mutazioni puntiformi
Vincenzo Nigro
Dipartimento di Patologia Generale
Seconda Università degli Studi di Napoli
Telethon Institute of Genetics and Medicine
(TIGEM)
5 effetti di un allele
• nullo o amorfo = nessun prodotto genico
• ipomorfo = ridotta quantità/attività
• ipermorfo = aumentata quantità/attività
• neomorfo = nuova quantità/attività
• antimorfo = quantità/attività antagonistica
(dominante negativo)
mutazioni puntiformi missenso
• Le mutazioni missenso sono quelle in cui il
cambiamento determina nel prodotto
proteico la sostituzione di un aminoacido
con un aminoacido differente
• Sebbene queste alterazioni generalmente
non provochino conseguenze nella
funzionalità della proteina (polimorfismi o
varianti) , ci sono casi in cui anche una
minima alterazione può avere
conseguenze gravi.
Mutazioni dei codoni umani
(mutazioni independenti nei geni F8, F9, L1CAM, OTC, BTK)
300
200
5082 Codons in 5 chrX genes
2446 Mutations in 5 chrX genes
Gly G
Arg R
Trp W
Cys C
Glu E
Asp D
Lys K
Asn N
Gln Q
His H
Tyr Y
Ala A
Thr T
Pro P
Ser S
Val V
Met M
Leu L
0
Ile I
100
Phe F
Numbers normalised to 1,000
400
mutazioni puntiformi nonsenso
• La mutazione nonsenso è quella in cui la
modificazione nucleotidica provoca la
creazione di un tripletta di stop, che
blocca la sintesi della proteina
prematuramente.
• In questo caso, la funzionalità della
proteina dipenderà dalla posizione dello
stop.
mutazioni nonsenso
15%
16%
UAA
UAG
UGA
69%
Su 731
mutazioni independenti
SEA 3063
in 9 patologie del cromosoma
X
mutazioni frame-shift
• Le mutazioni frame-shift o di slittamento
del modulo di lettura consistono
nell’inserzione o delezione di un numero di
nucleotidi non divisibile per 3 (1, 2, 4, 5,
7, 8, 10, ecc.) con conseguente
sfasamento della cornice di lettura delle
triplette dell'RNA messaggero.
• Questa mutazione determina la traduzione
non corretta della proteina a valle della
mutazione.
Numerazione dei nucleotidi
Nucleotidi del cDNA
• Il nucleotide +1 è la A dell’ ATG-codone di inizio della
traduzione
• Il nucleotide che precede al 5' l’ATG-codone di inizio
della traduzione è denominato -1; non esiste una base 0
• Il nucleotide che segue al 3' il codone di terminazione
è denominato *1
Nucleotidi intronici fiancheggianti
• inizio dell’introne: il numero dell’ultimo nucleotide
dell’esone che precede, il segno + e la posizione
nell’introne, ad esempio 77+1G, 77+2T, oppure quando
il numero dell’esone è noto ed univoco IVS1+1G,
IVS1+2T
• fine dell’introne: il numero del primo nucleotide del
esone seguente, il segno – e la posizione a monte
dell’esone, ad esempio 78-2A, 78-1G, oppure quando il
numero dell’esone è noto ed univoco, IVS1-2A, IVS1-2G
sostituzioni
• le sostituzioni sono indicate dal carattere “>”. Ad
esempio, 76A>C indica che in posizione 76 un’adenina è
sostituita da una citosina
88+1G>T (oppure IVS2+1G>T) indica che una guanina è
sostituita da una timina in posizione +1 dell’introne 2,
posizionato tra i nucleotidi 88 e 89 del cDNA
89-2A>C (oppure IVS2-2A>C) indica che un’adenina è
sostituita da una citosina in posizione -2 dell’introne 2,
posizionato tra i nucleotidi 88 e 89 del cDNA
mutazioni
SNPs
teoricamente
previste
T>A o G , C>G or A
G>T o C , A>T or G
trasversioni
transizioni
T>C, C>T, G>A, A>G
46,000
trasversioni
transizioni
12,000,000
trasversioni
transizioni
SEA 3057
Il meccanismo più comune di mutazione
NH2
NH2
N
N
O
Cytosine
H 3C
metilazione
O
H 3C
N
N
O
deaminazione
5-methylcytosine
CG
CG
TG
CA
NH
N
O
Thymine
eredità autosomica dominante a penetranza completa
acrocefalosindattilia
sindrome di Apert
•1:65.000 alla nascita
•craniosinostosi, volta cranica a
forma conica
•ipertensione endocranica
•ritardo mentale
•ipoplasia della parte centrale
della faccia
•sindattilia delle dita delle mani e
dei piedi
•sordità e atrofia ottica
acrocefalosindattilia
sindrome di Apert
• tutti i pazienti hanno la stessa mutazione Apert
(Cys755Gly) del gene human fibroblast growth factor
receptor 2 (FGFR2)
• la mutazione è in eterozigosi
• de novo
• cromosoma 10q26
• la sindrome è allelica con Crouzon e Pfeiffer
sindrome di Pfeiffer
• alcuni pazienti hanno la mutazione Pfeiffer (Cys342Arg) del gene
human fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2)
• altri la mutazione Pro252Arg in FGFR1
• la mutazione è in eterozigosi
• de novo
• cromosoma 10q26
• la sindrome è allelica con Crouzon e Apert
disostosi cranio facciale
sindrome di Crouzon
• alcuni pazienti hanno la mutazione (Cys342Tyr) del gene
human fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2)
• la mutazione è in eterozigosi
• de novo
• cromosoma 10q26
• la sindrome è allelica con Pfeiffer e Apert con alcune
mutazioni in comune
acondroplasia
•
•
•
•
nanismo dismorfico (1:35.000)
arti corti e testa sproporzionatamente più grossa
fronte prominente e naso appiattito
altezza media 130 cm nei maschi 125 cm nelle
femmine
• La mutazione è in eterozigosi
• Gly380Arg nel recettore 3 del "fibroblast growth
factor" (FGFR3) a 4p16.3
• autosomico dominante a penetranza completa
acondroplasia
• La mutazione conferisce una funzione aumentata al
recettore dell'FGF (allele ipermorfo) che è una tirosinchinasi di membrana
• In risposta all'FGF il recettore dimerizza e si fosforila
trasducendo un segnale con la funzione di rallentare la
proliferazione dei condrociti e quindi la crescita ossea
• Topi senza il gene FGF3R hanno ossa lunghe e vertebre
allungate
ipocondroplasia
•L'ipocondroplasia ha caratteristiche simili
all'acondroplasia, ma di gravità minore con un
coinvolgimento craniofacciale inferiore. L'altezza può
risultare ai limiti della norma e la malattia viene spesso
non diagnosticata.
•L'ipocondroplasia è meno omogenea: circa il 70% dei
casi è dovuto alla sostituzione N540K del gene FGFR3,
mentre non si conosce la mutazione nel restante 30%.
frequenza relativa di mutazioni de novo
che causano acondroplasia i rapporto all’età paterna
numero di divisioni nelle linea germinale maschile
mutazioni eterozigoti di PAX3
Waardenburg
mutazioni eterozigoti di PAX3
Waardenburg
• sordità (o deficit uditivo di vario livello) bilaterale,
• modifiche nella pigmentazione, sia dei capelli (albinismo
parziale, in genere piebaldismo) che della pelle,
• anomalie nello sviluppo dei tessuti derivati dalla cresta
neurale
• lateralizzazione del canto mediale
• diverso colore degli occhi (eterocromia), di solito uno
marrone e l'altro blu
Motivi classici di splicing
HGMD Mutations in Intron splice sites
1000
1800
900
1600
2296 Acceptor
Splice Site mutations
800
(5Jan07)
3498 Donor
Splice Site mutations
1400
700
1200
600
1000
500
800
400
600
300
400
200
200
100
0
0
-15
-13
-11
-9
-7
-5
-3
-1
2
4
Nucleotide number in the acceptor site
-5
-3
-1
2
4
6
8
10
12
14
Nucleotide number in the donor site
exon
5’ss
3’ss
exon
5’ss
IVS
5’ss mutation; exon skipping
3’ss mutation; exon skipping
5’ss mutation; use of cryptic 5’ss
3’ss mutation; use of cryptic 3’ss
Activation of cryptic 5’ss
Activation of cryptic 5’ss and use of cryptic 3’ss
Splicing enhancer mutation
Lariat structure branchpoint mutation
3’ss
IVS
exon
Progeria
Hutchinson-Gilford
• invecchiamento precoce
• bassa statura, pelle rugosa
• calvizie, assenza di tessuto adiposo
• aterosclerosi ed infarto
Progeria
Hutchinson-Gilford
• nuova mutazione in eterozigosi del gene lamina A
• la mutazione è in eterozigosi
• de novo
• cromosoma 1q23
• La mutazione non cambia l'aminoacido glicina G608G,
ma introduce un sito donor di splicing GGT che fa
perdere 50 aminoacidi alla proteina
• sperimentazione con inibitori di farnesil-trasferasi
conversione genica
DHPLC
denaturing high-performance liquid chromatography
• Serve a stabilire se, se un frammento di DNA è identico ad un
frammento standard o contiene uno o più nucleotidi diversi
• E’ una tecnica in HPLC a fase inversa in cui una fase stazionaria
costituita da microsferette omogenee di polistirene divinilbenzene è
in grado di trattenere una molecola polare come il DNA grazie
all’azione di un controione, rappresentato dal Trietil Ammonio
Acetato (TEAA 0.1M)
• La parte polare del TEAA interagisce con il DNA e la parte apolare
con la fase stazionaria
• Essa si basa sui differenti tempi di eluizione applicando un gradiente
di acetonitrile di eteroduplex e omoduplex DNA
• Il DNA omoduplex è quello nativo, mentre l’eteroduplex si forma
quando sono denaturati e rinaturati nella stessa provetta due
frammenti di DNA che hanno una piccola differenza nella sequenza
di basi
DHPLC
A
WT
A
MUT
T
G
Allele A
B
C
Allele B
Denaturazione e
raffreddamento
G
T
A
C
Heteroduplex
G
C
A
T
Homoduplex
C
sequenziamento del DNA
dNTPs
Oligo di innesco (solo uno strand)
ddNTP fluorescenti
DNA stampo denaturato
Con l’incorporazione di un ddNTP marcato si ha il
blocco dell’estensione
Elettroforesi capillare e lettura della fluorescenza
Schema di un ddNTP
Esempio di elettroferogramma