dos frascos para concentrações
exactas de SHBG. Os pontos de
calibração intermédios podem ser obtidos
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
misturando os calibradores nas
proporções adequadas.
Tubos revestidos com ligando (PST)
Tubos de poliestireno revestidos com
ligando e embalados em saquetas de
fecho hermético. Conservar refrigerado e
protegido da humidade, selar os sacos
cuidadosamente após cada abertura.
Estável a 2–8°C até à data de validade
inscrita na saqueta. Cor: transparente
RKSH1: 100 tubos.
Anti-Ligando SHBG (SHILB)
2,8 mL de anti-ligando, reactivo com o
anticorpo monoclonal marcado com
ligando e com os tubos revestidos com
ligando. Estável a uma temperatura de
2–8°C durante 30 dias depois de aberto,
ou até ao prazo de validade indicado no
frasco. De notar que o anti-ligando
fornecido no kit IRMA-Count SHBG não é
permutável com os fornecidos noutros kits
IRMA-Count. Cor: azul.
RKSH1: 2 frascos.
Concentrado de Solução de Lavagem
Tamponizada (2TSBW)
60 mL de uma solução salina concentrada
tamponizada, com surfactantes. Usando
um recipiente de transferência, diluir o
frasco de concentrado com 600 mL de
água destilada ou desionizada, para um
volume total de 660 mL. Estável a uma
temperatura de 2–8°C durante 6 meses
depois de preparado.
RKSH1: 1 frasco.
Controlos SHBG (SHCO1–2)
Dois frascos rotulados de Controlo SHBG
1 e 2, contendo SHBG liofilizada numa
matriz tamponizada. Pelo menos 30
minutos antes da utilização, reconstituir
cada frasco acrescentando exactamente
1,0 mL de água destilada ou desionizada.
Misturar por inversão suave. Estável
durante 2 meses (aliquotado) a uma
temperatura de –20°C. Consultar a
literatura da embalagem do controlo de
SHBG para valores em nmol/L.
RKSH1: 1 conjunto.
Materiais necessários mas não
fornecidos
Contador gama – compatível com tubos
standard 12x75 mm
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Agitador mecânico – definido para
aproximadamente 200 movimentos por
minuto
Preparação dos Reagentes
Água destilada ou desionizada
Pipeta — para uma dose de 11 mL
Pipeta volumétrica – para doses de 3 mL
e de 1 mL
Proveta graduada – para uma dose de
600 mL
Contentor plástico de armazenamento
com tampa — para preparação e
armazenamento de Solução de Lavagem
Tamponizada
Imunoensaio
Micropipeta: 10 µL. Para a adição de uma
amostra de 10 µL, usar uma pipeta de
pontas descartáveis, em vez de uma
pipeta de transporte, a fim de minimizar o
risco de contaminação.
Dispensadores de repetição ou
Micropipetas: 50 µL e 200 µL
Dispensador: 2,0 mL – para a Solução de
Lavagem Tamponizada
Dispositivo de decantação de espuma –
disponível na Siemens Healthcare
Diagnostics (Números de catálogo: FDR).
Papel milimétrico log-log de 3 ciclos
Colheita
O paciente não precisa de estar em jejum.
Não são necessárias preparações
especiais. Colher sangue por punção
13
venosa para tubos lisos, anotando a
hora da colheita. Esperar até o espécimen
coagular, de seguida, separar o soro das
células.
A lipémia pode interferir no ensaio. As
amostras lipémicas devem ser clarificadas
através de ultra-centrifugação.
Amostras hemolisadas podem indicar
tratamento incorrecto de um espécimen
antes do seu envio para laboratório; desta
forma, os resultados devem ser
interpretados de forma cautelosa.
Não é adequada a utilização de plasma
de EDTA.
O plasma heparinizado não tem efeito no
ensaio.
Os tubos para colheita sanguínea de
diferentes fabricantes, podem originar
43
diferentes valores, dependendo dos
materiais e aditivos, incluíndo gel ou
barreiras fisicas, activadores do coágulo
e/ou anti coagulantes. IRMA-Count SHBG
não foram ainda testados com todas as
possiveis variações originadas pelos tipos
de tubos. Consultar a secção Tipos de
Amostras Alternativas para obter detalhes
sobre os tubos que foram testados.
Consultar os rótulos dos frascos dos
calibradores para valores em nmol/L.
2
Pipetar directamente para a base
dos tubos. As amostras que se
preveja que contenham
concentrações de SHBG superiores
ao calibrador mais elevado
(180 nmol/L) devem ser diluídas com
o calibrador zero. Recomenda-se a
utilização de micropipetas de ponta
descartável, a fim de evitar
contaminação entre amostras. Não
devem ser utilizados pipetadoresdiluidores automáticos a menos que a
possibilidade de contaminação tenha
sido avaliada e considerada como não
significativa.
Volume de Amostra: 10 µL de soro por
tubo.
Armazenamento: 2–8°C durante 7 dias,
ou durante 2 meses a –20°C.
Antes do ensaio, deixar as amostras à
temperatura ambiente (15–28°C) e
misturar por movimentos ou inversão
suaves. Aliquotar, se necessário, para
evitar congelamentos/descongelamentos
repetidos. (Não tentar descongelar
espécimens congelados aquecendo-os
em banho-maria.)
3
Procedimento Imunométrico de
Doseamento
Rotular catorze Tubos Revestidos a
Ligando como A (ligação não
específica) e de B a G ("ligação
máxima") em duplicado. Rotular tubos
adicionais revestidos a ligando,
também em duplicado, para controlos
e amostras de paciente.
4
Incubar durante 30 minutos à
temperatura ambiente (15–28°C).
5
Adicionar 50 µL de Anti-Ligando
(AZUL) a todos os tubos, à excepção
dos tubos T.
Opcionalmente, rotular dois tubos
lisos (não revestidos) de poliestireno
de 12x75 mm como T (contagens
totais) em duplicado, e reservá-los até
à fase 8.
Calibradores
nmol/L Aproximado
T*
—
A (NSB)
0
B
1
C
3
D
10
E
30
F
90
G ("MB")
180
Opcionais
Nota: Os valores dos calibradores
são valores específicos de lote.
44
Adicionar 200 µL de Anticorpos
monoclonais SHBG marcados com
Ligando a todos os tubos à excepção
dos tubos T. Agitar.
Pipetar directamente para a base
dos tubos. Recomenda-se um
dispensador de repetição para esta
fase, bem como para a adição de
Anti-Ligando SHBG na fase 5 e de
marcador na fase 8.
Todos os componentes devem estar à
temperatura ambiente(15–28°C) antes da
sua utilização.
1
Pipetar 10 µL de cada calibrador,
controlo e amostra de paciente para
os tubos preparados.
Pipetar directamente sobre a
mistura de reacção. Ao dispensar o
Anti-Ligando, deve ter-se o cuidado
de evitar contaminação.
6
Misturar durante 30 minutos num
agitador mecânico.
7
Decantar e deixar escorrer
completamente Adicionar 2 mL de
Solução de Lavagem Tamponizada a
cada tubo. Esperar 1 a 2 minutos, e
de seguida decantar vigorosamente.
A remoção de toda a humidade visível
melhora substancialmente a precisão.
Depois da lavagem, decantar o
conteúdo de todos os tubos, usando
um dispositivo de decantação de
espuma. De seguida, bater os tubos
contra papel absorvente para remover
todas as gotas residuais.
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
8
Adicionar 200 µL de Anticorpos
125
monoclonais SHBG I a todos os
tubos.
Pipetar directamente para a base
do tubo, e garantir que a amostra e o
marcador estão completamente
misturados e sem espuma. O
marcador deve ser adicionado no
espaço de 10 minutos. Recomendase um dispensador de repetição para
esta fase, bem como para a adição de
Anti-Ligando SHBG na fase 5. Deixar
os tubos T (opcionais) para as
contagens (na fase 11); não
necessitam de mais processamento.
9
Misturar durante 30 minutos num
agitador mecânico.
10 Decantar e deixar escorrer
completamente Adicionar 2 mL de
Solução de Lavagem Tamponizada a
cada tubo. Esperar 1 a 2 minutos, e
de seguida decantar vigorosamente.
Adicionar novamente 2 mL de
Solução de Lavagem Tamponizada,
esperar 1 a 2 minutos, de seguida
decantar e escorrer completamente.
A remoção de toda a humidade visível
melhora substancialmente a precisão.
Depois da segunda lavagem,
decantar o conteúdo de todos os
tubos (à excepção dos tubos T)
usando um dispositivo de decantação
de espuma, e deixá-los escorrer
durante 2 ou 3 minutos. De seguida,
bater os tubos contra papel
absorvente para remover todas as
gotas residuais.
11 Contar durante 1 minuto num
contador gama.
Em contadores gama de cabeça
múltipla, os tubos de Contagem Total
(opcionais) deverão ser separados
dos restantes tubos de ensaio pelo
menos um espaço, a fim de minimizar
a possibilidade de derrame.
Cálculos e Controlo de
Qualidade
A fim de calcular as concentrações de
SHBG a partir de uma representação loglog da curva de calibração, começar por
corrigir as contagens por minuto (CPM) de
cada par de tubos subtraindo a CPM
média dos tubos de ligação não
específica (calibrador A):
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
Contagens reais = (Média CPM) minutos (Média
NSB CPM)
Determinar de seguida a ligação (%B/B180,
aqui designada por "%B/MB") de cada par
de tubos como percentagem de “ligação
máxima”, considerando as contagens
corrigidas com NSB do calibrador mais
elevado (calibrador G) como 100%:
Percentagem de Ligação = (Contagens reais /
Contagens MB reais) × 100
Usando papel milimétrico log-log de 3
ciclos, representar a Percentagem de
Ligação relativa à Concentração para
cada um dos calibradores diferentes de
zero, de B a G, e desenhar uma curva
aproximando a trajectória destes pontos.
(Ligar os pontos de calibração usando
arcos ou segmentos de linha recta. Não
tentar aplicar uma única linha recta aos
dados). É então possível estimar as
concentrações de SHBG dos controlos e
amostras desconhecidas dentro da gama
dos calibradores diferentes de zero com
base na curva de calibração por
interpolação. Pode ser usada uma
representação adicional da Percentagem
de Ligação relativamente à Concentração
para os três ou quatro calibradores mais
baixos em papel milimétrico linear-linear
(não fornecido) para interpolação próximo
da dose zero. Para amostras submetidas
a ensaio com diluição, multiplicar pelo
factor de diluição adequado.
Observações: Embora sejam aceitáveis
outras abordagens, a redução de dados
pelo método que acabamos de descrever
apresenta certas vantagens do ponto de
vista do controlo da qualidade. Em
particular, produz uma curva de calibração
relativamente linear tanto nas
representações log-log como linear-linear,
e relativamente estável de ensaio para
ensaio. Produz igualmente parâmetros de
CQ úteis, tais como valores de
Percentagem de Ligação (%B/B180 ou
"%B/MB") para os calibradores diferentes
de zero.
Pode obter-se um gráfico ainda mais
informativo que veícula uma ideia de
reprodutibilidade intra-ensaio em função
da concentração, representando os
valores da Percentagem de Ligação de
tubos de calibrador individuais sem ter de
calcular primeiro a média da CPM das
réplicas. Constitui boa prática de Controlo
45
de Qualidade elaborar a representação
log-log recomendada da curva de
calibração, mesmo que o cálculo dos
resultados seja processado por
computador.
Alternativas: Embora a Percentagem de
Ligação possa ser calculada directamente
a partir da CPM Média, a correcção da
ligação não específica produz
normalmente uma curva de calibração
mais próxima da linearidade em toda a
sua amplitude. Também é possível gerar
uma curva de calibração representando
directamente a CPM ou a CPM Média
relativamente à Concentração em papel
milimétrico log-log ou linear-linear. (Não
deve ser utilizado papel milimétrico semilogarítimico) Esta abordagem tem a
vantagem de ser mais simples, mas é
menos recomendável do ponto de vista do
controlo da qualidade.
Redução de Dados Computadorizada:
Os métodos "ponto-a-ponto", incluindo
ajustamentos por fasquia lineares ou por
spline cúbico, são adequados à utilização
com o sistema IRMA-Count SHBG.
Todavia, uma vez que os métodos “pontoa-ponto” fornecem pouca ajuda na
monitorização da integridade de um
ensaio, é importante preparar a
representação log-log recomendada da
curva de calibração, manualmente ou por
computador, como etapa do controlo de
qualidade.
As técnicas de redução de dados
baseadas no modelo logístico poderão
também ser aplicadas. Nesta família, as
rotinas de aproximação baseadas em
logística de 4 ou 5 parâmetros são as
possibilidades mais adequadas. Deve,
contudo, ter-se em atenção que alguns
algoritmos actualmente utilizados podem
não convergir com êxito, mesmo quando o
modelo de logística é fiel aos dados. Se
for adoptado um modelo logístico, é
essencial verificar a sua adequação para
o ensaio de cada dia, monitorizando o
cálculo de confirmação dos calibradores e
outros parâmetros. Além disso,
recomenda-se fortemente uma
representação da curva de calibração em
log-log, já que é mais informativa do que a
representação semi-logarítmica
convencional.
Manuseamento das Amostras:
Respeitar criteriosamente as instruções
46
de manuseamento e armazenamento das
amostras de paciente e dos componentes.
Diluir as amostras de paciente que se
preveja que contenham concentrações de
SHBG superiores ao calibrador mais
elevado (180 nmol/L) com o calibrador
zero antes do ensaio. Todas as amostras,
incluindo os calibradores e controlos,
devem ser submetidas pelo menos a
ensaio duplo. É importante usar uma
micropipeta de pontas descartáveis,
substituindo a ponta entre cada
amostragem, a fim de evitar contaminação
entre amostras. Devem ser utilizadas
pipetas de transporte e pipetadoresdiluidores automáticos apenas se a
possibilidade de contaminação tiver sido
avaliada e considerada como não
significativa. Os pares de tubos de
controlo podem ser espaçados ao longo
do ensaio a fim de ajudar a confirmar a
ausência de desvio significativo. Analisar
os resultados para verificar a
concordância entre pares de tubos.
Contador Gama: A fim de minimizar a
possibilidade de derrame em contadores
gama de reservatório múltiplo, os tubos
(opcionais) de contagem total deverão ser
separados um ou mais espaços dos
restantes tubos de ensaio.
Alternativamente, adicionar apenas 50 µL
125
de Anticorpos monoclonais SHBG I a
cada um dos tubos T (contagens totais)
na fase 8, e multiplicar por 4 as contagens
por minuto observadas nestes tubos.
Controlos: Os controlos ou os pools de
soro de paciente com pelo menos dois
níveis de concentração de SHBG (baixo e
elevado) devem por rotina ser submetidos
a ensaio como amostras desconhecidas,
e os resultados devem ser registados em
gráfico de dia para dia, de acordo com o
procedimento descrito em Westgard JO,
et al. A multi-rule chart for quality control.
Clin Chem 1981; 27:493-501. As amostras
de repetição constituem uma ferramenta
adicional útil para monitorizar a precisão
inter-ensaios.
Parâmetros de CQ: Recomendamos o
acompanhamento destas medições de
desempenho.
T = Contagens Totais (como contagens por
minuto)
%NSB = 100 × (Média Contagens NSB /
Contagens Totais)
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
%MB = 100 × (Contagens reais / Contagens
Totais)
E os valores de Percentagem de Ligação
("%B/MB") de todos os calibradores
excepto do calibrador diferente de zero
mais elevado, por exemplo:
%C/MB = 100 × (Contagens Líquidas Calibrador
"C" / Contagens Líquidas MB)
Manutenção de Registos: Constitui boa
prática laboratorial registar para cada
ensaio o número do lote dos
componentes usados, bem como as datas
de quando foram reconstituídos ou
abertos pela primeira vez.
Literatura Adicional: Ver Dudley RA, et
al. Guidelines for immunoassay data
reduction. Clin Chem 1985; 31:1264-71.
Exemplo de Ensaio: Para ilustração
apenas, não serve para calcular os
resultados de outro ensaio. Uma vez que
os valores dos calibradores são valores
específicos de lote, as concentrações
listadas na coluna mais à direita podem
não corresponder aos valores dos
calibradores fornecidos na sua remessa.
(Ver tabela "Exemplo de Ensaio".)
Valores Esperados
A fim de determinar as gamas de
referência de SHBG para homens e
mulheres não grávidas, foi colhido um
total de 233 amostras de soro em adultos
com níveis normais de testosterona total.
Todas as amostras foram submetidas a
ensaio com o procedimento IRMA-Count
SHBG, com os resultados indicados no
quadro abaixo.
Grupo
Central 95% Mediana
(nmol/L)
(nmol/L)
n
Homens
10–73
31
122
Mulheres (não
grávidas)
16–120
52
111
Considere estes limites apenas como
directrizes. Cada laboratório deve
estabelecer as suas próprias gamas de
referência.
Interpretação dos Resultados
Níveis reduzidos de SHBG são muitas
vezes encontrados em casos de
hirsutismo, acne e no síndroma de ovários
9
poliquísticos. Wilke and Utley, por
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
exemplo, referenciaram níveis de SHBG
reduzidos em 31% de uma série de 22
pacientes com hirsutismo; enquanto
Cunningham and McKenna, num estudo
realizado em 92 mulheres com hirsutismo,
encontraram níveis de SHBG suprimidos
5,11
em 32%.
Os níveis de SHBG podem ser
ligeiramente reduzidos em casos de
hipotiroidismo, acromegália, Doença de
1,9
Cushing e hiperprolactinemia. A SHBG
tende também a estar suprimida em casos
de obesidade e após a administração de
androgénios, nomeadamente
testosterona, ou fármacos, como o
danazol, que competem com os
androgénios por locais de ligação na
1,4,8,9,10
Os glicocorticóides e a
SHBG.
hormona de crescimento têm da mesma
forma estado associados a níveis
9
reduzidos de SHBG.
Podem ser encontrados níveis elevados
de SHBG em casos de hipertiroidismo e
1,4
cirrose hepática. Níveis elevados são
igualmente encontrados numa série de
3,10
outros estados, tais como a gravidez.
Aumentos podem por vezes ser
observados após a administração de
estrogénios – ex. sob a forma de certos
tipos de contraceptivos orais – ou como
consequência da indução de enzima
hepática através de fármacos como a
1,3,7,9,10
fenitoína.
O uso de dexametasona no tratamento de
mulheres com hirsutismo
hiperandrogénico leva tipicamente a um
4,5
aumento das concentrações de SHBG.
Limitações
Tal como acontece na globulina de
ligação da hormona tiroideia (TBG) e
outras proteínas transportadoras, os
resultados de SHBG devem ser
interpretados em conjunto com medições
das hormonas que liga, nomeadamente a
testosterona. A combinação dessa
informação sob a forma de um índice de
androgénio livre (FAI) — considerado
como o coeficiente entre a testosterona
total e a SHBG — foi referenciada como
produzindo uma melhor diferenciação
entre mulheres com hirsutismo
hiperandrogénico e mulheres saudáveis
do que o uso exclusivo dos níveis de
1,5,9,11
SHBG.
47
Características do Ensaio
Ver Tabelas e Gráficos para dados
representativos do desempenho do kit
IRMA-Count SHBG. Os resultados são
apresentados em nmol/L.
Calibração:
Aproximadamente 1 – 180 nmol/L
Os valores dos calibradores são valores
específicos de lote.
Sensibilidade Analítica: 0,04 nmol/L
Precisão Intra-ensaio (Entre ensaios):
Foram efectuados cálculos estatísticos
para amostras a partir dos resultados de
20 réplicas num único ensaio. (Ver tabela
“Precisão Intra-ensaio".)
Precisão Inter-ensaio (Ensaio a
ensaio): Foram efectuados cálculos
estatísticos para amostras submetidas a
ensaio em 20 ensaios diferentes. (Ver
tabela “Precisão Inter-ensaio".)
Especificidade: O anticorpo é altamente
específico para SHBG. (Ver tabela
"Especificidade".)
Efeito fim-de-série: Nenhum até
aproximadamente 200 tubos. (Ver tabela
"Efeito fim-de-série".)
Linearidade: As amostras foram
doseadas sob várias diluições. (Ver tabela
"Linearidade" para dados
representativos.)
Recuperação: Foram submetidas a
ensaio amostras a que foram adicionadas
três soluções de SHBG numa proporção
de 1 para 19 (100, 200 e 410 nmol/L).
(Ver tabela "Recuperação" para dados
representativos.)
Bilirrubina: A presença de bilirrubina em
concentrações até 200 mg/L não tem
efeito nos resultados, dentro da precisão
do ensaio.
Hemólise: A presença de eritrócitos em
concentrações até 30 uL/mL não tem
efeito nos resultados, dentro da precisão
do ensaio.
Tipo de amostra alternativa: Para
avaliar o efeito de tipos de amostras
alternativas, foi colhido sangue de 35
voluntários para tubos lisos de vácuo
®
EDTA, heparinizados e SST da Becton
Dickinson. Todas as amostras foram
submetidas a ensaio com o procedimento
IRMA-Count SHBG, com os resultados
48
seguintes. O plasma EDTA não é
adequado para uso.
(EDTA) = 0,48 (Soro) + 4,4 nmol/L
r = 0,952
(Heparina) = 1,02 (Soro) + 1,5 nmol/L
r = 0,994
(SST) = 0,93 (tubos simples) + 2,7 nmol/L
r = 0,991
Médias:
61 nmol/L (Soro)
34 nmol/L (EDTA)
64 nmol/L (Heparina)
59 nmol/L (SST)
Comparação de Métodos: O ensaio foi
comparado com um imunoensaio
disponível no mercado para SHBG (Kit A)
em 51 amostras de paciente. Regressão
linear:
(IRMA-Count) = 1,01 (Kit A) + 3,0 nmol/L
r = 0,984
Médias:
54,8 nmol/L (IRMA-Count)
51,1 nmol/L (Kit A)
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Provided section, added FDR catalog number
for foam decanting rack; removed “available
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
from Siemens” claim for graph paper ZPIRM,
rack shaker DPSR1/DPSR2 and 2 mL dispenser
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étiquettes des produits : / Sull'etichetta del
prodotto possono essere presenti i seguenti
simboli: / Os seguintes símbolos podem
aparecer no rótulo dos produtos:
Symbol Definition
En: In vitro diagnostic medical
device
De: Medizinisches Gerät zur
In-vitro Diagnose
Es: Dispositivo médico para
diagnóstico in vitro
Fr: Dispositif médical de
diagnostic in vitro
It: Dispositivo medico per
diagnostica in vitro
Pt: Dispositivo médico para
diagnóstico in vitro
En: Catalog Number
De: Katalog-Nummer
Es: Número de referencia
Fr: Numéro de référence
catalogue
It: Numero catalogo
Pt: Número de catálogo
En: Manufacturer
De: Hersteller
Es: Fabricante
Fr: Fabricant
It: Produttore
Pt: Fabricante
Symbol Definition
En: Authorized Representative in
the European Community
De: Autorisierte Vertretung in der
Europäischen Union
Es: Representante autorizado en
la Unión Europea
Fr: Représentant agréé pour
l’Union européenne
It: Rappresentante autorizzato
nella Comunità europea
Pt: Representante Autorizado na
Comunidade Europeia
En: CE Mark
De: CE-Kennzeichen
Es: Símbolo de la CE
Fr: Marque CE
It: Marchio CE
Pt: Marca CE
En: CE Mark with identification
number of notified body
De: CE-Kennzeichen
Identifikationsnummer der
benannten Stelle
Es: Marca de la CE con número
de identificación del organismo
notificado
Fr: Marque CE avec numéro
d’identification du corps notifié
It: Marchio CE con numero
identificativo dell'ente notificato
Pt: Marca CE, com número de
identificação do órgão notificado
En: Consult instructions for use
De: Bedienungshinweise
beachten
Es: Consulte las instrucciones de
uso
Fr: Consulter le mode d’emploi
It: Consultare le istruzioni per
l'uso
Pt: Consulte as instruções de
utilização
En: Caution! Potential Biohazard
De: Vorsicht! Biologisches
Risikomaterial
Es: ¡Precaución! Peligro Biológico
Potencial
Fr: Avertissement ! Risque
biologique potentiel
It: Attenzione! Potenziale Pericolo
Biologico
Pt: Precaução! Potenciais Riscos
Biológicos
En: Radioactive Materials
De: Radioaktives Material
Es: Materiales radiactivos
Fr: Matériaux radioactifs
It: Materiali radioattivi
Pt: Materiais Radioactivos
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)
49
Symbol Definition
En: Caution
De: Vorsicht
Es: Precaución
Fr: Avertissement
It: Attenzione
Pt: Precaução
Symbol Definition
En: Batch code
De: Chargenbezeichnung
Es: Código de lote
Fr: Numéro de code du lot
It: Codice lotto
Pt: Código de lote
LOT
En: Temperature limitation
(2–8°C)
De: Temperaturgrenze (2–8°C)
Es: Limitación de la temperatura
(2–8°C)
Fr: Limites de température
(2–8°C)
It: Limiti di temperatura (2–8°C)
Pt: Limites de temperatura
(2–8°C)
En: Upper limit of temperature
(≤ -20°C)
De: Obere Temperaturgrenze
(≤ -20°C)
Es: Limitación superior de la
temperatura (≤ -20°C)
Fr: Limite supérieure de
température (≤ -20°C)
It: Limite superiore di temperatura
(≤ -20°C)
Pt: Limite máximo de temperatura
(≤ -20°C)
En: Lower limit of temperature
(≥2°C)
De: Mindesttemperatur (≥2°C)
Es: Temperatura maxima (≥2°C)
Fr: Limite inférieure de
température (≥2°C)
It: Limite inferiore di temperature
(≥2°C)
Pt: Limite inferior de temperatura
(≥2°C)
En: Do not freeze (> 0°C)
De: Nicht einfrieren (> 0°C)
Es: No congelar (> 0°C)
Fr: Ne pas congeler (> 0°C)
It: Non congelare (> 0°C)
Pt: Não congele (> 0°C)
En: Keep away from sunlight
De: Vor Sonneneinstrahlung
schützen
Es: Mantener protegido de la luz
solar
Fr: Maintenir hors de portée de la
lumière du soleil
It: Non esporre alla luce del sole
Pt: Manter protegido da luz solar
50
En: Contains sufficient for (n)
tests
De: Es reicht für (n) tests
Es: Contiene material para (n)
pruebas
Fr: Suffisant pour (n) tests
It: Contiene materiale sufficiente
per (n) test
Pt: Contém o suficiente para (n)
testes
2008-01
En: Date format (year-month)
De: Datumsformat (Jahr-Monat)
Es: Formato de fecha (año-mes)
Fr: Format de la date
(année-mois)
It: Formato data (anno-mese)
Pt: Formato de data (ano-mês)
En: Use by
De: Verwendbar bis
Es: Fecha de caducidad
Fr: A utiliser avant
It: Usare entro
Pt: Use até
En: Harmful
De: Gesundheitsschädlich
Es: Nocivo
Fr: Nocif
It: Nocivo
Pt: Nocivo
En: Corrosive
De: Ätzend
Es: Corrosivo
Fr: Corrosif
It: Corrosivo
Pt: Corrosivo
En: Toxic
De: Giftig
Es: Tóxico
Fr: Toxique
It: Tossico
Pt: Tóxico
En: Dangerous for the
environment
De: Umweltgefährlich
Es: Peligroso para el medio
ambiente
Fr: Dangereux pour
l'environnement
It: Pericoloso per l'ambiente
Pt: Perigoso para o ambiente
IRMA-Count SHBG (PIRKSH-12, 2010-11-03)