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Antonio Siccardi 2004, Swimming Anita
Swimming Anita (Siccardi, 2002)
50x70 cm; de-collage on alluminum
22-­‐25 se'embre 2014 Biotecnologie Mediche: la Terapia Genica Antonio Siccardi Università degli Studi di Milano ①  Individuazione del difetto genetico
②  Studio della fisiopatologia, ovvero del funzionamento del
gene normale e delle conseguenze delle sue alterazioni
③  Costruzione di modelli animali
trattamenti farmacologici
(efficaci, non risolutivi)
terapia genica
(risolutiva)
G
chr12
Gene normale
A
chr12
Gene mutante
A
chr12
Gene mutante
chr12
Gene normale
riparato
Mutazione G->A
G
ricombinazione
omologa
G
DNA
selezione
La ricombinazione omologa viene
già utilizzata per ottenere
animali geneticamente modificati
(knock-out, knock-in,
transgenici), in cui viene
modificata una cellula staminale
embrionale (ES) amplificabile e
selezionabile in vitro prima di
essere reimpiantata in utero in
una blastocisti.
La ricombinazione omologa non è stata per ora utilizzabile per la
terapia genica dell uomo, in cui le cellule da modificare sono
ragionevolmente solo cellule somatiche.
Il motivo è che la ricombinazione omologa è un fenomeno molto raro,
con passaggi in coltura di selezione e clonazione delle cellule
geneticamente modificate, non attuabili nel setting clinico, in cui
bisogna modificare geneticamente molte cellule bersaglio allo stesso
tempo. Questo è ottenibile solo con vettori virali.
Per la terapia genica nell’uomo, il gene “sano”, detto transgene,
deve essere espresso nel numero maggiore possibile di cellule
bersaglio e pertanto trasportato da un vettore molto efficente,
quale un vettore retrovirale
ψ
LTR
CMV
transgene X
LTR
Plasmide di espressione
Nel caso dei vettori retrovirali, i più usati, il transgene (con un
opportuno promotore per la trascrizione) viene clonato in un plasmide
che, di virale, contiene solo le regioni LTR (necessarie per la
retrotrascrizione e per l integrazione nel DNA della cellula bersaglio)
e la regione psi (necessaria per l incapsidamento nel virione).
Tutte le altre funzioni virali, necessarie alla produzione di virioni,
sono codificate da altri plasmidi nella cellula packaging.
Questa precauzione evita la possibilità di ricostituire un virus infettivo.
La cellula packaging viene trasfettata con 3 differenti plasmidi.
CMV
GAG
POL
PolyA
1.Plasmide di Packaging (geni virali)
CMV
VSV-G
PolyA
2. Plasmide per l Envelope di VSV che si lega a un fosfolipide
presente su tutte le memmbrane cellulari (geni virali)
ψ
LTR
CMV
transgene X
LTR
3. Plasmide di espressione (nessun gene virale)
e produce virioni vettori (pseudovirioni) completamente difettivi
LTR
ψ
CMV
transgene X
LTR
RNA nei virioni vettori
I virioni vettori trasportano nelle cellule bersaglio
il transgene e le proteine necessarie per la sua
retrotrascrizione e integrazione nel DNA della
cellula bersaglio. Non contengono alcun gene virale.
vettore
Infezione
Integrazione
cromosoma
LTR
ψ
CMV
Transgene X
LTR
Non si ottiene la sostituzione del gene mutante con quello
sano, ma l aggiunta del gene sano a quello mutante,
in molteplici copie che si integrano nel genoma casualmente,
cioè in un contesto differente da quello originale.
Il gene mutante è situato
sul cromosoma 12.
Dopo terapia genica con un
vettore retrovirale,
numerose copie del
transgene saranno inserite
in più cromosomi
(diversi per ogni cellula
transfettata).
Applicabile solo a geni che non richiedano una regolazione
fine:
 della quantità di proteina (e.g. non applicabile alle
catene della emoglobina)
 della localizzazione cellulare o tissutale (e.g. non
applicabile a fattori di trascrizione)
Applicabile solo a geni di dimensioni compatibili con la
capacità di trasporto del vettore (e.g. non applicabile al
gene distrofina, che è gigantesco)
Prima della terapia
F VIII
Tempo di
Coagulazione
0%
17
Tempo di
Sanguinamento
11
4 mesi post-terapia
F VIII
Tempo di
Coagulazione
13%
4 40
Tempo di
Sanguinamento
4
Strategie di terapia genica
Approccio ex vivo
vettore
Approccio in vivo
Reinfusione di
cellule
transfettate
vettore
- sistemico
- in situ
Prelievo
di cellule
Qui la ricerca di terapia genica si
interfaccia con la ricerca sulle
cellule staminali.
L approccio di terapia genica
ex-vivo ha maggiori probabilità
di successo se le cellule
prelevate e ingenierizzate
in vitro sono cellule staminali,
capaci di proliferazione allo
stato indifferenziato e poi di
differenziamento terminale.
Dal midollo osseo adulto,
si possono derivare
molti tipi di cellule staminali,
non solo quelle della linea
ematopoietica.
Proliferando in vitro allo stato
indifferenziato, le cellule
staminali di un soggetto con
una malattia genetica possono
essere modificate
geneticamente, cioè
transfettate con il gene sano.
Photo courtesy of Van de Silva
Ashanti de Silva
SCID-ADA -1990
Ryes Evans
X-SCID - 2001
Per la terapia genica ex vivo della ADA-SCID,
il gruppo del TIGET-HSR di Milano (Bordignon,
Aiuti et al.) è stato all avanguardia nel mondo.
- Trasfezione di stem cell ematopoietiche (HSC)
- Conditioning non-mieloablativo con Busulfan
- Trapianto di HSC ADA+ selezionate
- Nessun trattamento palliativo con PEG-ADA
In 6 mesi, ricostituzione immune
Cellule T >>>>>>>>>>>> 100% ADA+
Cellule mieloidi >>>>> 15% ADA+
Aiuti et al. Science 296:2410-2413, 2002
La dimostrazione che l integrazione è avvenuta
nelle cellule staminali emopoietiche (HSC)
consiste nel dimostrare che lo stesso evento di
integrazione è presente in tutte le linee di cellule
ematiche. Per fare questo bisogna preparare
primers per la PCR specifici per un particolare
evento di integrazione, e usarli per monitorare la
presenza della stessa integrazione nelle cellule
del sangue, a distanza di tempo.
La stessa integrazione è stata dimostrata in cellule T,
cellule B, granulociti, etc., indicando che un precursore
comune era stato trasfettato e poi si è differenziato nei
vari tipi cellulari
Terapia
genica
7
9
12
mesi
Pt3
T cells
Gran
T cells
Gran
B cells
Erythr
Integrantspecific PCR
Aiuti et al., 2002
Terapia genica ex vivo della X-SCID
Alain Fischer, Hopital Necker, Parigi - 2000
- Trasfezione di stem cell ematopoietiche (HSC)
- Trapianto di HSC γc+ selezionate
- 10 pazienti
In 6 mesi, ricostituzione immune
Ricostituzione di cellule T, B e NK
Guarigione clinica
Terapia genica ex vivo della X-SCID
Alain Fischer, Hopital Necker, Parigi - 2000
Due bambini su 10 hanno sviluppato una forma di
leucemia di tipo T.
In entrambi è stata ritrovata una integrazione nelle
vicinanze dell oncogene LOM-2 (coinvolto nella
regolazione della divisione cellulare).
Entrambi i bambini sono guariti dopo chemioterapia.
Questo evento (2000),
insieme alla morte di Jesse
Gelsinger (1999), un ragazzo
di Philadelphia affetto da
deficenza di ornitinatranscarbamilasi e trattato
con un vettore adenovirale,
hanno causato un blocco a
livello mondiale della
sperimentazione clinica della
terapia genica per quasi 10
anni, in attesa che
appropriate misure di
sicurezza fossero
individuate e attuate.
L’analisi approfondita dei siti di inserzione degli LTR
dei retrovirus (RV) e dei lentivirus (LV) nel genoma
umano ha dimostrato profonde differenze: i secondi
sono molto più sicuri e inducono attivazione di
oncogeni con frequenza molto minore. Tale
attivazione, dovura alla attività dell’enhancer e del
promotore virali (situati in nella regione U3
dell’LTR-5’) può essere ulteriormente ridotta
utilizzando vettori LV auto-inattivanti, che eliminano
tali sequenze.
Per la trascrizione del transgene si usa poi un
promotore interno più debole e sequenze di
terminazione che minimizzano l’overflow della
trascrizione ai geni vicini.
I ve'ori auto-­‐ina6van7 (SIN) Negli LTR virali normali, la regione U3
contiene promotore ed enhancer.
Durante la RT la regione U3 al 5’ viene
copiata dalla regione U3 al 3’ (che era
identica a quella al 5’ originale).
Negli LTR del vettore SIN, la regione U3
al 5’ contiene promotore ed enhancer,
mentre quella al 3’ è mutata e non contiene
ne’ promotore ne’ enhancer.
Durante la RT la regione U3 al 5’ viene
copiata dalla regione U3 al 3’ (che è mutata).
La copia integrata quindi non può più essere
trascritta per intero. Solo il GOI viene
trascritto da un promotore interno.
LENTIVIRAL HEMATOPOIETIC STEM CELL GENE THERAPY IN PATIENTS WITH WISKOTT-­‐ALDRICH SYNDROME AiuJ et al. Science 23 August 2013: Vol. 341 no. 6148 1233151 DOI:10.1126/science.1233151 LENTIVIRAL HEMATOPOIETIC STEM CELL GENE THERAPY BENEFITS METACHROMATIC LEUKODYSTROPHY Biffi et al. Science 23 August 2013: Vol. 341 no. 6148 1233158 DOI:10.1126/science.1233158 L espressione dei transgeni è limitata nel tempo,
perchè subentra una risposta immunitaria transgenespecifica (CTL contro il prodotto del transgene,
anche se è self ).
Naldini e coll. (TIGET-HSR) hanno dimostrato che la
risposta immunitaria è dovuta all espressione del
transgene da parte delle antigen-presenting cells
(APC, monociti-macrofagi e cellule dendritiche).
Qui la ricerca sulla
terapia genica si
interfaccia con un
altro campo della
ricerca a sviluppo
esplosivo, quello della
funzione dei piccoli
RNA nella regolazione
della traduzione.
He L, Hannon GJ. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.
Nat Rev Genet. 5:522-31, 2004.
He L, Hannon GJ. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.
Nat Rev Genet. 5:522-31, 2004.
I miRNA si legano alla estremità 3 -non tradotta (UTR) dei messaggeri e
bloccano l attività del ribosoma con un meccanismo ancora non compreso.
Molti miRNA diversi possono legare lo stesso messaggero. Lo stesso miRNA
può legare molti (>50) messaggeri diversi.
Un esempio eclatante:
il miRNA let-7 blocca la traduzione
del messaggero dell oncogene RAS
facendo revertire il fenotipo
tumorale
Per evitare la risposta immune contro il transgene, bisogna
bloccarne l’espressione nelle cellule che presentano l’antigene
(APC), Naldini e coll. (TIGET-HSR, Milano) hanno introdotto
nella estremità 3’ non tradotta del transgene la sequenzabersaglio di un miRNA che si esprime nelle APC
(e non in altre cellule, quali gli epatociti).
L RNA messaggero del transgene contiene quindi la sequenzabersaglio di un miRNA-APC e viene silenziato nelle APC e non negli
epatociti.
miRNA-APC
AAAAAAA
CAP
AAAAAAA
CAP
RISC
PROTEINA
epatocita
PROTEINA
APC
Questo permette al transgene di evadere la risposta immune
e di essere espresso indefinitamente nelle cellule epatiche.
  Chilomicronemia (Iperlipoproteinemia tipo Ia) = carenza dell’enzima
lipoproteina lipasi. Terapia: Glybera, l’unica terapia genica approvata dalla
Commissione Europea e in vendita sul mercato. Decine di casi guariti.
  ADA-SCID (carenza di adenosina-deaminasi. Causa Immunodeficenza grave).
Terapia ex-vivo su HSC con LV esprimenti ADA. Circa 20 casi guariti.
  X-SCID (difetto della catena γ di alcuni recettori per le interleuchine. Causa
Immunodeficenza grave). Terapia ex-vivo su HSC con LV esprimenti catena
γ. 10/10 casi guariti. 2 bambini sviluppano leucemia relata all’oncogene
LOM-2.
  Sindrome di Wiskott-Aldrich (difetto di WASP, proteina regolatrice del
citoscheletro. Causa Immunodeficenza grave). Terapia ex-vivo su HSC con LV
esprimenti WASP. 3/3 casi guariti.
  Leucodistrofia metacromatica ( difetto di ARSA, aril-sulfatasi A; gli
accumuli lisosomiali causano difetti motori e cognitivi). Terapia ex-vivo su
HSC con LV esprimenti ARSA. 3/3 casi guariti.
  Coroideremia (altra malattia degenerativa della retina). Somministrazione
intraoculare di vettori virali con il transgene REP1 (6/9 pazienti migliorano
la capacità visiva).
  Adrenoleucodistrofia (la malattia dell’”Olio di Lorenzo”, dovuta a un difetto
del gene X-ALD). Causa la distruzione progressiva della mielina, la sostanza
che riveste le cellule nervose, e delle ghiandole surrenali con la
conseguente carenza di alcuni ormoni. Terapia ex-vivo su HSC con LV
esprimenti ALD.
  Emofilia B (fattore IX). Somministrazione intraepatica (la maggior parte
dei pazienti presenta sanguinamenti più rari e contenibili).
  CGD. Malattia Granulomatosa Cronica. La terapia genica ex-vivo di
HSC seguita da trapianto è efficace solo se le cellule esprimenti il
transgene hanno un vantaggio selettivo (ADA-SCID, X-SCID) ma
questo non è il caso del CGD (carenza di NADPH ossidasi nei
granulociti) che ha dato risultati inizialmente positivi, ma solo
transitori.
  Parkinson. Cellule incapaci di produrre dopamina riacquistano tale
capacità dopo infezione con RV che producono 3 enzimi (tutti pazienti
di un piccolo gruppo riacquisiscono controllo muscolare).
  Leucemia. Terapia ex-vivo di linfociti che vengono resi specifici per un
antigene tumore-associato (26/59 in completa remissione).
  AIDS. CD4 autologhe infettate con VRX496 (codificante un RNA
antisenso anti-env). 5/5 pazienti mostrano ridotte cariche virali e
miglior risposte immuni anti HIV.
Bibliografia essenziale: http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_therapy
Ritorniamo al
G
chr12
Gene normale
A
chr12
Gene mutante
A
chr12
Gene mutante
chr12
Gene normale
riparato
Mutazione G->A
G
ricombinazione
omologa
G
Nucleasi Cas9
Nucleasi Cas9
RNA guida
N C C cromosoma
L’ RNA guida contiene al 5’ 20 basi omologhe al DNA bersaglio.
La Nucleasi Cas9 viene posizionata sulla sequenza bersaglio dall’RNA guida
e introduce un taglio a doppia elica a monte della sequenza PAM (= NGG)
Nucleasi Cas9
Nucleasi Cas9
RNA guida
N C C Sequenza variabile
gene bersaglio-specifica
sintetizzata ad hoc
Sequenza costante
gRNA Scaffold
cromosoma
L’ RNA guida contiene al 5’ 20 basi omologhe al DNA bersaglio.
a Nucleasi Cas9 viene posizionata sulla sequenza bersaglio dall’RNA guida
introduce un taglio a doppia elica a monte della sequenza PAM (= NGG)
Gene della Nucleasi Cas9
PAM = sequenza adiacente
al sito di taglio
gRNA = RNA guida
DSB = Rotture a doppia elica
NHEJ = riunione non omologa di estremità (causa delezioni)
HR = Ricombinazione Omologa (ricostituzione del genotipo wt,
oppure inserzione controllata di sequenze desiderate)
PAM = sequenza adiacente
al sito di taglio
gRNA = RNA guida
DSB = Rotture a doppia elica
NHEJ = Riunione non omologa di estremità
(causa delezioni e inattivazione del gene)
PAM = sequenza adiacente
al sito di taglio
gRNA = RNA guida
(sequenza wt)
HR = Ricombinazione Omologa >> ricostituzione del genotipo wt
In alternativa, si possono costruire altri genotipi mutanti,
oppure inserire sequenze marker
(e.g. di geni di resistenza o di proteine fluorescenti )
Riparazione in situ del gene mutante
A
chr12
Gene mutante
chr12
Gene normale
riparato
G
ricombinazione
omologa
G
La tecnologia CRISP-R / Cas9 permette di affrontare la terapia
genica di tutte quelle malattie per le quali era impensabile utilizzate i
vettori virali, che aggiungono il gene sano senza riparare quello
mutato e che non consentono la fisiologica regolazione della attività
del gene, attuabile solo nel contesto genomico naturale
Malattie per le quali è impensabile utilizzare vettori virali
Che cosa manca alla applicazione clinica della nuova tecnologia?
Le localizzazioni dell’RNA guida (e quindi della Nucleasi Cas9) non
sono ancora totalmente controllabili: seppur raramente, avvengono
appaiamenti e tagli a doppia elica anche in altre regioni del DNA,
anche non completamente omologhe.
La tecnologia deve essere raffinata, per ridurre le localizzazioni
aspecifiche o renderle innocue facendo suicidare le cellule in cui
queste avvengano.
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Antonio Siccardi, 2009 Dance for all (Berlin)