STRUTTURA 3D ENZIMI
RNA polimerasi
Piruvato carbossilasi
Fosfofruttochinasi
Glutammina sintetasi
DNA polimerasi (E. coli)
ATP sintetasi
CLASSIFICAZIONE ENZIMI
Alcuni tra i principali meccanismi di catalisi enzimatica:
•acido base
•covalente
•elettrostatica e da ione metallico
Effetto del mezzo sulla velocità delle reazioni catalizzate
da enzimi: temperatura, forza ionica e pH
Le proteine, quindi anche gli enzimi, hanno
conformazioni 3D complesse strettamente legate
alla loro funzionalità: le strutture secondaria e
terziaria sono dovute ad interazioni deboli tra
atomi coinvolti nel legame peptidico e tra i gruppi
–R degli AA costituenti ( idrofobiche,
elettrostatiche, legami idrogeno, forze van Der
Waals), in relazione al mezzo acquoso e
all’ambiente.
Vengono studiate le interazioni
tra enzimi, proteine, e il mezzo.
Queste interazioni stabilizzano o meno
la struttura dell’enzima in studio, influenzando
la catalisi.
Temperatura
Forza ionica
pH
Saggio enzimatico in vitro: concentrazioni di sali e pH del tampone di dosaggio;
temperatura di dosaggio – parametri che devono essere standardizzati.
TEMPERATURA E VELOCITA’ ENZIMATICA
In tutte le reazioni chimiche, cinetica di reazione e temperatura sono strettamente
collegate: aumento di T
aumento di velocità di reazione.
In termini probabilistici, incrementi di T aumentano i moti delle particelle, le collisioni
e urti “utili” per abbassare l’E att. e favorire lo stato di transizione della reazione
chimica: questo è valido anche per le reazioni catalizzate dagli enzimi.
Secondo la reazione di Arrhenius:
E*: 1,7-70 Kj M-1
K2 = A2e-Ea2/RT
E sat.
K = Ae-E*/RT
Q10 ≈ 2
In concomitanza: T oltre una certa soglia
denaturano la proteina dotata di attività
enzimatica – diminuzione delle U enz.
A temp. > 40-50°C - drastica riduzione.
50 °C
Esistono enzimi più o meno stabili alle
alte temperature:
isoenzimi termostabili e termolabili;
enzimi che sono stabili a 80-100°C
(Taq polimerasi);
a T <10°C, attività molto rallentata
dipende dalla struttura
specifica delle proteine
enzimatiche
SALI E VELOCITA’ ENZIMATICA
In generale: effetto simile a quello dato dalla concentrazione di sali sulle macromolecole
biologiche e, in particolare, le proteine: la solubilità di una proteina a bassa forza ionica
aumenta con l’aumentare della forza ionica (salting in) . Ad alta forza ionica, la proteina
precipita, si separa dal mezzo acquoso (salting out).
Forza ionica, I = ½  cizi2
-Gli ioni dei sali sciolti in una soluzione acquosa interferiscono con i legami a
idrogeno tra H2O (mezzo acquoso) e proteine : modificano le interazioni intramolecolari che stabilizzano le proteine, quindi la loro conformazione e/o solubilità:
-Ioni “cosmotropici” o stabilizzanti (Cl-, Br-):
aumentano e stabilizzano le interazioni H2O-enzima;
aumentano la solubilità nel mezzo acquoso.
Ad alte concentrazioni ammonio solfato, salting-out,
proteine non denaturate. Effetti relativi che
dipendono dal tipo di sale (specie ionica) , dal tipo di
proteina- principio base della precipitazione frazionata
-Ioni “chaotropici” o denaturanti (ClO4-; SCN-):
alterano le interazioni H2O-enzima (proteina) sottraggono H2O
all’enzima e quindi ne diminuiscono la solubilità ma ne alterano
anche la conformazione 3D (denaturanti).
pH E VELOCITA’ ENZIMATICA
La [H+] può influire significativamente sulla catalisi enzimatica.
Un enzima proteico è suscettibile sia ai cambiamenti conformazionali legati al grado di ionizzazione
e carica, a diversi pH, dei gruppi –R ionizzabili degli AA che lo compongono sia al grado di protonazione di
gruppi –R ionizzabili presenti sul sito attivo e determinanti per la catalisi enzimatica.
A pH estremi le proteine perdono la conformazione 3D , precipitano e quindi molti enzimi si denaturano.
Esempio: Se un enzima esplica la sua azione catalitica grazie alla presenza di un’ istidina e di una
Lisina nel sito attivo svolgendo un attacco nucleofilo sul substrato in trasformazione oppure se un
altro enzima trasforma S in P mediante un’interazione di tipo elettrostatico attraverso un aspartato o
una lisina, opportunamente dislocati sul sito attivo, comprendiamo subito che il grado di protonazione dei
gruppi in gioco alterano la catalisi: esisteranno solo stretti intervalli di pH per permettere l’interazione ES
ottimale. Forma attiva dell’enzima a intervalli di pH che vengono definiti sperimentalmente.
Esistono intervalli di pH ottimale. Il pH influenza i parametri cinetici Vmax e Km dell’enzima e
può variare anche lo stato di ionizzazione del substrato S e di eventuali coenzimi.
Intorno di pH di
massima attività
enzimatica
Da: www.vi.cl
Effetto del pH del mezzo sulla velocità di alcuni enzimi
pH e velocità enzimatica
colinesterasi
Velocità iniziale
Velocità iniziale
chimotripsina
pepsina
papaina
Struttura, meccanismo di catalisi e dipendenza
dal pH dell’Adenosina Deaminasi (ADA)
La reazione catalizzata dalle adenosina aminoidrolasi
è stata trovata sia in organismi procariotici che eucariotici.
Nei mammiferi esistono due isoforme principali di ADA, ADA1
e ADA2.
ADA1 è legata alla regolazione della risposta immunitaria e
alla patogenesi della SCID. Altre patologie sono state
associate sia al deficit che alla sovra-espressione di ADA.
Struttura:
Metalloproteina, con un atomo di Zn come cofattore, legato al sito
catalitico. Struttura conservata nell’evoluzione. L’ADA umana
è una proteina globulare,con peso molecolare in media circa 40,000
Da, con struttura a/b, detta a barile, tipica anche di altre idrolasi,
il sito attivo è una tasca centrale, in corrispondenza del
tratto C-terminale dei foglietti b.
Catalisi:
pH ottimale ADA
Nel sito catalitico dell’ADA sono stati individuati alcuni gruppi
-R di AA critici e probabilmente coinvolti nella catalisi enzimatica:
Asp295, Asp296, Glu217, Hys238, Gly184 (Wilson et al. 1991).
Effetto del pH:
Esistono varie isoforme e proteine in diversi organismi; l’ADA ha un pH
ottimale tra circa 6.8-7.8. Questo è dovuto alla ionizzazione di gruppi
-R di AA favorente la catalisi. Agli estremi di pH si ha denaturazione e
perdita di attività completa per alterazione dei legami deboli e attrazioni
ioniche che stabilizzano la struttura 3D dell’enzima.
Riepilogo Esercitazioni Enzimi
Saggio enzimatico in condizioni saturanti della LDH in surnatante di omogenato
di tessuto muscolare e in siero (confronto):
Valutazione della concentrazione di LDH serica e muscolare, UE/ml nei due campioni
a confronto. (UE/100 ml) – UI: UE/lt.
Substrato: sodio piruvato
Coenzima : NADH
Tampone fosfato pH 7, temperatura e forza ionica costanti;
Enzima a concentrazione costante, campione diluito opportunamente. Lettura 340nm
(NADH) per 2 min, calcolo ΔA/min e UE per volume. Att. Specifica: UE/mg proteine totali
Determinazione dei parametri cinetici Km e Vmax dell’enzima ADA:
Calcolo della V0 a varie concentrazioni di S (adenosina) sia al di sotto che al di sopra della
Km attesa.
S (adenosina) a concentrazioni crescenti: 5, 10, 20, 40, 60, 80 mM.
Tampone fosfato pH 7, temperatura e forza ionica costanti;
Enzima alla stessa concentrazione in tutto il dosaggio: costante. Lettura 265nm (adenosina,
no inosina).
Dipendenza dal pH della V0 dell’ADA:
Calcolo della V0 a pH variabile nel mezzo.
Substrato a concentrazione costante S ≈ Km, 40 mM; V0= Vmax/2
Tampone fosfato a pH variabile: pH 5, 6, 7, 8, 9, 10.
Temperatura e forza ionica costanti;
Enzima a concentrazione costante. Lettura 265 nm (adenosina, no inosina).