CRYOPEP
3015120-013 06/2010
TECHNOZYM® vWF:CBA ELISA
GB
IT
PT
DE
ES
FR
REF
5450301
TECHNOZYM® vWF:CBA ELISA
REF
5450310
TECHNOZYM® vWF:CBA Calibration Set
5 x 0.5 mL
REF
5450312
TECHNOZYM® vWF:CBA Control Set
2 x 0.5 mL
symbols key / Symbolschlüssel / interpretazione dei simboli / explicación de símbolos /
explicação dos símbolos / clé des symboles
AQUA
manufactured by / Hergestellt von / prodotto da / fabricado por / fabricado por
/ fabriqué par
DIL
dilute or disolve in / verdünnen oder lösen in / a diluire o a sciogliere in / diluir o
disolver / diluir ou dissolver em / à diluer ou à dissoudre
expiry date / Verfallsdatum / data di scadenza / fecha de caducidad / data de
validade / date d´expiration
IVD
in vitro diagnostic use / in vitro Diagnostikum / diagnostico in vitro /
diagnóstico en vitro / diagnóstico in vitro / diagnostique in vitro
storage temperature / Lagertemperatur / temperatura di conservazione /
temperatura de conservación / temperatura de conservação / température de
conservation
LOT
lot / Charge / lotto / lote / lote / lot
consult instructions for use / Gebrauchsanweisung beachten / consultare le
istruzioni per l'uso / consulte las instrucciones de uso / consultar o manual de
instruções / consulter la notice d´utilisation
MTP
microtiter plate / Mikrotiterplatte / piasta nicrotitolo / placa de microtitulación /
placa do microtitre / Microplaques sensibilisèes
CE-mark / CE-Zeichen / marchio di CE / marca de CE / Símbolo da CE /
marquage CE
REF
catalogue number / Katalognummer / numero di catalogo / numéro de catálogo
/ número de referência / référence
determinations / Bestimmungen / determinazioni / determinaciones /
determinações / déterminations
RTU
ready to use / gebrauchsfertig / pronto all’uso / listo para usarlo / pronto para
uso / Prêt à l´emploi
distilled water / destilliertes Wasser / acqua distillata / agua destilada / agua
destilada / eau distillée
SUB
substrate / Substrat / substrato / substrato/ carcaça / substrat
CAL
calibrator / Kalibrator / calibratore / calibrador / calibrador / calibrateur
STOP
stop solution / Stopplösung / Soluzione di arresto / solución Stopp / Solução
interruptora / Solution d´árrêt
CONJ
conjugate / Konjugat / Coniugato / conjugado / Conjugado / Conjugate
WASH
washing solution concentrate / Waschlösungskonzentrat / concentrado de
solución de lavado
CONT
control / Kontrolle / controllo / control / controle / contrôle
Technoclone GmbH
Brunner Str. 59/5
1230 Vienna, Austria
www.technoclone.com
Distributeur en France : CRYOPEP 83, rue Yves Montand, 34080 Montpellier Tel: 04 67 13 21 00
CRYOPEP
GB
TECHNOZYM® vWF:CBA ELISA
PRODUCT DESCRIPTION
For 8 test wells: Mix 20 µL conjugate with 1000 µL incubation buffer.
INTENDED USE
The von Willebrand Factor (vWF) is a large, multifunctional glycoprotein, occupying a key
position in primary haemostasis. It has a multiple structure with several functions:
• It is the carrier protein for Factor VIII in plasma; it forms a complex
and thus protects Factor VIII from early proteolytic decomposition.
• It acts as a mediator for platelet aggregation by attaching itself to platelet membrane
receptors (GP Ib and GP lIb/IIIa) following previous platelet activation.
• It plays a part in primary haemostasis by acting as a mediator between adhesioned platelets
and the subendothelium (lesioned vascular wall).
In order to analyze the adhesive properties, as a rule the platelet aggregation is measured
(measuring system = ristocetin-dependent platelet aggregation).
However, this does not reflect the physiological setting nor the function of the vWF. For
determining the adhesive properties of the vWF, its binding capacity to collagen serves as a
parameter which corresponds to the physiological function of the vWF
COMPOSITION
1. ELISA test strips (12) with 8 wells each, coated with human collagen Typ III; the drying
agent is supplied in an aluminium bag.
2. Washing buffer concentrate: (PBS; pH 7.3); containing detergent; 0.01% merthiolate; 1
bottle, 100 mL.
3. Incubation buffer: (PBS; pH 7.3); contains stabiliser protein; 0.05% proclin; and dye 1
bottle, 100 mL, ready for use.
4. Calibrators (Standards) numbered; lyophilised; 1 bottle each.
Concentrations are lot-dependent; consult label on the vial.
5. Control plasmas "low level" and "high level" for checking purposes, lyophilised; 1 bottle
each. Concentrations are lot-dependent; consult the label on the vial.
6. Conjugate polyclonal Anti-vWF-POX; dyed blue; 1 bottle, 0.3 mL.
7. Chromogen TMB (tetramethylbenzidine); 1 bottle, 12 mL; ready to use.
8. Stopping solution: sulphuric acid 0.45 mol/L; 1 bottle 12 mL; ready for use.
9. Adhesive film: for ELISA test strips (2).
MATERIAL REQUIRED (but not supplied with the kit)
Distilled water
Test tubes for diluting standard and samples
Measuring cylinder (1000 mL)
Precision pipettes (10, 100 and 1000 µL)
Variable pipette (1000 µl)
Multichannel and/or dispensing pipettes (100 and 200 µL)
ELISA washer or multichannel pipette
ELISA reader with 450 nm filter, with a 620 nm reference filter if available.
WARNING AND PRECAUTIONS
- All human blood or plasma products as well as samples must be considered as potentially
-
infectious. They have to be handled with appropriate care and in strict observance of safety
regulations. The rules pertaining to disposal are the same as applied to disposing hospital
waste.
Calibrators and control plasmas are made from human blood and any individual plasma
involved in the procedure is HBsAg, HIV 1/2 Ab and HCV-Ab-negative (see labels on kit
and/or bottles).
Stopping solution (sulphuric acid) may irritate the skin. Should acid get into your eyes,
wash out immediately with water and consult a doctor.
The reagents sometimes contain preserving agents (merthiolate). Beware of swallowing!
Avoid contact with skin or mucous membranes
All components contained in the kit may be used until the expiry date as indicated. The bench
stability of the components after opening, reconstitution and/or dilution may be inferred from
the table below:
When necessary the samples, controls and calibrators can be frozen/thawed up to 5 times. But
making aliquots is recommended.
State
Calibrators, control
after reconstitution
plasmas
incubate at room temperature
45 minutes
washing buffer
3 x 200 µL
pipette conjugate working
solution into wells, cover test strip
with film
CONJUGATE REACTION
(reference 1,2)
WASHING (reference 1,3,4)
100 µL
incubate at room temperature
45 minutes
washing buffer
3 x 200 µL
pipette substrate solution
into test wells cover test strips
with film
SUBSTRATE
REACTION
(reference 1,2)
Incubate at room temperature
STOP SOLUTION (reference 1,2)
MEASURING (reference 5)
100 µL
15 minutes
pipette stopping solution into
wells
ELISA-Reader, 450 nm
100 µL
Shake 10 sec.,
Measure within
10 minutes
Room temperature is 20 ... 25°C
References
1. Reagents of different lots must not be combined
2. Precision and performance, among others, essentially depend on the following factors:
• Thorough mixing of all substances used for dilution
• Test calibrators, controls and samples in duplicates.
• Incubation to be done at correct temperatures
• Strict observance of the order of pipetting and of the time element as indicated:
• The time for sample incubation, conjugate and substrate reaction as indicated starts after
pipetting the last sample. Incubation times should not vary by more than ±10%.
• During sample incubation and conjugate reaction, the time for pipetting the diluted
calibrators/samples/control plasmas and/or conjugate solutions must not exceed 60
seconds per ELISA test strip (8 wells).
• During substrate reaction and at stopping, the time needed for pipetting the substrate
and/or the stopping solution must not exceed 10 seconds per ELISA test strip. Short
pipetting times may be secured by using multichannel- and dispensing pipettes.
3. Label/number strips with a water resistant pen in case the strips accidentally fall out of the
frame during testing.
4. After the last washing, wells must be aspirated thoroughly, turned upside down and
positioned on a blotting paper; by gentle tapping, the last remnants must be removed.
5. Measuring the difference in wave lengths at 450 and 620 nm or at 450 and 690 nm, the
precision of the test is increased.
Reduced levels of vWF:CBA are associated with blood group 0.
vWF:CBA is also affected by physical exercise, pregnancy, use of contraceptive pill, ethnic
group and the antigen increases with age.
ANALYSIS RESULTS
CALCULATION OF THE RESULTS
Stability
room temperature
-20°C
2 ... 8 °C with adhesive
film in plastic bag with
drying agent
8 hours
6 months
expiry date
• The extinction coefficient of the highest calibrator should be between 1.0 and 2.5.
• The validity of the test may be checked on the basis of the calculated control values.
Example of standard curve.
Setting up a reference curve:
X axis: Concentration vWF:CBA U/ml (1U/ml = 100%)
Y axis: Extinction
Graph plot is linear-linear with a point to point or cubic spline
Assessment of reference curve
after opening
Washing buffer
concentrate
after opening
2 ...8°C
6 months
Washing buffer
1+9 dilution of
concentrate
2 ... 8 °C
3 weeks
Incubation buffer
after opening
2 ... 8 °C
2 months
after opening
2 ... 8 °C
6 months
Chromogen TMB
100 µL
Storage
ELISA test strip
Conjugate
WASHING (reference 1,3,4)
diluted calibrators
diluted control plasmas
diluted samples into test wells.
cover test strips with film.
LIMITATION OF THE TEST
STABILITY AND STORAGE
Material/Reagent
SAMPLE INCUBATION
(reference 1, 2)
2,5
working solution
room temperature
60 minutes
after opening
2 ... 8 °C
expiry date
2
1,5
OD
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
PERFORMANCE OF THE TEST
1
0,5
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
vWF:CBA U/ml
TEST PROCEDURE
PREPARATION OF SAMPLES
Material: plasma
Obtaining plasma: mix 9 parts venous blood with 1 part sodium citrate solution (0.11 mol/L)
and centrifuge for 15 minutes at a minimum of 2500 g (DIN 58905). The plasma sample may
be stored for 3 hours at room temperature; otherwise the sample ought to be frozen
immediately after centrifugation. Stable at -20°C f or 6 months.
Measuring concentration of samples
• Read off the concentration from the reference curve.
• If there are samples with extinction coefficients higher than that of the highest point on the
curve, they have to be prediluted with incubation buffer (1+1). The measured concentration
then has to be multiplied with the dilution factor 2.
REFERENCE RANGE
PREPARATION OF REAGENT
Normal range for vWF:CBA is between 0,4 – 2,5 U/mL (40-250%) (Fig 1)
It is recommended that individual laboratories establish their own normal range.
1. Before starting the test, all the required components are to be brought to room
temperature.
2. Preparing the washing buffer: Dilute 1 part by volume washing buffer concentrate with 9
parts by volume distilled water (1+9). Mix well! (Diluted washing buffer concentrate =
washing buffer). There may be crystalline precipitations which will dissolve at 37°C within
10 minutes.
3. Reconstituting calibrators and control plasmas:
Calibrators and control plasmas are reconstituted with 500 µL distilled water and mixed for
10 seconds after a reconstitution time of 15 minutes (vortex mixer). Reconstituted
components are clear to slightly turbid.
4. Diluting calibrators, control plasmas and samples (1+25): Dilute 20 µL samples, 20 µL
calibrators and/or 20 µL controls with 500 µL each of incubation buffer. Mix for 10 seconds!
5. Preparing the conjugate working solution (1+50): Dilute 1 part by volume conjugate with 50
parts by volume incubation buffer:
STANDARDIZATION
The calibration material used is the WHO International standard for Blood coagulation Factor
VIII and von Willebrand factor in plasma (human)
LITERATURE
1) Blood 69; 1691 – 1695, 1987. The effect of ABO blood group on the diagnosis of vWD. Gill et al.
2) Thromb Haemost 2000; 83: 127 – 35. Collagen Binding Assay for von Willebrand Factor (VWF:CBA) Detection of VWD and discrimination
of VWD Subtypes, Depends on Collagen Source. E J Favaloro
3) Haemophilia (Suppl. 3), 1998, 15 – 24. The determination of von Willebrand factor activity by collagen binding assay. Siekmann et al.
Distributeur en France : CRYOPEP 83, rue Yves Montand, 34080 Montpellier Tel: 04 67 13 21 00
CRYOPEP
DE
®
TECHNOZYM vWF:CBA ELISA
PRODUKTBESCHREIBUNG
Für 8 Testvertiefungen: 20 µL Konjugat mit 1000 µL Inkubationspuffer mischen.
ANWENDUNG
Von Willebrand Faktor (vWF) ist ein großes, multifunktionelles Glykoprotein mit einer
Schlüsselstelle in der primären Hämostase. Er liegt in multimerer Struktur vor und hat mehrere
Funktionen:
• Er ist das Trägerprotein für Faktor VIII im Plasma; er bildet einen Komplex und schützt so
Faktor VIII vor vorzeitigem proteolytischem Abbau.
• Er vermittelt die Plättchenaggregation über die Anhaftung an Plättchenmembranrezeptoren (GP Ib GP IIb/IIIa) nach vorausgegangener Plättchenaktivierung.
• Er spielt eine Rolle bei der primären Hämostase durch Vermittlung
der Plättchenadhäsion an das Subendothel (verletzte Gefäßwand).
Bei der Charakterisierung der adhäsiven Eigenschaften wird üblicherweise die
Plättchenaggregation untersucht (Meßsystem = Ristocetinabhängige Plättchenaggregation).
Diese spiegelt jedoch nicht die physiologische Situation und Funktion des vWF wieder.
Zur Erfassung der adhäsiven Eigenschaften des vWF nutzt man die Bindung des vWF zu
Collagen. Die Bestimmung einer vWF-Collagen Bindung entspricht der physiologischen
Funktion des vWF.
TESTVERFAHREN
PROBENINKUBATION
(Hinweise 1,2)
Verdünnte Kalibratoren,
Kontrollplasmen, Proben in
Testvertiefungen pipettieren.
Teststreifen mit Folie abdecken
Bei Raumtemperatur inkubieren
WASCHEN (Hinweise 1,3,4)
Waschpuffer
KONJUGATREAKTION
(Hinweise 1,2)
Konjugatgebrauchslösung in
Testvertiefungen pipettieren.
Teststreifen mit Folie abdecken
Bei Raumtemperatur inkubieren
WASCHEN (Hinweise 1,3,4)
Waschpuffer
ZUSAMMENSETZUNG
1. ELISA-Teststreifen (12): mit jeweils 8 Testvertiefungen; beschichtet mit humanen-Collagen
Typ III; mit Trockenmittel im Aluminiumbeutel verpackt.
2. Waschpufferkonzentrat: (PBS;pH7,3); detergenshaltig; 0,01% Merthiolat; 1Flasche; 100 mL.
3. Inkubationspuffer: (PBS; pH 7,3); gefärbt enthält Stabilisatorprotein; 0,05% Proclin; 1
Flasche; 100 mL; gebrauchsfertig
4. Kalibratoren (Standards): Nummeriert; lyophilisiert; jeweils eine Flasche.
Die chargenabhängigen Konzentrationen entnehmen Sie bitte den Flaschenetiketten !
5. Kontrollplasmen “high level” und “low level”:zur Richtigkeitskontrolle; lyophilisiert; jeweils
eine Flasche.
Die chargenabhängigen Konzentrationen entnehmen Sie bitte den Flaschenetiketten !
6. Konjugat: Polyklonaler Anti-vWF-POX; blaugefärbt; 1 Flasche; 0,3 mL
7. Chromogenes Substrat: TMB (Tetramethylbenzidin) 1 Flasche, 12 mL, gebrauchsfertig
8. Stopplösung:Schwefelsäure 0,45 mol/L; 1 Flasche; 12 mL, gebrauchsfertig
9. Abklebefolien: für ELISA-Teststreifen, 2 Stück
BENÖTIGTES MATERIAL (nicht im Testkit enthalten)
1. Aqua dest
2. Röhrchen zur Verdünnung der Standards und Proben
3. Messzylinder (1000 mL)
4. Präzisionspipetten (10, 100 und 1000 µL)
5. Variable Pipette (1000µL)
6. Mehrkanal- bzw. Dispensierpipetten (100 und 200 µL)
7. ELISA-Waschgerät oder Mehrkanalpipette
8. ELISA-Reader mit 450 nm Filter (und 620 nm Referenzfilter falls verfügbar)
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN
- Alle humanen Blut- bzw. Plasmaprodukte und Proben müssen
-
als potentiell infektiös
angesehen werden. Sie sind mit der notwendigen Sorgfalt und entsprechend den
Sicherheitsvorschriften zu behandeln und wie Krankenhausmüll zu entsorgen. Die
Kalibratoren und Kontrollen, hergestellt aus humanem Blut, und jedes hierzu verwendete
Einzelplasma ist HbsAg, HIV Ak und HCV-Ak negativ (siehe Außen- bzw. Flaschenetikett).
Stopplösung (Schwefelsäure) kann zu Reizungen der Haut führen. Sollte Säure in die Augen
gelangen, sofort mit viel Wasser auswaschen und einen Arzt aufsuchen!
Die Reagenzien enthalten teilweise Konservierungsmittel (Merthiolat). Nicht schlucken! Hautoder Schleimhautkontakt vermeiden !
LAGERUNG UND STABILITÄT
Alle in der Packung enthaltenen Komponenten sind bis zum aufgedruckten Verfallsdatum
haltbar. Die Haltbarkeit der Komponenten nach Öffnung, Rekonstitution bzw. Verdünnung
können Sie der folgenden Tabelle entnehmen.
Falls nötig, können Proben, Kontrollen und Kalibratoren fünfmal eingefroren und wieder
aufgetaut werden, das Herstellen von geeigneten Aliquots ist jedoch empfehlenswerter.
Material/Reagenz
Kalibratoren,
Kontrollplasmen
ELISA-Teststreifen
Waschpuffer- Konzentrat
Waschpuffer
STOPPEN (Hinweis 1,2)
MESSEN (Hinweis 5)
45 Minuten
3x200 µL
100 µL
45 Minuten
3x200 µL
Substratlösung in
Testvertiefungen pipettieren
Teststreifen mit frischer Folie
abdecken
Bei Raumtemperatur inkubieren
Stopplösung in Testvertiefungen
pipettieren
SUBSTRATREAKTION
(Hinweis 1,2)
100 µL
100 µL
15 Minuten
100 µL
10 Sek. Schütteln,
Messung innerhalb
von 10 Minuten
ELISA-Reader, 450nm
Raumtemperatur: 20...25 °C
Hinweise
1. Reagenzien verschiedener Chargen dürfen nicht kombiniert werden.
2. Präzision und Wiederfindung hängen u.a. von folgenden Faktoren entscheidend ab:
• Gute Durchmischung aller Verdünnungsansätze, 10 Sek. Auf Probenmischer
• Durchführung von Doppelbestimmungen
• Inkubation bei der korrekten Temperatur
• Genaue Einhaltung von Pipettierreihenfolge und Zeittakt:
• Die angegebene Zeit für die Probeninkubation, Konjugat- und Substratreaktion wird nach
der Pipettierung der letzten Probe genommen. Inkubationszeiten sollten um nicht mehr als
± 10% variiert werden.
• Bei der Probeninkubation und Konjugatreaktion darf die Zeit für die Pipettierung der
verdünnten Kalibratoren/ Proben/ Kontrollplasmen bzw. Konjugat-Lösung 60 Sek. pro
ELISA-Teststreifen (8 Vertiefungen) nicht überschreiten.
• Bei der Substratreaktion und beim Stoppen darf die Pipettierzeit der Substrat- bzw.
Stopplösung 10 Sek. pro ELISA-Teststreifen nicht überschreiten. Kurze Pipettierzeiten
werden durch Verwendung von Mehrkanal- bzw. Dispensierpipetten erreicht.
3. Teststreifen mit wasserfestem Stift markieren, falls sie während des Testes versehentlich
aus der Halterung fallen sollten.
4. Nach dem letzten Waschvorgang müssen die Testvertiefungen leer gesaugt und auf
saugfähigem Papier ausgeklopft werden.
5. Durch Differenzwellenlängenmessung bei 450 nm und 620 nm (oder 690nm) wird die
Präzision des Tests erhöht.
EINSCHRÄNKUNG DER TESTDURCHFÜHRUNG
Verminderte Spiegel von vWF:CBA sind mit der Blutgruppe 0 vergesellschaftet.
vWF:CBA wird auch beeinflusst durch körperliche Arbeit, Schwangerschaft (durch orale
Kontrazeptiva), ethnische Zugehörigkeit und durch den altersbedingten Antigen Anstieg.
ANALYSENERGEBNISSE
Zustand
Lagerung
Stabilität
BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
nach
Rekonstitutionn
Raumtemperatur
-20°C
8 Stunden
6 Monate
nach Öffnen
2 ... 8 °C mit Abklebefolie in
Alubeutel mit Trockenmittel
Verfallsdatum
Erstellung der Bezugskurve: X-Achse: Konzentration vWF:CBA U/ml (1 U/mL = 100%)
Y-Achse: Extinktion
Bezugskurve ist linear-linear, Werte sind punkt zu punkt oder mit „ cubic spline“
Beurteilung der Bezugskurve
Die Extinktion des höchsten Kalibrators sollte zwischen 1,0 und 2,5 liegen.
Die Auswertbarkeit des Tests kann anhand der ermittelten Kontrollwerte überprüft werden
Beispiel einer Standardkurve:
nach Öffnen
2 ...8°C
6 Mona te
1+9 Verdünnung
des Konzentrats
2 ... 8 °C
3 Wochen
nach Öffnen
2 ... 8 °C
2 Monate
nach Öffnen
2 ... 8 °C
6 Monate
2,5
Inkubationspuffer
2
1,5
Gebrauchslösung
Raumtemperatur
60 Minuten
nach Öffnen
2 ... 8 °C
Verfallsdatum
OD
Konjugat
1
Chromogenes Substrat
0,5
0
TESTDURCHFÜHRUNG
VORBEREITUNG DER PLASMAPROBEN
Probenmaterial: Plasma
Plasmagewinnung: 9 Teile Venenblut mit 1 Teil Natriumcitratlösung (0,11 mol/L) mischen und
15 min bei einer RZB von mindestens 2500 zentrifugieren (DIN 58905). Die Plasmaprobe kann
3 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt werden, andernfalls sollte die Probe sofort nach
Zentrifugation eingefroren werden. Haltbarkeit –20°C: 6 Monate.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
vWF:CBA U/ml
Konzentrationsbestimmungen der Proben
•
•
Konzentrationen der Proben an der Bezugskurve ablesen.
Sollte der Extinktionswert einer Probe höher als der des höchsten Standards liegen, so
muss die Probe mit Inkubationspuffer vorverdünnt werden (1+1). Die ermittelte
Konzentration wird in diesem Fall mit dem Verdünnungsfaktor 2 multipliziert.
VORBEREITUNG DES REAGENZES
REFERENZBEREICHE
1. Vor Testbeginn alle benötigten Testkomponenten auf Raumtemperatur bringen.
2. Herstellen des Waschpuffers: 1 Volumenteil Waschpufferkonzentrat mit 9 Volumenteilen
Aqua dest. verdünnen (1+9). Gut mischen! (Verdünntes Waschpufferkonzentrat =
Waschpuffer). Eventuelle kristalline Niederschläge gehen bei 37°C innerhalb von 10 min in
Lösung.
3. Rekonstituieren der Kalibratoren und Kontrollplasmen: Die Kalibratoren und Kontrollplasmen
werden mit 500 µl Aqua dest. rekonstituiert und nach einer Rekonstitutionszeit von 15 Minuten
10 Sekunden gemischt (Probenmischer). Rekonstituierte Komponenten sind klar bis leicht trüb.
4. Verdünnen der Kalibratoren, Kontrollplasmen und der Proben (1+25): 20 µL Probe, 20 µL
Kalibratoren bzw. 20 µL Kontrollen jeweils mit 500 µL Inkubationspuffer verdünnen. 10
Sekunden mischen!
5. Herstellen der Konjugatgebrauchslösung (1+50): 1 Volumenteil Konjugat mit 50
Volumenteilen Inkubationspuffer verdünnen.
Der Normalbereich von vWF:CBA liegt zwischen 0,4 – 2,5 U/mL (40-250%) (Fig 1)
Es wird empfohlen, dass jedes Labor einen eigenen Normalbereich bestimmt.
STANDARDISIERUNG
Das verwendete Kalibrationsmaterial ist der WHO International Standard für den
Gerinnungsfaktor VIII und den vWF in humanem Plasma.
LITERATUR
1) Blood 69; 1691 – 1695, 1987. The effect of ABO blood group on the diagnosis of vWD. Gill et al.
2) Thromb Haemost 2000; 83: 127 – 35. Collagen Binding Assay for von Willebrand Factor (VWF:CBA) Detection of VWD and discrimination
of VWD Subtypes, Depends on Collagen Source. E J Favaloro
3) Haemophilia (Suppl. 3), 1998, 15 – 24. The determination of von Willebrand factor activity by collagen binding assay. Siekmann et al.
Distributeur en France : CRYOPEP 83, rue Yves Montand, 34080 Montpellier Tel: 04 67 13 21 00
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TECHNOZYM vWF:CBA ELISA
DESCRIZIONE DEL PRODOTTO
Per 8 pozzetti: miscelare 20 µL di coniugato con 1000 µL di tampone di
incubazione.
IMPIEGO
Il fattore di Von Willebrand (vWF) è una grossa glicoproteina multifunzionale che gioca un ruolo
chiave nella emostasi primaria. Si presenta a struttura multimerica e ricopre diverse funzioni:
• è la proteina vettrice del fattore VIII nel plasma; forma un complesso proteggendo in questo
modo il fattore VIII da una degradazione proteolitica precoce.
• fa da mediatore per l’aggregazione piastrinica attraverso l’adesione ai recettori di membrana
(GP Ib GP IIb/IIIa) in seguito a precedente attivazione piastrinica.
• gioca un ruolo importante nell’emostasi primaria facendo da mediatore
per l’adesione delle piastrine al sottoendotelio (parete vasale danneggiata).
Al fine di individuarne le proprietà adesive si testa comunemente l’aggregazione piastrinica
(esame = test aggregometrico). Questa, tuttavia, non riflette la situazione fisiologica e la
funzionalità del vWF.
E’ possibile determinare le proprietà adesive del vWF valutando la sua capacità di legarsi al
collagene. La determinazione di un legame vWF-collagene rispecchia la funzione fisiologica del
vWF.
PROCEDURA DEL TEST
COMPONENTI
1.Strip ELISA (12): con 8 pozzetti ciascuno; ricoperti di collagene umano del tipo III;
confezionati in bustine di alluminio con disseccante.
2. Tampone di lavaggio concentrato: (PBS; pH 7,3); contenente detergente; 0,01% mertiolato; 1
bottiglia; 100 mL.
3. Tampone di incubazione: (PBS; pH 7,3); di colorante, contiene proteina stabilizzante; 0,05%
proclina; 1 bottiglia; 100 mL; pronto all’uso.
4. Calibratori (Standards): numerati; liofilizzati;una bottiglia di ciascuno.
Le concentrazioni dipendono dai lotti: fare riferimento all'etichetta sulla bottiglia!
5. Plasmi di controllo “high level” e “low level”: per il controllo di accuratezza; liofilizzati; una
bottiglia di ciascuno.
Le concentrazioni dipendono dai lotti: fare riferimento all'etichetta sulla bottiglia!
6. Coniugato: anticorpi anti-vWF policlonali-POX (perossidasi); di colore azzurro; 1 bottiglia; 0,3
mL
7. Substrato cromogeno: TMB (tetrametilbenzidina) 1 bottiglia, 12 mL, pronto all’uso
8. Soluzione di arresto: acido solforico 0,45 mol/L; 1 bottiglia; 12 mL, pronta all’uso
9. Pellicola adesiva: per strip ELISA, 2 pezzi
MATERIALE NECESSARIO (non incluso nel kit)
AVVERTENZE E NORME DI SICUREZZA
- Tutti gli emoderivati di origine umana, così come i campioni,
devono essere considerati
potenzialmente infetti. Devono essere maneggiati con la cura necessaria ed in conformità alle
norme di sicurezza vigenti e smaltiti come rifiuti ospedalieri. I calibratori e i controlli, ricavati da
sangue umano, ed ogni singolo plasma utilizzato nel test sono HbsAg, HIV Ak e HCV-Ak
negativi (vedere etichetta esterna e sulla bottiglia)).
La soluzione di arresto (acido solforico) può irritare la pelle. In caso di contatto con gli occhi
sciacquare abbondantemente con acqua e consultare un medico.
I reagenti contengono una parte di conservante (mertiolato). Non ingerire! Evitare il contatto
con la pelle e le mucose!
CONSERVAZIONE E STABILITA’
Tutti i componenti contenuti nella confezione sono utilizzabili fino alla data di scadenza indicata.
Per la stabilità dei componenti dopo l’apertura, la ricostituzione e la diluizione consultare la
tabella qui di seguito riportata.
Se necessario, i campioni, i controlli e i calibratori possono essere congelati e scongelati fino a
cinque volta che. Si raccomanda tuttavia di suddividerli in adeguate aliquote.
Materiale/Reagente
Stato
Conservazione
Stabilità
Dopo la
ricostituzione
Temperatura ambiente
-20°C
8 ore
6 mesi
Strip ELISA
Dopo l’apertura
2 ... 8 °C con pellicola
adesiva in bustine di
alluminio con disseccante
Fino alla data
di scadenza
Tampone di lavaggio
concentrato
Dopo l’apertura
2 ...8°C
6 mesi
Tampone di lavaggio
Diluizione del
concentrato 1+9
2 ... 8 °C
3 settimane
Tampone di incubazione
Dopo l’apertura
2 ... 8 °C
2 mesi
Dopo l’apertura
2 ... 8 °C
6 mesi
Soluzione pronta
all’uso
Temperatura ambiente
60 minuti
Calibratori,
plasmi di controllo
Coniugato
Pipettare i calibratori, i plasmi di
controllo e i campioni diluiti nei
pozzetti.
Coprire gli strip con pellicola
Incubare a temperatura
ambiente
LAVAGGIO (indicazioni 1,3,4)
Tampone di lavaggio
REAZIONE CONIUGATO
(indicazioni 1,2)
Pipettare la soluzione d’uso del
coniugato nei pozzetti. Coprire gli
strip con pellicola
Incubare a temperatura
ambiente
LAVAGGIO (indicazioni 1,3,4)
Tampone di lavaggio
ARRESTO (indicazioni 1,2)
MISURAZIONE (indicazione
5)
45 minuti
3x200 µL
100 µL
45 minuti
3x200 µL
Pipettare la soluzione di
substrato nei pozzetti
Coprire gli strip con pellicola
nuova
Incubare a temperatura
ambiente
Pipettare la soluzione di arresto
nei pozzetti
REAZIONE SUBSTRATO
(indicazioni 1,2)
100 µL
100 µL
15 minuti
100 µL
Agitare per 10
sec., misurazione
entro 10 minuti
Lettore ELISA, 450nm
Temperatura ambiente: 20...25 °C
1. Acqua distillata
2. Provette per la diluizione dei calibratori e dei campioni
3. Cilindro graduato (1000 mL)
4. Pipette di precisione (10, 100 und 1000 µL)
5. Pipetta variabile (1000 µL)
6. Pipette multicanale e dispensatori multipli (100 und 200 µL)
7. Lavatore ELISA o pipetta multicanale
8. Lettore ELISA con filtro 450 nm (e filtro di riferimento a 620 nm se disponibile)
-
INCUBAZIONE CAMPIONI
(indicazioni 1,2)
Indicazioni
1. Non miscelare reagenti di lotti diversi.
2. La precisione e il recupero dipendono fra l’altro in modo decisivo anche dai seguenti fattori:
• Buona miscelazione di tutte le soluzioni diluite, 10 sec. nell’agitatore
• Esecuzione in doppio delle determinazioni
• Incubazione a temperatura corretta
• Rispetto scrupoloso dell’ordine di pipettamento e dei tempi indicati:
• I tempi di incubazione dei campioni e della reazione del coniugato e del substrato indicati
vengono presi a partire dal pipettamento dell’ultimo campione. I tempi di incubazione non
dovrebbero variare più del ± 10% .
• Nell’incubazione dei campioni e nella reazione del coniugato, il tempo per il pipettamento
dei calibratori/campioni/plasmi di controllo e soluzione del coniugato non deve superare i 60
sec. per strip-ELISA (8 pozzetti).
• Nella reazione del substrato e nell’arresto il tempo di pipettamento della soluzione di
substrato e di arresto non deve superare i 10 sec. per strip ELISA. L’utilizzo di pipette
multicanale e di dispensatori multipli permette di ridurre i tempi di pipettamento.
3. Contrassegnare gli strip con pennarello indelebile nell’evenienza che questi possano cadere
per errore dal supporto nel corso del test.
4. Dopo l’ultimo lavaggio svuotare completamente i pozzetti e capovolgerli su carta
assorbente.
5. La precisione del test aumenta effettuando una misurazione della differenza nella lunghezza
d’onda a 450 nm e 620 nm (oppure 690nm).
LIMITAZIONI DEL TEST
Il gruppo sanguigno 0 è associato a livelli bassi di vWF:CBA.
vWF:CBA è anche condizionato da attività fisica, gravidanza (da contraccettivi orali),
appartenenza a determinati gruppi etnici e dall’aumento dell’antigene legato all’età.
RISULTATI DELL’ANALISI
LETTURA DEI RISULTATI
Costruzione di una curva di riferimento: asse X: concentrazione vWF:CBA U/mL
(1 U/mL = 100%)
asse Y: estinzione
La curva di riferimento è lineare-lineare, i valori sono punto per punto o con „ spline cubica“
Valutazione della curva di riferimento
L’estinzione del calibratore più elevato dovrebbe posizionarsi fra 1,0 e 2,5.
La validità del test potrà essere testata in base ai valori di controllo rilevati.
Esempio di curva standard:
2,5
2
Substrato cromogeno
Dopo l’apertura
2 ... 8 °C
OD
1,5
Fino alla data
di scadenza
1
0,5
ESECUZIONE DEL TEST
0
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI DI PLASMA
Materiale: plasma
Come ottenere il plasma: miscelare 9 volumi di sangue venoso con un volume di soluzione di
citrato di sodio (0,11 mol/L) e centrifugare per 15 min. ad un’accelerazione minima relativa di
almeno 2500xg (DIN 58905). Il campione di plasma può essere conservato per tre ore a
temperatura ambiente, oppure congelato immediatamente dopo la centrifugazione.
Conservazione a –20°C. Durata: 6 mesi.
PREPARAZIONE DEL REAGENTE
1. Prima di procedere al test portare a temperatura ambiente tutti i componenti necessari.
2. Preparazione del tampone di lavaggio: diluire 1 volume di tampone di lavaggio concentrato
con 9 volumi di acqua distillata (1+9). Miscelare bene! (Tampone di lavaggio concentrato diluito
= tampone di lavaggio). Disciogliere eventuali cristalli ad una temperatura di 37°C per 10 min.
3. Ricostituzione dei calibratori e dei plasmi di controllo: i calibratori e i plasmi di controllo
vengono ricostituiti con 500 µl di acqua distillata e miscelati (agitatore per provette) per 10
secondi dopo un tempo di ricostituzione di 15 minuti. I componenti ricostituiti sono da
trasparenti a leggermente torbidi.
4. Diluizione dei calibratori, dei plasmi di controllo e dei campioni (1+25): diluire 20 µL di
campione, 20 µL di calibratori e 20 µL di plasmi di controllo rispettivamente con 500 µL di
tampone di incubazione. Miscelare per 10 secondi!
5. Preparazione della soluzione d’uso del coniugato (1+50): diluire 1 volume di coniugato con
50 volumi di tampone di incubazione.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
vWF:CBA U/ml
Determinazioni della concentrazione dei campioni
•
•
Ricavare le concentrazioni dei campioni dalla curva di riferimento.
Nel caso in cui il coefficiente di estinzione di un campione dovesse essere più alto di
quello dello standard più elevato, allora occorrerà diluire il campione (1+1). In tal caso la
concentrazione ricavata verrà moltiplicata per il fattore di diluizione 2.
VALORI DI RIFERIMENTO
Il valore normale del vWF:CBA è compreso fra 0,4 – 2,5 U/mL (40-250%) (Fig 1)
Si raccomanda a ciascun laboratorio di stabilire i propri intervalli di riferimento.
STANDARDIZZAZIONE
Il materiale di calibrazione utilizzato rispetta lo standard internazionale previsto
dall’Orgamizzazione mondiale della Sanità per il fattore VIII di coagulazione e il vWF nel plasma
umano.
BIBLIOGRAFIA
1) Blood 69; 1691 – 1695, 1987. The effect of ABO blood group on the diagnosis of vWD. Gill et al.
2) Thromb Haemost 2000; 83: 127 – 35. Collagen Binding Assay for von Willebrand Factor (VWF:CBA) Detection of VWD and discrimination of
VWD Subtypes, Depends on Collagen Source. E J Favaloro
3) Haemophilia (Suppl. 3), 1998, 15 – 24. The determination of von Willebrand
Distributeur en France : CRYOPEP 83, rue Yves Montand, 34080 Montpellier Tel: 04 67 13 21 00
CRYOPEP
TECHNOZYM® vWF:CBA ELISA
ES
DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTO
Para 8 pocillos: Mezclar 20 µL de conjugado con 1000 µL de tampón de
incubación.
APLICACIÓN
El factor von Willebrand (vWF) es una gran glicoproteína multifunctional. Ocupa un lugar clave
en la hemostasis primaria. Tiene una estructura múltimérica con varias funciones:
• Es proteína de transporte para el factor VIII en el plasma; forma un complejo y protege por
tanto al factor VIII de una temprana descomposición proteolítica.
• Actúa como mediador de agregación de plaquetas adhiriéndose a los receptores de las
membranas de las plaquetas (GP Ib by GP Iib/IIIa) tras una activación previa de las
plaquetas
• Desempeña una función en la hemostasis primaria actuando como mediador entre las
plaquetas adheridas y el subendotelio (pared vascular lesionada).
El síndrome von Willebrand (vWS) es la enfermedad hemorrágica que se da con más
frecuencia; puede ser hereditaria o adquirida, causada por defectos cuantitativos o cualitativos
del vWF. La determinación del antígeno de vWF es parte esencial del diagnóstico.
Para determinar las propiedades adhesivas del vWF, (su capacidad de adhesión a colágenos).
Ayuda en la diferenciación de las clases de la enfermedad de von Willebrand y la bioactividad
de concentrados.
COMPOSICION
1. Las tiras de pruebas ELISA (12) con 8 pocillos cada una, recubiertas con colágeno humano
de tipo III; el agente deshidratante se facilita en una bolsa de aluminio.
2. El concentrado de tampón de lavado: (PBS; pH 7,3); contiene detergente; 0,01% mertiolato;
1 frasco, 100 ml.
3.Tampón de incubación: (PBS; pH 7,3); contiene proteína estabilizadora; 0,05% proclin; y 1
frasco de colorante, 100 mL, listo para usarse.
4. Calibradores (estándares) numerados; liofilizados; 1 frasco de cada uno.
Las concentraciones dependen del lote; consultar la etiqueta en el vial.
5. Plasmas de control "nivel bajo" y "nivel alto" con fines de comprobación, liofilizados; 1
frasco de cada uno.
Las concentraciones dependen del lote; consultar la etiqueta en el vial.
6. Conjugado policlonal Anti-vWF-POX; teñido de azul; 1 frasco, 0,3 mL.
7. Cromógeno TMB (tetrametilbenzidina); 1 frasco, 12 mL; listo para usarse.
8. Solución parada: ácido sulfúrico 0,45 mol/l; 1 frasco, 12 mL; listo para usarse.
9. Película adhesiva para las tiras de pruebas ELISA (2).
MÉTODO DE LA PRUEBA
INCUBACIÓN DE LA
MUESTRA
(referencia 1, 2)
calibradores diluidos pipetear
los plasmas de control y
muestras en pocillos de pruebas.
Cubrir las tiras de pruebas con
una película.
incubar a temperatura ambiente
45 minutos
LAVADO (referencia 1,3,4)
tampón de lavado
3 x 200 µL
REACCIÓN DE
CONJUGADO
(referencia 1,2)
pipetear la solución de empleo
de conjugado en pocillos, cubrir
las tiras de pruebas con una
película
incubar a temperatura ambiente
45 minutos
LAVADO (referencia 1,3,4)
tampón de lavado
3 x 200 µL
pipetear la solución de substrato
en pocillos. Cubrir las tiras de
pruebas con una película.
Incubar a temperatura ambiente
pipetear la solución de parada
en los pocillos
15 minutos
REACCIÓN DE SUBSTRATO
(referencia 1,2)
SOLUCIÓN PARADA
(referencia 1,2)
MEDICIÓN (referencia 5)
100 µL
100 µL
100 µL
100 µL
Agitar durante 10 seg.
Medir en 10 min.
Lector ELISA, 450 nm
- Todos los productos sanguíneos o plasmáticos, así como las muestras se deben considerar
potencialmente infecciosos. Se deben tratar con las debidas precauciones de conformidad
con los reglamentos de seguridad biológica vigentes. Los desechos se deberán eliminar
como en los hospitales. Los calibradores y plasmas de control son fabricados con sangre
humana y cada plasma empleado en el procedimiento es HBsAg, HIV 1/2 Ac y HCV-Acnegativo (véanse las etiquetas en el kit y/o en los frascos).
- La solución de parada (ácido sulfúrico) puede irritar la piel. En caso de que el ácido
alcanzase sus ojos, láveselos inmediatamente y acuda a un médico
- Los reactivos contienen en ocasiones agentes conservantes (mertiolato). ¡ NO DEBE SER
INGERIDO¡ Evítese el contacto con la piel o membranas mucosas
La temperatura ambiente es de entre 20...25°C
Advertencias
1. No se deben combinar los reactivos de diferentes lotes
2. La precisión y reproducibilidad dependen principalmente, entre otras cosas, de los
siguientes factores:
• La mezcla a fondo todas las substancias empleadas en la dilución
• Deben probarse los calibradores de pruebas, controles y muestras en duplicado
• La incubación debe llevarse a cabo a temperaturas adecuadas
• La estricta observancia del orden en que se llevan las pruebas con la pipeta y el elemento
de tiempo indicado
• El tiempo indicado para la incubación de la muestra, la reacción de conjugado y de substrato
se inicia tras efectuar la prueba de la última muestra con la pipeta. Los tiempos de
incubación no deberán variar en más de ±10%.
• Durante la incubación de la muestra y la reacción de conjugado, el tiempo para pipetear los
calibradores/muestras/plasmas de control y/o soluciones de conjugado diluidos, no debe
exceder de 60 segundos para la tira de prueba ELISA (8 pocillos).
• Durante la reacción de substrato y el stop, el tiempo necesario para pipetear el substrato y/o
la solución parada no debe exceder de 10 segundos por cada tira de prueba ELISA. Se
podrán lograr tiempos breves en las pruebas usando pipetas multicanal y dispensadoras.
3.Indicar el número en las tiras con un lapiz resistente al agua para el caso en de que se
desprendan accidentalmente de su sitio durante la realización de la prueba.
4. Después del último lavado, los pocillos deben ser aspirados a fondo, darlos la vuelta y
colocarlos sobre un papel absorbente; los últimos residuos se deben eliminar golpeando
suavemente.
5.Mediante la medición de la diferencia en longitudes de onda a 450 y 620 nm o a 450 y 690
nm, se incrementa la precisión de la prueba.
ESTABILIDAD Y CONSERVACION
LIMITACIONES DE LA PRUEBA
Todos los componentes que contiene el kit se pueden usar hasta la fecha de caducidad
indicada. La estabilidad de referencia de los componentes después de su apertura,
reconstitución y/o dilución se puede apreciar en la tabla siguiente:
Cuando sea necesario se pueden congelar y descongelar las muestras, controles y
calibradores hasta 5 veces. Sin embargo, se recomienda hacer alícuotas.
Los niveles reducidos de vWF:CBA están asociados con el grupo sanguíneo 0.
El vWF:CBA se ve asimismo afectado por el ejercicio físico, el embarazo (el uso de la píldora
anticonceptiva), el grupo étnico y el aumento del antígeno l con la edad.
1. Agua destilada
2. Tubos de ensayo para diluir estándares y muestras
3. Probeta graduada (1000 mL)
4. Pipetas de precisión (10, 100 und 1000 µL)
5. Pipeta variable (1000 µL)
6. Pipetas multicanal y/o dispensadoras (100 und 200 µL)
7. Lavador ELISA o pipeta multicanal
8. Lector ELISA con filtro de 450 nm (filtro de referencia de 620 nm si resulta disponible.)
ADVERTENCIA Y PRECAUCIONES
Material/Reactivo
Situación
Conservación
Estabilidad
Calibradores,
plasma de control
después de la reconstitución
temperatura ambiente
-20°C
8 horas
6 meses
Tiras de pruebas
después de su apertura
2...8 °C con pelicula adhesiva
en una bolsa de plástico con
deshidratante
fecha de
caducidad
Concentrado de
tampón de lavado
después de su apertura
2...8°C
6 meses
Tampón de lavado
1+9 dilución de concentrado
2...8°C
3 semanas
después de su apertura
2...8°C
2 meses
después de su apertura
2...8°C
6 meses
solución de empleo
temperatura ambiente
60 minutos
después de su apertura
2...8°C
fecha de
caducidad
Tampón de incubación
Conjugado
Cromógeno TMB
RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
Trazado de una curva de referencia: Eje X: Concentración vWF:CBA U/mL (1 U/mL = 100%)
Eje Y: Extinción
La curva de referencia es lineal-lineal, únanse los valores ranhura punto al punto ou cúbica
Evaluación de la curva de referencia:
La extinción del coeficiente del calibrador más alto deberá estar de entre 1,0 y 2,5.
La validez de la prueba se puede comprobar sobre la base de los valores de control
calculados.
Ejemplo de curva estándar:
2,5
2
1,5
OD
MATERIAL NECESARIO (no se suministra con el kit)
1
0,5
MÉTODO DE LA PRUEBA
PREPERACIÓN DE LAS MUESTRAS
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
vWF:CBA U/ml
Material: plasma
Obtención del plasma: mézclense 9 partes de sangre venosa con 1 parte de solución de
citrato sódico (0,11 mol/L) y centrifúguese durante 15 minutos a (RCF) de al menos 2500 (DIN
58905). La muestra de plasma se puede conservar durante 3 horas a temperatura ambiente;
de otra forma, la muestra se debe congelar inmediatamente después de proceder a su
centrifugación. Estable a -20° C durante 6 meses.
Medición de las muestras de concentración:
• Léase la concentración en la curva de referencia.
• En caso de haber muestras con mayores coeficientes de extinción que el punto estándar
más elevado en la curva, tendrán que ser diluidos previamente con tampón de incubación
(1+1). La concentración medida tiene que multiplicarse por el factor 2 de dilución.
PREPERACIÓN DEL REACTIVO
RANGO DE REFERENCIA
1. Antes de iniciar la prueba, deberán ponerse a temperatura ambiente todos los componentes
necesarios.
2. Preparar el tampón de lavado: Diluir una parte de volumen de concentrado de tampón de
lavado con 9 partes de volumen de agua destilada (1+9). ¡Mézclese bien! (concentrado de
tampón de lavado diluido = tampón de lavado). Pueden producirse precipitaciones cristalinas
que se disolverán a 37°C en 10 minutos.
3. Calibradores de reconstitución y plasmas de control:Los calibradores y los plasmas de
control se reconstituyen con 500 µL de agua destilada y se mezclan durante 10 segundos
después de un tiempo de reconstitución de 15 minutos (mezclador Vortex). Los componentes
reconstituidos resultan claros o ligeramente turbios.
4. Diluir los calibradores, plasmas de control y muestras (1+25): Diluir muestras de 20 µL,
calibradores de 20 µL y/o controles de 20 µL respectivamente con 500 µL de tampón de
incubación. ¡Mézclese durante 10 segundos!
5. Preparar la solución de empleo de conjugado (1+50): Diluir 1 parte de volumen de
conjugado con 50 partes de volumen de tampón de incubación:
Rango normal con respecto al vWF:CBA se encuentra entre 0,4 – 2,5 U/mL (40-250%)
(Fig 1)
Se recomienda que los distintos laboratorios establezcan su propio rango normal.
ESTANDARDIZACIÓN
El material de calibración empleado es el estándar internacional de la OMS para el factor VIII
de coagulación de la sangre y el factor von Willebrand en plasma humano.
LITERATURA
1) Blood 69; 1691 – 1695, 1987. The effect of ABO blood group on the diagnosis of vWD. Gill et al.
2) Thromb Haemost 2000; 83: 127 – 35. Collagen Binding Assay for von Willebrand Factor (VWF:CBA) Detection of VWD and discrimination
of VWD Subtypes, Depends on Collagen Source. E J Favaloro
3) Haemophilia (Suppl. 3), 1998, 15 – 24. The determination of von Willebrand factor activity by collagen binding assay. Siekmann et al.
Distributeur en France : CRYOPEP 83, rue Yves Montand, 34080 Montpellier Tel: 04 67 13 21 00
CRYOPEP
TECHNOZYM® vWF:CBA ELISA
Para 8 poços de teste: misturar 20 µL de conjugado com 1000 µL de Tampão de
incubação.
DESCRIÇÃO DO PRODUTO
USO
O factor von Willebrand (vWF) é uma glicoproteína multifuncional grande que ocupa uma
posição-chave na hemostase primária. Apresenta-se como estrutura múltipla e tem várias
funções:
• É a proteína transportadora do factor VIII no plasma e forma um complexo, protegendo,
desta maneira, o factor VIII de uma degradação proteolítica precoce.
• Age como um mediador da agregação plaquetária através da adesão aos receptores nas
membranas das plaquetas (GP lb GP llb/llla) após prévia activação das plaquetas.
• Ele ocupa um papel na hemostase primária, agindo como um mediador na adesão das
plaquetas ao subendotélio (parede danificada dos vasos).
Para caracterizar as propriedades de adesão, é analisada normalmente a agregação
plaquetária (sistema de medição = agregação plaquetária em dependência de ristocetina.
Esta, entretanto, não reflete a situação fisiológica e a função do vWF.
Para determinar as propriedades de adesão do vWF, é utilizada a ligação do vWF ao
colágeno. A determinação de uma ligação de vWF-colágeno corresponde à função fisiológica
do vWF.
PROCEDIMENTO DO TESTE
COMPOSIÇÃO
1. Tiras de teste ELISA (12): com 8 poços de teste cada; revestidas com colágeno humano
tipo III; embaladas em saco de alumínio com agente secante.
2. Tampão de lavagem concentrado: (PBS; pH 7,3); contém detergente; 0,01% mertiolato; 1
frasco; 100 mL.
3. Tampão de incubação: (PBS; pH 7,3); contém estabilizador de proteína; 0,05% proclin; e
corante; 1 frasco; 100 ml; pronto a usar
4. Calibradores (padrões):Numerados; liofilizados, um frasco de cada.
As concentrações são dependentes do lote, consultar as etiquetas do frasco!
5. Plasmas de controlo “nível alto” e nível baixo”: para verificação; liofilizados, um frasco de
cada.
As concentrações são dependentes do lote, consultar as etiquetas do frasco!
6. Conjugado: POX anti-vWF policlonal; coloração azul; 1 frasco; 0,3 mL
7. Substrato cromogéneo: TMB (tetrametilbenzidina) 1 frasco; 12 mL; pronto a usar
8. Solução de paragem: ácido sulfúrico 0,45 mol/l; 1 frasco; 12 mL, pronto a usar
9. Películas adesivas:para tiras de teste ELISA, 2 unidades
MATERIAL NECESSÁRIO (não incluído no conjunto de teste)
1. Água destilada
2. Tubos para diluição das soluções-padrão e das amostras
3. Proveta (1000 mL)
4. Pipetas de precisão (10, 100 e 1000 µL)
5. Pipeta variável (1000 µL)
6. Pipetas multicanal ou de dispensação (100 e 200 µL)
7. Dispositivo de lavagem ELISA ou pipeta multicanal
8. Equipamento de leitura ELISA com filtro de 450 nm (e filtro de referência de 620 nm, caso
disponível)
ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES
- Todos os produtos de sangue humano, plasma e amostras devem ser considerados como
potencialmente infecciosos. Devem ser manuseados com os cuidados necessários e
conforme os regulamentos de segurança e devem ser removidos como lixo hospitalar. Os
calibradores e controlos, produzidos com sangue humano e cada plasma individual utilizado
acusaram um resultado negativo nos testes referentes ao HBsAg, HIV Ac e HCV Ac (ver
etiqueta externa ou no frasco).
A solução de paragem (ácido sulfúrico) pode ocasionar irritações da pele. No caso do ácido
atingir os olhos, lavar imediatamente com bastante água e consultar um médico!
Alguns reagentes contêm conservantes (mertiolato).Não ingerir! Evitar contacto com a pele
ou mucosas!
Material/reagente
Calibradores,
plasmas de controlo
Estado
Armazenagem
Estabilidade
após reconstituição
Temperatura ambiente
-20°C
8 horas
6 meses
Tiras de teste ELISA
depois de aberto
2 ... 8 ºC com filme adesivo
em saco de alumínio, com
agente secante
Data de
validade
Tampão de lavagem
concentrado
depois de aberto
2 ... 8ºC
6 meses
Tampão de incubação
Conjugado
Substrato cromogéneo
Pipetar os calibradores diluídos,
plasmas de controlo e amostras
para os poços de teste. Cobrir as
tiras de teste com película
Incubar a temperatura ambiente
LAVAR (Orientações 1,3,4)
Tampão de lavagem
REAÇÇÃO DO
CONJUGADO (Orientações
1,2)
Pipetar a solução de trabalho de
conjugado para os poços de
teste.Cobrir as tiras de teste com
película
Incubar a temperatura ambiente
LAVAR (Orientações 1,3,4)
Tampão de lavagem
PARAR (Orientação 1,2)
100 µL
45 minutos
3x200 µL
Instrumento de leitura ELISA,
450nm
MEDIÇÃO (Orientação 5)
45 minutos
3x200 µL
Pipetar a solução de substrato
para os poços de teste.Cobrir as
tiras de teste com película nova
Incubar a temperatura ambiente
Pipetar a solução de paragem
para os poços de teste
REAÇÇÃO DO SUBSTRATO
(Orientação 1,2)
100 µL
100 µL
15 minutos
100 µL
Agitar 10
segundos,
medição dentro de
10 minutos
Temperatura ambiente: 20...25 °C
Orientações
1. Reagentes de lotes diferentes não podem ser misturados.
2. A precisão e o desempenho dependem, entre outros, dos seguintes factores:
• Misturar bem todas as soluções de diluição, 10 segundos no vortex.
• Execução de testes em duplicado
• Incubação na temperatura correcta
• Observação exacta da sequência de pipetagem e cronometragem:
• O tempo indicado para a incubação da amostra, reacção do conjugado e do substrato é
contado depois de pipetar a última amostra. Os tempos de incubação não devem variar
em mais do que + 10%.
• Na incubação da amostra e reacção do conjugado, o tempo para pipetar os
calibradores/amostras/plasmas de controlo ou solução de conjugado não devem
ultrapassar 60 segundos para cada tira de teste ELISA (8 poços).
• Na reacção do substrato e na paragem, o tempo para pipetar o substrato ou a solução de
paragem não deve ultrapassar 10 segundos para cada tira de teste ELISA. O uso de
pipetas multicanal ou pipetas de dispensação permite reduzir o tempo de pipetagem.
3. Marcar as tiras de teste com caneta à prova de água, para o caso de acidentalmente
saírem do seu lugar durante o teste.
4. Após o último procedimento de lavagem, os poços de teste devem ser aspirados
completamente e batidos sobre papel absorvente.
5. Através da medição em comprimentos de ondas diferentes a 450 nm e 620 nm (ou
690nm), a precisão do teste será aumentada.
LIMITAÇÃO DA EXECUÇÃO DO TESTE
CONSERVAÇÃO E ESTABILIDADE
Todos os componentes da embalagem têm validade até a data impressa. A validade dos
componentes, após abrir a embalagem, reconstituição ou diluição pode ser consultada na
tabela a seguir.
Se necessário, as amostras, controlos e calibradores podem ser congelados e novamente
descongelados cinco vezes, mas é recomendada a armazenagem em alíquotas adequadas.
Tampão de lavagem
INCUBAÇÃO DAS
AMOSTRAS Orientações 1,2)
Níveis reduzidos de vWF:CBA são associados ao grupo sanguíneo 0.
O vWF:CBA também é influenciado pelo trabalho físico, gravidez (anticoncepcionais via oral) e
raça. Os antigénios aumentam com a idade.
RESULTADOS DAS ANÁLISES
CÁLCULO DOS RESULTADOS
Elaboração da curva de calibração: Eixo X: Concentração vWF:CBA U/mL (1 U/mL = 100%)
Eixo Y:Extinção (OD)
A curva de calibração é linear-linear, com ajuste ponto ao ponto ou cúbico ( “cubic spline”)
Avaliação da curva de calibração
A extinção do calibrador mais alto deve situar-se entre 1,0 e 2,5.
A validade do teste pode ser verificada com base nos valores de controlo determinados.
Exemplo de uma curva-padrão:
2,5
2
1+9 diluição do
concentrado
depois de aberto
depois de aberto
Solução de trabalho
2 ... 8 °C
3 semanas
2 ... 8 °C
2 ... 8 °C
Temperatura ambiente
depois de aberto
2 ... 8 °C
2 m eses
6 meses
60 minutos
Data de
validade
1,5
OD
-
PT
1
0,5
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
vWF:CBA U/ml
EXECUÇÃO DO TESTE
Determinação das concentrações das amostras
PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE PLASMA
Material das amostras:Plasma
Separação do plasma: Misturar 9 partes de sangue venoso com 1 parte de solução de citrato
de sódio (0,11 mol/L) e centrifugar durante 15 min com pelo menos 2500 de FCR (força
centrífuga radial conforme DIN 58905). A amostra de plasma pode ser conservada em
temperatura ambiente durante 3 horas. Caso contrário, a amostra deve ser congelada
imediatamente após a centrifugação. Validade –20ºC: 6 meses.
PREPARAÇÃO DO REAGENTE
1. Antes de iniciar o teste, levar todos os componentes do teste à temperatura ambiente.
2. Preparação do Tampão de Lavagem: diluir uma parte de tampão de lavagem concentrado
em 9 partes de água destilada (1+9). Misturar bem!(tampão de lavagem concentrado
diluído = tampão de lavagem).Eventuais formações cristalinas entram em solução a 37ºC
dentro de 10 min.
3. Reconstituição dos calibradores e plasmas de controlo: Os calibradores e plasmas de
controlo são reconstituídos com 500 µL de água destilada e, depois de um tempo de
reconstituição de 15 minutos, misturados durante 10 segundos (misturador de amostras.
Os componentes reconstituídos são transparentes a levemente turvos.
4. Diluição dos calibradores, plasmas de controlo e amostras (1+25): Misturar 20 µL de
amostra, 20 µL de calibradores ou 20 µL de agentes de controlo com 500 µL de tampão de
incubação. Misturar durante 10 segundos!
5. Preparação da solução de trabalho do conjugado (1+50): Diluir 1 parte de conjugado com
50 partes de tampão de incubação
•
•
Fazer a leitura das concentrações das amostras na curva de calibração.
Caso o valor de extinção de uma amostra se situe acima do valor do padrão mais alto,
então a amostra deve ser previamente diluída com tampão de incubação (1+1). Neste
caso, a concentração determinada é multiplicada pelo factor de diluição 2.
VALORES DE REFERÊNCIA
Os valores normais de vWF:CBA situam-se entre 0,4 – 2,5 U/mL (40-250%) (Fig 1)
Recomenda-se que cada laboratório determine o seu próprio intervalo normal.
ESTANDARDIZAÇÃO
O material de calibração utilizado é o padrão internacional da WHO (Organização Mundial da
Saúde) para o factor de coagulação VIII e para o vWF no plasma humano.
LITERATURA
1) Blood 69; 1691 – 1695, 1987. The effect of ABO blood group on the diagnosis of vWD. Gill et al.
2) Thromb Haemost 2000; 83: 127 – 35. Collagen Binding Assay for von Willebrand Factor (VWF:CBA) Detection of VWD and discrimination
of VWD Subtypes, Depends on Collagen Source. E J Favaloro
3) Haemophilia (Suppl. 3), 1998, 15 – 24. The determination of von Willebrand factor activity by collagen binding assay. Siekmann et al.
Distributeur en France : CRYOPEP 83, rue Yves Montand, 34080 Montpellier Tel: 04 67 13 21 00
CRYOPEP
TECHNOZYM® vWF:CBA ELISA
FR
5. Préparer la solution conjugué prête à l’emploi (1+50): Diluer 1 vol de solution de conjugué
concentré avec 50 vol de tampon d’incubation.
DESCRIPTION DU PRODUIT
UTILISATION PRÉVUE
Le Facteur de von Willbrand (vWF) est une grande protéine multifonctionnelle, qui occupe une
position clé au cours de l’hémostase primaire. Elle a une structure multimérique et remplit
plusieurs fonctions:
• C’est la protéine de transport du Facteur VIII dans le plasma; un complexe se forme,
protégeant ainsi le Facteur VIII d’une dégradation protéolytique précoce.
• Il agit en tant que médiateur de l’agrégation plaquettaire en s’attachant aux récepteurs de la
membrane plaquettaire (GP Ib et GP IIb\IIIa) après une première activation des plaquettes.
• Il joue un rôle dans l’hémostase primaire en agissant en tant que médiateur lors de
l’adhésion des plaquettes au sous endothélium lors de lésion(s) vasculaire(s).
Le syndrome de Willbrand est une maladies hémorragique qui se transmet très fréquemment,
elle peut être héréditaire ou acquise, et est à l’origine de l’absence ou de défaut de
fonctionnement du vWF. Afin d’analyser les propriétés adhésives, l’agrégation plaquettaire est
mesurée en routine. Cependant, cela ne reflète ni les propriétés physiologiques du vWF ni ses
propriétés fonctionnelles. La capacité de liaison du vWF au collagène sert de paramètre pour
déterminer les propriétés adhésives du vWF car elle reflète ses propriétés physiologiques
Pour 8 puits de test: Mélanger 20 µL de conjugué concentré avec 1000 µL de
tampon d’incubation.
PERFORMANCE DU TEST
INCUBATION DE
L’ÉCHANTILLON
(références 1, 2)
MATÉRIEL REQUIS (non fourni avec le kit)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Eau distillée
Tubes de dilution pour les calibrateurs et les échantillons
Eprouvette graduée de 1000 mL
Pipettes de précision (10, 100, 1000 µL)
Pipette variable (1000 µL)
Pipettes multi canal (100, 200 µL)
Automate de lavage ELISA ou pipette multi canal.
Lecteur de plaque ELISA équipée d’un filtre à 450 nm et si possible d’un filtre de
référence à 620 nm.
AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS
-
-
-
Tous les produits élaborés à partir de sang humain et de plasma doivent être considérés
comme étant potentiellement infectieux. Ils doivent être manipulés avec une attention
particulière, et ceci dans la stricte observance des règles de sécurité. Les règles
concernant le stockage des déchets sont identiques à celles appliqués à l’hôpital.
Les standards et contrôles plasmatiques sont élaborés à partir de sang humain, et tout
plasma utilisé lors du test est HBS Ag, HIV ½ et HCV-Ag-négatif (voir les étiquettes sur le
kit et/ou sur les bouteilles).
a solution d’arrêt (acide sulphurique) peut être irritante pour la peau. En cas de contact
avec les yeux, rincer immédiatement avec de l’eau distillée et consulter un docteur.
Les réactifs contiennent des agents préservant (merthiolate). Ne pas avaler! Eviter tout
contact avec la peau ou les muqueuses.
STABILITÉ ET STOCKAGE
Tous les composants de ce kit doivent être utilisés avant la date de péremption indiquée. La
stabilité des composants après ouverture, reconstitution et\ou dilution est documentée dans le
tableau ci-dessous:
Si nécessaire, les échantillons, contrôles et standards peuvent être congelés et décongelés
jusqu’ â 5 fois, cependant effectuer des alicquots est le plus recommandé.
Matériel/Réactif
Stockage
Stabilité
calibrateut et contrôles après reconstitution
Température ambiante
-20°C
8 heures
6 mois
ELISA test strip
Après ouverture
2 ... 8 °C sous film adhésif
avec agent détissant dans Date de péremption
un sac en plastique
tampon de lavage
concentré
Après ouverture
2 ...8°C
6 mois
tampon de lavage
1+9 dilution du
concentré
2 ... 8 °C
3 semaines
Incuber à température ambiante
45 minutes
TAMPON DE LAVAGE
3 x 200 µL
RÈACTION DU CONJUGAT
(référence 1,2)
Pipeter la solution de conjugué
prête à l’emploi dans les puits,
couvrir les bandelettes de test
avec un film.
Après ouverture
2 ... 8 °C
2 mo is
Après ouverture
2 ... 8 °C
6 mois
Conjugé
Solution conjugué prête
à l’emploi
Température ambiante
60 minutes
substrat TMB
Après ouverture
2 ... 8 °C
Date de pér emption
100 µL
Incuber à température ambiante
45 minutes
LAVAGE (référence 1,3,4)
TAMPON DE LAVAGE
3 x 200 µL
RÈACTION DU SUBSTRAT
(référence 1,2)
pipeter la solution de substrat
dans chaque puit.
Couvrir les bandelettes avec un
film.
SOLUTION D´ARRET (reference
1,2)
pipeter la solution d’arrêt dans
les puits
Incuber à température ambiante
MEASURE (référence 5)
Lecteur de plaque ELISA, 450 nm
100 µL
15 minutes
100 µL
Secouer 10 sec.,
Mesurer dans un
intervalle de
10 minutes
Température ambiante: 20...25°C
Références:
1. Ne pas utiliser ensemble des réactifs provenant de différents lots.
2. Le bon déroulement et la précision du test dépendent des facteurs suivants:
• Bien mélanger les substances utilisées lors des dilutions
• Les standards, les contrôles et les échantillons doivent testés en dupliqué.
• Les incubations doivent effectuées à la bonne température.
• Respecter strictement l’ordre de pipetage et le temps pour chaque élément comme indiqué:
le temps d’incubation des échantillons, conjugués, et substrat démarre après le pipetage du
dernier échantillon. Les temps d’incubation ne doivent pas varier de +/- 10%.
• Durant l’incubation de l’échantillon et la réaction du conjugué, le temps nécessaire au
pipetage du calibrateur/échantillon/contrôle plasmatique dilué et/ou des solutions de
conjugué, ne doivent pas excéder 60 secondes par bandelette de test ELISA (8 puits).
• Durant la réaction du substrat et lors de l’arrêt de la réaction, le temps nécessaire au
pipetage du substrat ne dois pas excéder 10 secondes par bandelette. Pour cela utiliser
de préférence une pipette multi canal.
3. Numéroter les bandelettes avec un feutre résistant à l’eau au cas où les bandes tombent
accidentellement de la plaque durant le test.
4. Après le dernier lavage, les puits doivent être rigoureusement secs : Pour cela positionner la
plaque d’analyse sur du papier absorbent et taper doucement la plaque d’analyse
5. Mesurer l’absorbance à 450 et 620 nm ou à 450 et 690 nm, la précision du test est alors
augmentée
LIMITES DU TEST
Les faibles niveaux de vWF:CBA sont associés au groupe sanguin O.
Les niveaux d’antigènes vWF:CBA dépendent de l’exercice physique, la grossesse, l’utilisation
de pilules contraceptives, du groupe ethnique, le niveau de l’antigène augmente aussi avec
l’age.
RÉSULTATS DU TEST
CALCUL DES RÉSULTATS
Établissement de la courbe de référence:
Axe X : Concentration de vWF:CBA U/ml (1 U/mL=100%)
Axe Y : Absorbance
La courbe de référence est linéaire linéaire en point au point ou cubic spline.
Evaluation de la courbe de référence:
•Le coefficient de la courbe d’extinction du calibrateur le plus grand devrait se situer entre 1,0
et 2,5.
•La validité du test doit être vérifiée sur la base des valeurs calculées des contrôles
Exemple de courbe de référence :
2,5
2
1,5
OD
tampon d´incubation
État
100 µL
LAVAGE (référence 1,3,4)
CONTENU
1. 12 bandelettes de test ELISA contenant 8 puits chacune avec du collagène humain
de type III,et un agent détissant ; emballés dans un sac d’aluminium.
2. Tampon de lavage concentré: (PBS; pH 7,3) ; contenant du détergent; 0,01% de
merthiolate; 1 bouteille 100 mL.
3. Tampon d'incubation: (PBS; pH 7.3): contient des stabilisants de proteines: 0.05% proclin et
colorant, flacon de 100 ml, prêt à l'emploi.
4. Calibrateur numérotés; lyophilisés; chacun dans une fiole.
Les concentrations sont dépendant du lot; consulter les étiquettes sur les fioles.
5. 2 Contrôles plasmatiques “high level” et “low level” ; lyophilisés; une bouteille de chaque.
Les concentrations sont dépendant du lot; consulter les étiquettes sur les fioles.
6. Conjugué concentré (anticorps polyclonal dirigé contre le vWF marqué à la peroxydase de
Raifort) de couleur bleu, une fiole, 0,3 mL.
7. Chromogène TMB (tétraméthylbenzidine); 1 bouteille, 12 mL ; prêt à l’emploi.
8. Solution d’arrêt: acide sulfurique 0,45 mol\L; 1 bouteille 12 mL; prêt à l’emploi.
9. 2 films adhésives for les bandes de tests ELISA.
Calibrateurs dilués
Contrôles plasmatiques dilués
Echantillons dilués dans chaque
puit.
Couvrir les bandelettes avec un
film.
1
PROCÉDURE DU TEST
0,5
PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS
Matériel : Plasma
Obtention des plasmas : Mélanger 9 volume de sang veineux avec 1 volume de solution
Sodium Citrate (0,11mol\L) et centrifuger pendant 15 minutes à une vitesse minimum de 2500
g (DIN 58905). Les échantillons de plasmas doivent être stockés pendant 3 heures à
température ambiante, ou doivent être immédiatement congelés après centrifugation. Les
plasmas ainsi obtenus sont stables à -20°C pendant 6 mois.
PRÉPARATION DES RÉACTIFS
1. Tous les composants doivent être amenés à la température ambiante avant de commencer
le test.
2. Préparation du tampon de lavage: Diluer 1 vol de tampon de lavage concentré avec 9 vol
d’eau distillée (1+9). Bien mélanger! Il se peut qu’il y ait des précipitation cristallines: celles-ci
se dissolvent à 37^C en 10 minutes à température ambiante.
3. Reconstitution des calibrateurs et des contrôles plasmatiques: Les calibrateurs et les
contrôles plasmatiques sont reconstitués avec 500 µL d’eau distillée et mélangés pendant 10
secondes après 15 minutes de temps de reconstitution. Les composants ainsi reconstitués
sont claires ou très légèrement troubles.
4. Dilution des calibrateurs, contrôles plasmatiques et des échantillons (1+25): Diluer 20 µL
d’échantillon, 20 µL de calibrateurs, et\ou 20 µL de contrôle plasmatique avec 500 µL de
tampon d’incubation chacun. Mélanger pendant 10 sec.
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
vWF:CBA U/ml
Mesure des concentrations des échantillons:
•Lire la concentration à partir de la courbe de référence.
•Si des échantillons présentent un coefficient d’extinction supérieur à celui du plus haut point
de la courbe de référence, il doit alors être pré dilué avec le tampon d’incubation (1+1), et la
concentration mesurée doit alors être multipliée par 2.
GAMME DE RÉFÉRENCE
La gamme normale de référence est comprise entre 0,4 et 2,5 U/mL (40-250%) (Fig 1)
Il est recommandé que les différents laboratoires établissent leur propre gamme.
STANDARDISATION
Le matériel utilisé pour la standardisation est le calibrateur international pour le facteur VIII de
la coagulation sanguine et le facteur plasmatique de von Willebrand homologué par l’OMS.
LITTÉRATURE
1) Blood 69; 1691 – 1695, 1987. The effect of ABO blood group on the diagnosis of vWD. Gill et al.
2) Thromb Haemost 2000; 83: 127 – 35. Collagen Binding Assay for von Willebrand Factor (VWF:CBA) Detection of VWD and discrimination
of VWD Subtypes, Depends on Collagen Source. E J Favaloro
3) Haemophilia (Suppl. 3), 1998, 15 – 24. The determination of von Willebrand factor activity by collagen binding assay. Siekmann et al.
Distributeur en France : CRYOPEP 83, rue Yves Montand, 34080 Montpellier Tel: 04 67 13 21 00
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normal distribution of normal plasma (Fig 1) and patient plasma (Fig 2 – 5) / Normalverteilung von Normalplasmen (Fig 1) und Patientenplasmen (Fig 2 – 5) / distribuzione
normale de plasma normale (Fig 1) ed plasma paziente (Fig 2 – 5) / distribución normal de plasmas normal (Fig 1) y plasmas paciente (Fig 2 – 5) / distribuição normal de
plasmas normal (Fig 1) e plasmas paciente (Fig 2 – 5) / distribution normale de plasmas normale (Fig 1) et de plasmas patient (Fig 2 – 5)
Fig 1:
Fig 2:
50
6
normal donors
Typ 1 vWF Disease
5
40
4
30
3
20
2
10
1
0
0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
3,2
0.0
3,4
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
vWF: CBA U/ml
vWF: CBA U/ml
Fig 3:
Fig 4:
12
Typ 2 vWF Disease
11
9
Typ 3 vWF Disease
8
10
7
9
8
6
7
5
6
4
5
4
3
3
2
2
1
1
0
0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
vWF:CBA U/ml
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
vWF: CBA U/ml
Fig 5:
8
TTP patients
7
6
5
4
3
2
1
0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
vWF: CBA U/ml
Distributeur en France : CRYOPEP 83, rue Yves Montand, 34080 Montpellier Tel: 04 67 13 21 00
2,4
2,6
2,8
3,0
3,2
3,4