Applicazioni genetica umana e molecolare II parte
Dr. Stefania Gonfloni
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Studio 4319
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI
Principi e tecniche
Terry A. Brown
BIOTECNOLOGIA MOLECOLARE
Principi e applicazioni del DNA ricombinante
Bernard R. Glick Jack J.Pasternak
GENETICA UMANA E MOLECOLARE
Stracan T. Read A.P.
Che cos’è la clonazione dei geni?
1. Frammento di DNA con il gene da clonare viene inserito in un
Vettore
2. Il vettore trasporta il gene all’interno della cellula ospite
3. Il vettore si moltiplica all’interno della cellula ospite producendo
numerose copie uguali non solo a se stesso ma anche del gene che
trasporta
4. Quando la cellula ospite si divie, alla progenie vengono passate
copie della molecola di DNA ricombinante ed il vettore si
moltiplica ulteriormente
5. Dopo un grande numero di divisioni cellulari, si produce una
colonia, o clone costituita da cellule identiche.
La PCR
Espressione genica
con promotori forti
e regolabili
Vettori per l’espressione dei geni
ptac: ibrido funzionale dai promotori trp (-35) e lac (-10)
Integrazione del gene
clonato nel sito
cromosomico
b. subtilis
Vettore di espressione
eucariotico
p:unità di trascrizione eucariotica
Metodo per ottenere sequenze di cDNA a lunghezza completa
Saggio di protezione dalla nucleasi S1
SAGE
Screening multiplo dell’espressione genica
Immunoblotting
(Western blotting)
Immunocitochimica
Espressione della -tubulina in un
cervello di un embrione di topo
di 12, 5 giorni
Immunofluorescenza
Proteina a fluorescenza verde come
etichetta fornisce un modo utile per
seguire l’espressione delle proteine
Identificazione di sequenze di regolazione mediante l’uso di geni
Indicatori e le interazioni tra DNA e proteine
Analisi delle delezioni nella regionie promotore del gene umano per
Il fattore VIII
Footprinting mediante DnasiI
Saggio di ritardo nel gel
I sistemi
“a doppio ibrido”
e a “singolo ibrido”
in lievito
Phage display
Preparazione di topi transgenici mediante microiniezione nei
pronuclei
La mutagenesi mirata mediante ricombinazione omologa puo’
inattivare un predeterminato gene cromosomico all’interno
di una cellula integra
“Hit and run”
La mutagenesi mirata con doppia sostituzione può essere usata
per introdurre nel DNA piccole mutazioni
“Tag and exchange”
Il metodo knock-in consente di sostituire l’attività di un gene di un
dato cromosoma con quella di un altro gene appositamente introdotto
Struttura della sequenza di riconoscimento di loxP
Gene trapping
Clonazione animale