Feline Leukemia Virus Antigen Test Kit
(Screening/Confirmatory)
Trousse de détection d'antigène
du virus de la leucémie féline
(Dépistage/Confirmation)
Kit di Ricerca dell'Antigene del Virus
della Leucemia Felina
(Screening/Di conferma)
Kit para la detección de Antígeno
del Virus de la Leucemia Felina
(Detección y confirmación)
Testkit zum Nachweis des Felinen
Leukämievirus-Antigens
(Screening/Bestätigung)
Die deutsche Fassung der Gebrauchsinformation ist entsprechend §17c Tier SG zugelassen.
PetChek*
06-08633-03
English version
Feline Leukemia Virus Antigen Test Kit
(Screening/Confirmatory)
(For Veterinary Use Only)
Name and Intended Use
PetChek* FeLV is an enzyme
immunoassay designed to screen
for and confirm the presence of
feline leukemia virus antigen (FeLV)
in feline serum or plasma. Whole
blood samples may be used in
the Screening Protocol, but serum
or plasma must be used in the
confirmatory protocol.
Description and Principles
This test kit uses antibodies specific
for FeLV p27. These antibodies are
coated on microtiter wells which are
arranged in 12-well strips.
In the screening protocol, samples
are incubated in the test wells
with antibodies conjugated to
Horseradish Peroxidase (HRPO).
Any FeLV antigen in the sample
will bind with both the antibody
coated on the test well and with
the Antibody:HRPO Conjugate.
Unbound materials are washed from
the wells, then enzyme substrate/
chromogen is added. Subsequent
color development is proportional to
the amount of FeLV group-specific
antigen (p27) present in the test
sample.
However, in the screening protocol,
it is possible that samples which
contain non-FeLV material (such as
feline anti-mouse antibodies) will
react with the test kit.
For this reason, any positive
results should be checked with the
confirmatory protocol.
The confirmatory protocol
checks the accuracy of positive
results obtained on the screening
protocol.
The confirmatory protocol is
identical to the screening protocol
except for the addition of a sample
pretreatment step. A sample
screened as positive is pretreated
with neutralizing antibody. Antigen,
if present in the serum or plasma,
will react with the antibodies,
complexing the available binding
sites. This treated sample is then
transferred to a test well and
assayed per the confirmatory
protocol. Since most of the binding
sites on the antigen are already
complexed, the sample will produce
substantially reduced absorbance
values. For comparison, the sample
is also treated with a non-reactive
diluent and assayed concurrently
with the neutralized sample. The
sample is considered positive if the
neutralizing antibody reduces color
formation by 50% or greater as
compared to the sample treated with
non-reactive diluent.
Reagents 1. Anti-FeLV Coated Plates
2. Anti-FeLV Horseradish Peroxidase Conjugate
preserved with gentamicin
3. Positive Control
preserved with gentamicin
4. Negative Control preserved with gentamicin
5. TMB Substrate Solution
7. Wash Concentrate (10X) -
preserved with gentamicin
8. Stop Solution
A. Solution A - Sample Diluent
preserved with gentamicin (for confirmatory protocol)
B. Solution B - Neutralizing Reagent
preserved with gentamicin (for confirmatory protocol)
Materials Required but Not Provided
1. Distilled or deionized water
2. Wash bottle
3. Precision pipette capable of
dispensing 10 µL.
4. Disposable pipette tips.
Other Components Provided
1. Sample pretreatment tubes (for
confirmatory protocol)
Precautions and Warnings for Users
1. Handle all biological materials
as though capable of
transmitting FeLV.
2. The Positive Control contains
chemically inactivated FeLV.
However, do not assume
complete inactivation.
3. Do not pipette by mouth.
4. There should be no eating,
drinking, or smoking where
specimens or kit reagents are
being handled.
5. Do not expose TMB Substrate
Solution to strong light or any
oxidizing agents.
2
Volume
5
25 mL
2 mL
2 mL
2 x 25 mL
100 mL
25 mL
0.5 mL
0.5 mL
6. Store all reagents at 2°C–8°C.
Bring to room temperature
(15°C–30°C) prior to use, and
return to 2°C–8°C following
use. Precipitation may occur in
Stop Solution. Warm to room
temperature (15°C–30°C) and
mix by swirling before use.
7. All wastes should be properly
decontaminated prior to
disposal.
8. Care should be taken to
prevent contamination of kit
components.
9. Do not use test kit past
expiration date. Do not intermix
components from kits with
different serial numbers.
10. Optimal results will be obtained
by strict adherence to this
protocol. Careful pipetting
and washing throughout this
procedure are necessary
to maintain precision and
accuracy.
11. For veterinary use only.
All reagents must come to
room temperature (15°C–
30°C) before use. Reagents
should be mixed by gentle
swirling.
Specimen Information
1. Serum or plasma, either fresh,
previously frozen or stored at
2°C–8°C, may be used in this
test. Serum or plasma may
be stored for up to 7 days at
2°C–8°C. For longer storage,
sample should be frozen (-20°C
or colder).
2. Whole blood may be
used only in the Screening
Protocol. Whole blood must
be anticoagulated with EDTA,
heparin or citrate and may
be used either fresh or after
refrigeration 2°C–8°C for up to
one week.
3. Care should be taken to ensure
that serum and plasma samples
are cell-free. Hemolyzed
samples may be used. However
highly-hemolyzed samples may
yield a high background.
4. EDTA, heparin or citrate in
plasma will not affect results.
5. Previously frozen or older
samples must be centrifuged
before use.
Preparation of Wash Solution
Occasionally, salt crystals may
form in the Wash Concentrate
upon storage. If this occurs, allow
concentrate to come to room
temperature (15°C–30°C) and mix by
swirling to redissolve crystals before
preparing wash solution.
(e.g. 3 ml of Wash Concentrate plus
27 ml of water for each strip to be
assayed). Diluted wash may be stored
at room temperature (15°C–30°C) for
a period of up to one week. Do not
store diluted wash solution in direct
sunlight.
Screening Protocol
1. Count the number of samples to
be tested plus two wells for the
positive and negative controls.
Remove the required number of
test wells from the bag and
place in the rack provided.
Leave the test wells attached to
one another in a strip (see
illustration A). Record the
positions of samples and
controls on a worksheet.
A.
2. Add 1 drop (50 µL) of Positive
Control to the first test well (see
illustration B) and 1 drop (50 µL)
of Negative Control into the
second test well.
B.
3. Using precision pipette and a
separate pipette tip for each
sample, add 50 µL serum,
plasma or whole blood sample
to appropriate test wells (see
illustration C).
C.
Dilute Wash Concentrate 10 fold
with distilled or deionized water
3
4. Add 1 drop (50 µL) of AntiFeLV:HRPO Conjugate to each
test well (see illustration D). Tap
the side of the rack gently to mix.
F.
D.
9. Read result visually. A
spectrophotometer will provide
inaccurate interpretation for this
test procedure.
5. Incubate for 5 minutes at
room temperature (15°C–30°C).
6. Discard the fluid from the test
wells by inverting into a suitable
receptacle, then strike firmly
onto absorbent paper. Wash
wells with a forceful stream of
diluted wash solution from a
wash bottle. Completely fill all
wells and discard the fluid (see
illustration E).
E.
Strike wells onto absorbent
paper after each wash, taking
care to discard all fluid. Repeat
5 times. After the final wash,
strike wells on absorbent paper
until no additional fluid can be
removed from the wells. Note:
Wells cannot be over washed.
7. Add 2 drops (100 µL) of TMB
Substrate Solution to each
test well (see illustration F).
Incubate for 5 minutes at room
temperature (15°C–30°C).
8. Add 1 drop (25 µL) of Stop
Solution to each test well. Mix
by tapping to terminate the
reaction. Color will be stable for
15 minutes.
4
Results (Screening Protocol)
For the test to be valid, the Positive
Control must develop a distinct
blue color. Negative Control must
be clear or very lightly colored. For
invalid tests, technique may be
suspect and the assay should be
repeated.
Interpretation of Results
Compare the sample color to the
Negative Control color. If the sample
color is less than or equal to the
Negative Control color, then the
sample is classified as negative for
FeLV p27 antigen.
If a sample has more color than
the Negative Control, the sample is
classified as reactive to p27 antigen
and should be retested using the
confirmatory protocol.
Confirmatory Protocol
1. Remove the required number of
test wells from the bag and place
in the rack provided. Allow one well
for the untreated Negative Control.
Note that both the Positive Control
and each sample require two test
wells for the confirmatory assay:
one for the portion treated with
Sample Diluent (Solution A), the
other for the portion treated with
Neutralizing Reagent (Solution B).
Negative control is left untreated.
Record the positions of samples
and controls on a worksheet.
2. Place an equal number of
pretreatment tubes into the rack to
match the layout of positive controls
and samples on the worksheet.
3. Add 1 drop (50 µL) of the Positive
Control into each of two clean
pretreatment tubes. Designate one
pretreatment tube as “A”, the other
pretreatment tube as “B”.
4. Using precision pipette and a
separate pipette tip for each
sample, add 50 µL of each plasma
or serum sample to be confirmed
into each of two clean pretreatment
tubes (do not use whole blood
in this protocol). Designate one
pretreatment tube as “A”, the other
pretreatment tube as “B”.
5. To each “A” tube add 10 µL of
Solution A, mixing each tube after
addition of Solution A by pipetting
the sample in and out 5-10 times.
Using a precision pipette and
a separate pipette tip for each
sample.
6. To each “B” tube add 10 µL of
Solution B, mixing each tube after
addition of Solution B by pipetting
the sample in and out 5-10 times.
Using a precision pipette and
a separate pipette tip for each
sample.
7. Incubate for 5 minutes at room
temperature (15°C–30°C).
8. Review sample positions on the
worksheet.
9. Dispense 1 drop (50 µL) of
Negative Control into the first test
well. Transfer 50 µL of the Positive
Control treated with Solution A into
the second test well. Transfer 50 µL
of the Positive Control treated with
Solution B into the third test well.
10.For each sample, transfer 50
µL of Solution A treated portion
(pretreatment tube “A”) into one
test well; transfer 50 µL of Solution
B treated portion (pretreatment
tube “B”) into a consecutive test
well. Use precision pipette and
separate pipette tips. Continue
until all samples have been
transferred from the pretreatment
tubes to the test wells.
11.Add 1 drop (50 µL) of AntiFeLV:HRPO Conjugate to each
test well. Mix by gentle tapping.
Incubate for 5 minutes at room
temperature (15°C–30°C).
12.Discard the fluid from the test
wells by inverting into a suitable
receptacle, then strike firmly
onto absorbent paper. Wash
wells with a forceful stream of
diluted wash solution from a wash
bottle. Completely fill all wells
and discard the fluid. Strike wells
onto absorbent paper after each
wash, taking care to discard all
fluid. Repeat 5 times. After the final
wash, strike wells on absorbent
paper until no additional fluid can
be removed from the wells. Note:
Wells cannot be over washed.
13.Add 2 drops (100 µL) of TMB Substrate Solution into each test well.
14.Incubate for 5 minutes at
room temperature (15°C–30°C).
15.Add 1 drop (25 µL) of Stop
Solution to each test well. Mix by
tapping to terminate the reaction.
16.Read result visually.
Results (Confirmatory Protocol)
For the confirmatory test to be valid,
the Negative Control must be clear
or very lightly colored. The Solution A
treated portion of the Positive Control
must develop a distinct blue color
5
and the Solution B treated portion
of the Positive Control should have
less than half of the color of Solution
A treated portion. For invalid tests,
technique may be suspect and the
assay should be repeated.
Control and the Solution B treated
sample has not been neutralized
at least 50% (Solution B treated
sample has more than half of the
color of the Solution A treated
sample), then retest the sample
diluted 1:11 in sample diluent
Solution A (e.g. 10 µL sample
+ 100 µL of sample diluent
Solution A). Retest following the
Confirmatory Protocol.
c. If the Solution A treated
sample has more color than
the Negative Control and the
Solution B treated sample has
been neutralized at least 50%
(Solution B treated sample has
less than half the color of the
Solution A treated sample), the
sample is confirmed positive for
FeLV p27 antigen. NOTE: Due to
the nature of FeLV infection, cats
yielding positive results should
be retested in 3 to 4 weeks.
Interpretation of Results
1.If the Solution A treated sample
has less or equal color than
the Negative Control, the
sample is classified as negative,
nonrepeatably reactive for
FeLV p27 antigen.
2.If the Solution A treated sample
has more color than the negative
control, the sample is classified
as repeatably reactive and the
neutralization of the Solution B
treated sample must be assessed.
Complete the classification by
following paragraphs a,b and c
below.
a. If the Solution A treated sample
has less or equal color than the
Solution A treated portion of the
positive control but the Solution
B treated sample has not
been neutralized at least 50%
(Solution B treated sample has
more than half of the color of
the Solution A treated sample),
the sample is classified as
a negative, nonconfirming
sample.
b. If the Solution A treated sample
has more color than the Solution
A treated portion of the Positive
Bibliography
• Hardy, W. D. Jr. 1985. Feline Retroviruses. In
Advances in Viral Oncology, Vol. 5 Ed. Klien,
G. pp. 1-33.
• Hardy, W. D. Jr. 1981. The Feline Leukemia Virus.
J. Amer. Animal Hosp. Assoc. 17: 951-980.
• Hardy, W. D. Jr. 1981. Feline Leukemia Virus
Non-Neoplastic Diseases. J. Amer. Animal
Hosp. Assoc. 17:941-949.
For assistance call:
IDEXX Customer Support: 800-248-2483
IDEXX U.K. Technical Service: 0800-581786
U.S. Vet. License No. 313
Product Code: 5028.01
*PetChek is a trademark or a registered trademark of IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United States and/or
other countries.
©2010 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.
6
Version française
Trousse de détection d'antigène du virus de la leucémie féline
(Dépistage/Confirmation)
Réservé à l’usage vétérinaire.
Appellation et application
Le PetChek* FeLV est une épreuve
immunoenzymatique conçue pour
dépister et confirmer la présence
d'un antigène du virus de la leucémie
féline (FeLV) dans le sérum ou le
plasma des chats. Des échantillons
de sang entier peuvent être utilisés
dans le protocole de dépistage; pour
le protocole de confirmation il est
nécessaire d’utiliser uniquement des
échantillons de sérum ou de plasma.
Description et principes
Cette trousse de détection utilise
des barrettes de 12 cupules
sensibilisées avec des anticorps
anti-p27. Au cours du protocole
de dépistage, les échantillons sont
incubés dans les cupules avec
des anticorps conjugués à de la
peroxydase de raifort (HRPO).
L' antigène p27 de FeLV présent
dans l’échantillon se lie à la fois
à l’anticorps sur la cupule et au
conjugué anticorps:HRPO. Après
lavage des cupules pour en éliminer
les matières non-fixées, on ajoute
le substrat et le chromogène.
La co-loration qui apparaît est
proportionnelle à la quantité
d’antigène p27 présent dans
l’échantillon testé.
Il est cependant possible qu’au
cours du protocole de dépistage,
les échantillons contenant des
matériaux autres que le FeLV (des
anticorps anti-souris de chat, par
exemple) réagissent avec le test.
Par conséquent, tous les résultats
positifs devront être vérifiés à l’aide
du protocole de confirmation.
Le protocole de confirmation
vérifie l’exactitude
des résultats positifs obtenus
au cours du protocole
de dépistage.
Le protocole de confirmation est
identique au protocole de dépistage
à l’exception d’une étape de prétraitement de l’échantillon. Un
échantillon dépisté comme positif
est prétraité avec un anticorps
neutralisant. L’antigène p27, s’il est
présent dans le sérum ou dans le
plasma, va réagir avec les anticorps,
se liant aux sites de fixation
disponibles. L’échantillon ainsi
prétraité est alors transféré dans
une cupule et analysé en suivant
le protocole de confirmation. Étant
donné que la plupart des sites de
fixation sur l’antigène sont déjà liés,
l’échantillon va produire des valeurs
d’absorption nettement réduites.
Parallèlement, l’échantillon est
également prétraité avec un diluant
inerte (ne réagissant pas contre la
p27) et testé en même temps que
l’échantillon neutralisé. L’échantillon
est considéré comme positif si
l’anticorps neutralisant réduit la
coloration de 50% ou plus comparé
à la coloration de l’échantillon traité
avec un diluant inerte.
7
Réactifs Volume
1. Microplaques sensibilisées avec des
monoclonaux anti-FeLV
2. Conjugué anti-FeLV: HRPO (agent de conservation: gentamicine)
3. Contrôle positif (agent de conservation: gentamicine)
4. Contrôle négatif (agent de conservation: gentamicine)
5. Solution de substrat TMB
7. Solution de lavage concentrée 10 fois
(agent de conservation: gentamicine)
8. Solution d’arrêt A. Solution A - Diluant d’échantillon
(agent de conservation: gentamicine)
(pour le protocole de confirmation)
B. Solution B - Réactif neutralisant
(agent de conservation: gentamicine)
(pour le protocole de confirmation)
5
Matériel nécessaire mais non fourni
1. Eau distillée ou déminéralisée
2. Flacon de lavage
3. Pipette de précision pouvant
distribuer 10 μl
4. Embouts jetables
5.
6.
Autres composants fournis
1. Tubes de prétraitement
d’échantillon (pour le protocole
de confirmation)
Mises en garde et précautions d’emploi
1. Manipuler toutes les substances
biologiques comme étant
susceptibles de transmettre le
FeLV.
2. Bien que le contrôle positif
contienne du FeLV ayant été
chimiquement inactivé, il ne
faudra pas supposer une
inactivation complète.
3. Ne pas pipetter à la bouche.
4. Toute consommation d’aliments,
de boissons ou de tabac
est interdite dans la zone de
8
7.
8.
9.
25 ml
2 ml
2 ml
2 x 25 ml
100 ml
25 ml
0,5 ml
0,5 ml
manipulation des échantillons et
des réactifs de la trousse
Ne pas exposer la solution de
TMB à une lumière vive ni à un
agent oxydant.
Entreposer tous les réactifs
entre 2°C et 8°C . Amener
à la température ambiante
(15°C à 30°C ) avant l’emploi
et remettre entre 2°C et 8°C
après emploi. Une précipitation
peut apparaître dans la solution
d'arrêt. Amener le flacon à la
température ambiante (15°C à
30°C) et inverser doucement
avant usage.
Décontaminer tous les résidus
avant d’en disposer.
Prendre toutes les précautions
nécessaires pour éviter la
contamination des composants
de la trousse.
Ne pas utiliser les composants
après leur date de péremption
et ne pas mélanger des
composants provenant de
trousses ayant différents
numéros de lot.
10. Pour obtenir les meilleurs
résultats possibles, il faudra
se conformer strictement
à ce protocole opératoire.
Pour assurer la précision et
l’exactitude de ce test, procéder
à un pipetage et lavage précis
tout au long du protocole
opératoire.
11. Réservé à l'usage vétérinaire.
Amener tous les réactifs à
la température ambiante
(15°C à 30°C) avant l’emploi.
Les mélanger en les inversant
doucement à la main.
Échantillons
1. Du sérum ou du plasma, soit
frais ou ayant été précédemment
congelé ou entreposé entre 2°C
et 8°C peut être utilisé pour ce
test. Le sérum ou le plasma peut
être conservé un maximum de 7
jours entre 2°C et 8°C. Pour une
conservation prolongée au-delà
de ce délai, l’échantillon devra
être congelé (-20°C ou moins).
2. Du sang entier peut être utilisé
seulement avec le protocole de
dépistage. Le sang entier devra
être anti-coagulé avec de l’acide
éthylène­diamino-tétraacétique
(EDTA), de l’héparine ou du
citrate et peut être utilisé soit
frais ou après réfrigération (2°C
à 8°C) pour un maximum d’une
semaine.
3. Il faudra prendre toutes les
précautions nécessaires pour
s’assurer que les échantillons
de sérum et de plasma sont
exempts de cellules. Des
échantillons hémolysés peuvent
être utilisés. Des échantillons
fortement hémolysés peuvent
cependant donner un bruit de
fond élevé.
4. La présence d’EDTA, d’héparine
ou de citrate dans le plasma
n’affecte pas les résultats.
5. Les échantillons moins récents ou
précédemment congelés devront
être centrifugés avant l'usage.
Préparation de la solution de lavage
Lors de l'entreposage, des cristaux
de sel peuvent à l’occasion se
former dans la solution de lavage
concentrée. Dans ce cas, amener la
solution de lavage concentrée à la
température ambiante (15°C à 30°C)
et la mélanger en l'agitant pour
assurer la dissolution des cristaux
avant la préparation de la dilution.
Diluer la solution de lavage
concentrée au 1:10ème dans de
l’eau distillée ou déminéralisée
(diluer par exemple 3 ml de solution
de lavage concentrée avec 27 ml
d’eau par barrette). La solution de
lavage peut être conservée à la
température ambiante (15°C à 30°C)
pendant une semaine au maximum.
Ne pas exposer la solution de lavage
diluée au soleil.
9
Protocole de dépistage
1. Préparer le nombre de cupules
nécessaires à la réalisation du test:
une cupule pour chaque échantillon,
une pour le contrôle positif et une
pour le contrôle négatif. Retirer du sac
le nombre de cupules nécessaires et
les placer sur le porte-barrettes fourni.
Les cupules doivent rester attachées
les unes aux autres sur la barrette (voir
illustration A). Noter la position des
échantillons et des contrôles sur une
feuille de travail.
2. Ajouter 1 goutte (50 µl) de contrôle
positif dans la première cupule du
test (voir illustration B) et 1 goutte
(50 µl) de contrôle négatif dans la
seconde cupule du test.
3. A l’aide de la pipette de précision
et en utilisant un embout neuf pour
chaque échantillon, distribuer 50 µl
de sérum, plasma ou sang entier
dans les cupules appropriées (voir
illustration C).
4. Ajouter 1 goutte (50 µl) de conjugué
HRPO: anti-FeLV à chaque cupule
(voir illustration D). Taper doucement
sur les côtés du porte-barrettes
pour mélanger.
5. Incuber 5 minutes à la
température ambiante (15°C à 30°C).
6. Rejeter le liquide contenu dans
les cupules: les retourner dans
un récipient approprié et les taper
fermement sur du papier absorbant.
Laver les cupules avec un jet de
solution de lavage diluée à l’aide du
flacon de lavage. Remplir entièrement
toutes les cupules et rejeter le liquide
(voir illustration E). Taper les cupules
sur un papier absorbant après
chaque lavage, en prenant soin de
rejeter tout le liquide. Répéter cette
opération 5 fois. Après le dernier
lavage, taper les cupules sur un
papier absorbant pour en éliminer
tout liquide. Remarque: les cupules
ne peuvent jamais être trop lavées.
10
A.
B.
C.
D.
E.
Pour que le test soit valide, le
contrôle positif doit prendre une
col­oration bleu distincte. Le contrôle
négatif doit être transparent ou très
légèrement coloré. Si le test n’est
pas validé, on peut suspecter une
erreur technique et il faudra répéter
l’analyse.
Interprétation des résultats
Comparer la couleur de l’échantillon
à celle du contrôle négatif. Si la coloration développée par l’échantillon
est plus pâle ou équivalente à celle
du contrôle négatif, l’échantillon
est alors considéré négatif pour
l’antigène FeLV p27.
Si un échantillon présente une
coloration plus foncée que celle du
contrôle négatif, l’échantillon est
considéré comme étant réactif à
l’antigène p27 et devra être retesté
avec le protocole de confirmation.
PetChe
Résultats (Protocole de dépistage)
F.
IDEXX
7. Ajouter 2 gouttes (0,10 ml) de
solution de substrat TMB pour
chaque cupule du test (voir
illustration F). Incuber 5 minutes à
la température ambiante (15°C à
30°C).
8. Ajouter 1 goutte (25 µl) de
solution d’arrêt dans chaque
cupule. Mélanger et taper, pour
arrêter la réaction. La coloration
sera stable pendant 15 minutes.
9. Lecture visuelle des résultats.
Un spectrophotomètre fournirait
une interprétation inexacte pour
cette procédure.
Protocole de confirmation
1. Retirer de leur emballage le
nombre de cupules requises et
les placer sur le porte-barrettes.
Compter une cupule pour le
contrôle négatif non traité.
Compter 2 cupules pour chaque
échantillon et pour le contrôle
positif: une pour la portion traitée
au diluant d’échantillon (Solution
A), l’autre pour la portion traitée
au réactif neutralisant (Solution
B). Le contrôle négatif ne doit pas
être traité. Noter la position des
échantillons et des contrôles sur
une feuille de travail.
2. Placer le même nombre de
tubes de prétraitement dans le
portoir pour correspondre à la
disposition des contrôles positifs
et des échantillons sur la feuille de
travail.
3. Ajouter 1 goutte (50 µl) de
contrôle positif dans chacune des
deux éprouvettes propres de prétraitement. Identifier un des tubes
de prétraitement par la lettre "A" et
l’autre par "B".
4. À l'aide de la pipette de précision
et en utilisant un embout neuf
pour chaque échantillon, ajouter
50 µl de chaque échantillon de
plasma ou de sérum à confirmer,
dans chacun des 2 tubes propres
de prétraitement. (Ne pas utiliser
de sang entier dans ce protocole.)
Marquer l'un des tubes avec la
lettre "A", l'autre avec la lettre "B".
11
5. Dans chaque tube "A", ajouter
10 µl de solution A, et mélanger
le contenu de chaque tube
après l'addition de la solution
A, par pipettage répétitif à la
pipette 5 à 10 fois. Utiliser un
embout différent pour chaque
échantillon.
6. Dans chaque tube "B", ajouter
10 µl de la solution B, et
mélanger le contenu de chaque
tube après l’addition de solution
B par pipettage répétitif à la
pipette 5 à 10 fois. Utiliser un
embout différent pour chaque
échantillon.
7. Incuber 5 minutes à la température
ambiante (15°C à 30°C).
8. Vérifier la position des
échantillons sur la feuille de
travail.
9. Distribuer 1 goutte (50 µl) de
contrôle négatif dans la
première cupule. Transférer 50
µl du contrôle positif traité avec
la solution A dans la seconde
cupule. Transférer 50 µl du
contrôle positif traité avec la
solution B dans la troisième
cupule.
10. Pour chaque échantillon,
transférer 50 µl de solution "A"
prétraité (tube "A" prétraité)
dans une cupule; transférer
50 µl de solution "B" prétraité
(tube "B" prétraité) dans la
cupule sui-vante. Utiliser, à cet
effet, la pipette de précision
en changeant chaque fois
l'embout. Continuer jusqu'à ce
que tous les échantillons ont été
transférés des tubes prétraités
aux cupules.
11. Ajouter 1 goutte (50 µl) de
conjugué HRPO: anti-FeLV
dans chaque cupule. Mélanger
en tapant légèrement. Incuber
5 minutes à la température
ambiante (15°C à 30°C).
12
12. Disposer du liquide contenu
dans les cupules en inversant
dans un récipient approprié,
puis les taper fermement sur
un papier absorbant. Laver
les cupules avec un jet de
solution de lavage diluée à l’aide
du flacon de lavage. Remplir
entièrement toutes les cupules
et rejeter le liquide. Taper les
cupules sur un papier absorbant
après chaque lavage, en prenant
soin de se débarrasser de tout le
liquide. Répéter cette opération
5 fois. Après le dernier lavage,
taper les cupules sur du papier
absorbant pour en éliminer tout
liquide. Remarque: les cupules
ne peuvent jamais être trop
lavées.
13. Ajouter 2 gouttes (100 µl) de
solution substrat TMB dans
chaque cupule.
14. Incuber 5 minutes à la température
ambiante (15°C à 30°C).
15. Ajouter 1 goutte (25 µl) de
solution d’arrêt dans chaque
cupule. Mélanger en tapant pour
arrêter la réaction.
16. Procéder à la lecture visuelle
des résultats.
Résultats (Protocole de confirmation)
Pour que le test de confirmation
soit valable, il faut que le contrôle
négatif soit transparent ou très
légèrement coloré. La portion
du contrôle positif traitée avec
la solution A doit prendre une
coloration bleu distincte et la portion
du contrôle positif traitée avec
la solution B doit présenter une
coloration deux fois moins intense
que celle traitée avec la solution
A. Si le test est invalide, on peut
suspecter une erreur technique et il
faudra répéter l’analyse.
1/11ème dans le diluant solution
A (par ex. 10 µl d'échantillon +
100 µl de diluant solution A).
Recommencer le test en suivant
le protocole de confirmation.
Interprétation des résultats
1.Si la coloration de l’échantillon
traité par la solution A est d'une
intensité inférieure ou égale à celle
du contrôle négatif, l'échantillon
est considéré comme négatif, non
réactif de manière reproductible
avec l'antigène p27 du FeLV.
c.Lorsque la coloration de
l'échantillon traité par la
solution A est d'une intensité
supérieure à celle du contrôle
négatif traité par la solution
A et que l'échantillon traité
par la solution B n'a pas été
neutralisé d'au moins 50% (la
coloration de l'échantillon traité
par la solution B correspond à
moins de la moitié de celle de
l'échantillon traité par la solution
A), l'échantillon est confirmé
positif pour l'antigène p27 du
FeLV. REMARQUE: En raison
de la nature de l'infection du
FeLV, les chats donnant des
résultats positifs devraient être
testés de nouveau après 3 ou 4
semaines.
2.Si la coloration de l’échantillon
traité par la solution A est d'une
intensité supérieure à celle du
contrôle négatif, l'échantillon
est considéré comme réactif
de manière reproductible et la
neutralisation de l'échantillon traité
par la solution B doit être évaluée.
Pour terminer la caractérisation,
suivre les paragraphes a, b et c
ci-dessous.
a.Lorsque la coloration de
l'échantillon traité par la solution
A est d'une intensité inférieure
ou égale à celle du contrôle
positif traité par la solution A
mais que l'échantillon traité
par la solution B n'a pas été
neutralisé d'au moins 50%
(l'intensité de la coloration de
l'échantillon traité par la solution
B correspond à plus de la moitié
de celle de l'échantillon traité
par la solution A), l'échantillon
est considéré comme négatif,
donc non confirmé.
b.Lorsque la coloration de
l'échantillon traité par la solution
A est d'une intensité supérieure
à celle du contrôle positif
traité par la solution A et que
l'échantillon traité par la solution
B n'a pas été neutralisé d'au
moins 50% (la coloration de
l'échantillon traité par la solution
B correspond à plus de la moitié
de celle de l'échantillon traité
par la solution A), il faudra tester
à nouveau l'échantillon dilué au
Références bibliographiques
•
•
•
Hardy, W. D. Jr. 1985. Feline Retroviruses.
In Advances in Viral Oncology, Vol. 5 Ed.
Klien, G. pp. 1-33.
Hardy, W. D. Jr. 1981. The Feline
Leukemia Virus. J. Amer. Animal Hosp.
Assoc. 17: 951-980.
Hardy, W. D. Jr. 1981. Feline Leukemia
Virus Non-Neoplastic Diseases. J. Amer.
Animal Hosp. Assoc. 17:941-949.
13
Pour plus d'informations, appeler le service technique d' IDEXX
- au 1 800-248-2483, pour le Canada
- au 00-800-1234-3399, pour les autres pays
Perm. vét des É.-U. N°. 313
Code de produit 5028.01
*PetChek est une marque de commerce ou une marque déposée d'IDEXX Laboratories, Inc. ou ses filiales, aux ÉtatsUnis et/ou dans autres pays.
©2010 IDEXX Laboratories, Inc. Tous droits réservés.
14
Versione Italiana
Kit di Ricerca dell'Antigene del Virus della Leucemia Felina
(Screening/Di conferma)
Esclusivamente per uso veterinario
Nome e utilizzo designato
PetChek* FeLV è un saggio
immunoenzimato progettato per
effettuare lo screening e confermare
la presenza dell'antigene del virus
della leucemia felina (FeLV) nel siero
o nel plasma di felini. Nel Protocollo di
Screening si possono usare campioni
di sangue intero. Nel Protocollo
di Conferma è necessario usare
campioni di siero o plasma.
Descrizione e principi
Questo kit di analisi prevede l’uso di
anticorpi specifici per l’antigene p27
FeLV. I pozzetti di microtitolazione,
che sono disposti su strisce da 12
pozzetti, vengono rivestiti con tali
anticorpi.
Nel protocollo di screening, i campioni
vengono incubati nei pozzetti di
analisi con anticorpi coniugati con
perossidasi di rafano (HRPO).
Gli eventuali antigeni presenti nel
campione si legheranno sia con
l’anticorpo presente nel rivestimento
del pozzetto di analisi che con
l’anticorpo coniugato con perossidasi
di rafano. Il materiale che non si è
legato viene lavato via dai pozzetti,
quindi vengono aggiunti il substrato
ed il cromogeno. Lo sviluppo di colore
che si verifica successivamente è
proporzionale alla quantita di antigene
FeLV gruppo-specifico (p27) presente
nel campione sottoposto all’analisi.
Tuttavia, è possibile che nel protocollo
di screening i campioni che contengono materiale non-FeLV (come ad
esempio gli anticorpi felini anti-topo)
reagiscano con il kit di analisi. Per
questa ragione, tutti i risultati positivi
dovrebbero essere controllati con il
protocollo di conferma.
Il protoccolo di conferma controlla
la precisione dei risultati positivi
ottenuti nel protocollo di screening.
Il protocollo di conferma è identico
al protocollo di screening, ad
eccezione dell’aggiunta della fase
di pretrattamento del campione.
Un campione risultato positivo allo
screening viene pretrattato con un
anticorpo neutralizzante. L’antigene
eventualmente presente nel siero o
nel plasma reagira con gli anticorpi,
formando un complesso con i siti di
legame disponibili. Questo campione
così trattato viene quindi trasferito in
un pozzetto di analisi e sottoposto al
protocollo di conferma. Dal momento
che la maggior parte dei siti di legame
dell’antigene sono già in forma di
complesso, il campione produrrà
valori di assorbanza sostanzialmente
ridotti. A scopo comparativo, il
campione viene anche trattato con
un diluente non reattivo e sottoposto
ad analisi contemporaneamente al
campione neutralizzato. Il campione
viene considerato positivo qualora
l’anticorpo neutralizzante riduca la
formazione di colore in misura pari o
superiore al 50% rispetto al campione
trattato con il diluente non reattivo.
15
Reagenti
Volume
1. Piastre rivestiti di anticorpo anti-FeLV 2. Anticorpo anti-FeLV coniugato con
perossidasi di rafano e con gentamicina
come agente conservante
3. Controllo positivo, con gentamicina come agente conservante
4. Controllo negativo, con gentamicina
come agente conservante
5. Soluzione substrato TMB
7. Soluzione di lavaggio concentrata (10X),
con gentamicina come agente conservante
8. Soluzione bloccante
A.Soluzione A - Diluente per campione
con gentamicina come agente conservante
(per il procedimento di conferma)
B.Soluzione B - Reagente neutralizzante
con gentamicina come agente conservante
(per il procedimento di conferma)
5
25 ml
Materiali necessari ma non forniti
1. Acqua distillata o deionizzata.
2. Flacone di lavaggio.
3. Pipetta di precisione in grado di
dispensare 10 μl.
4. Puntali monouso per pipette.
Altri componenti forniti
1. Provette di pretrattamento
campione (per il procedimento
di conferma).
Misure di precauzione ed avvertenze
1. Maneggiare tutti i materiali
biologici come se fossero in
grado di trasmettere il FeLV.
2. Il controllo positivo contiene
FeLV inattivato mediante
trattamento chimico. Ciò
nonostante, non si deve dare
per scontata la completa
inattivazione.
3. Non pipettare con la bocca.
4. Mangiare, bere e fumare
dovrebbero essere vietati
laddove vengano impiegati
16
2 ml
2 ml
2 x 25 ml
100 ml
25 ml
0,5 ml
0,5 ml
campioni o reagenti del kit.
5. Non esporre le Soluzioni
TMB a luce forte o ad alcun
agente ossidante.
6. Conservare tutti i reagenti ad
una temperatura di 2°C–8°C.
Portarli a temperatura ambiente
(15°C–30°C) prima dell’uso e
riportarli quindi a 2°C–8°C una
volta usati. Ci può essere la
formazione di un precipitato
nella soluzione di fissaggio. Una
volte raggiunta la temperatura
ambiente (15°C–30°C) si consiglia
di capovolgerla fino ad ottenere
una soluzione limpida.
7. Tutti i rifiuti dovrebbero essere
adeguatamente decontaminati
prima di essere eliminati.
8. Si dovrebbe prestare la massima
attenzione al fine di evitare
la contaminazione dei
componenti del kit.
9. Non si deve usare il kit di analisi
oltre la data di scadenza. Non si
possono mescolare componenti
appartenenti a kit con numeri di
lotto differenti.
10. Osservando scrupolosamente
il presente protocollo si
otterranno ottimi risultati. Un
pipettamento ed un lavaggio
meticolosi durante tutta questa
procedura sono necessari al
fine di mantenere precisione ed
accuratezza.
11. Esclusivamente per uso
veterinario.
Tutti i reagenti devono essere
portati a temperatura ambiente
(15°C–30°C) prima dell’ uso.
I reagenti dovrebbero essere
mescolati delicatamente
mediante un movimento rotatorio.
(2°C–8°C) sino ad un massimo
di una settimana.
3. Si dovrebbe prestare la
massima attenzione al fine
di garantire che i campioni
di siero e di plasma siano
privi di componenti cellulari.
E’ possibile usare campioni
emolizzati. Tuttavia, campioni ad
elevato livello di emolizzazione
possono dare un background
elevato.
4. L’ EDTA, l’ eparina od il citrato
nel plasma non influenzano
i risultati.
5. Campioni congelati in
precedenza o più vecchi
devono essere sottoposti a
centrifugazione prima di
essere usati.
Informazioni sul campione
Preparazione della soluzione di lavaggio
1. Ai fini della presente analisi,
è possibile usare il siero o
il plasma, sia freschi, che
congelati in precedenza o
conservati ad una temperatura
di 2°C–8°C. E’ possibile
conservare il siero o il plasma
per un periodo massimo di
7 giorni ad una temperatura
di 2°C–8°C. In caso di una
conservazione più lunga, i
campioni dovrebbero essero
congelati (ad una temperatura
uguale o inferiore a -20°C).
2. E’ possibile usare il sangue
intero soltanto nel protoccolo
di screening della procedura
no. 1, lettura visiva. Il sangue
intero deve essere reso
fluido mediante l’aggiunta di
anticoagulanti quali EDTA,
eparina o citrato e può
essere usato sia fresco che
dopo essere stato refrigerato
A volte, durante la conservazione
è possibile che nel concentrato di
lavaggio si formino dei cristalli di sale.
Qualora si verifichi tale problema,
portare il concentrato a temperatura
ambiente (15°C–30°C) e mescolarlo
facendolo roteare in modo tale da far
sciogliere i cristalli prima di preparare
la soluzione di lavaggio.
Diluire 10 volte la soluzione di
lavaggio concentrata con acqua
distillata o deionizzata (ad esempio,
3 ml di soluzione di lavaggio
concentrata più 27 ml di acqua per
ciascuna striscia da sottoporre ad
analisi). E’ possibile conservare il
concentrato di lavaggio diluito a
temperatura ambiente (15°C–30°C)
per un periodo massimo di una
settimana. Non conservare la
17
soluzione di lavaggio diluita alla luce
diretta del sole.
A.
Protocollo di screening
C.
D.
PetChe
18
B.
IDEXX
1. Contare il numero di campioni
da sottoporre ad analisi più due
pozzetti per i controlli negativo
e positivo. Togliere quindi
dal sacchetto il numero di
pozzetti necessari per l'analisi e
collocarli nell'apposito supporto
per pozzetti. Lasciare i pozzetti
per analisi l’uno attaccato
all’altro nella striscia (vedere
l’illustrazione A). Annotare le
posizioni dei campioni e dei
controlli su un foglio dati.
2. Aggiungere 1 goccia (50 µl)
di controllo positivo nel primo
pozzetto per analisi (vedere
l’illustrazione B) ed 1 goccia
(50 µl) di controllo negativo nel
secondo pozzetto per analisi.
3. Usando la micropipetta e un
diverso puntale per ciascun
campione, aggiungere 50 µl di
siero, plasma o sangue intero
negli apposisispi pozzetti per
analisi (vedi figura C).
4. Aggiungere 1 goccia (50 µl) di
anticorpo anti-FeLV coniugato
con perossidasi di rafano in
ciascun pozzetto per analisi
(vedere l’illustrazione D).
Picchiettare con delicatezza il
lato del supporto in modo da
favorire la miscelazione.
5. Incubare per 5 minuti a
temperatura ambiente
(15°C–30°C).
6. Eliminare il liquido dai pozzetti
per analisi rovesciandolo
dentro un contenitore adatto,
quindi dare dei colpetti
leggeri ma decisi ai pozzetti
sopra una carta assorbente.
Lavare i pozzetti con un getto
E.
Risultati (Protocollo di Screening)
F.
IDEXX
PetChe
energico di soluzione di
lavaggio diluita preparata in un
flacone di lavaggio. Riempire
completamente tutti i pozzetti
ed eliminare il liquido (vedere
l’illustrazione E). Dare dei
leggeri colpetti ai pozzetti con la
carta assorbente dopo ciascun
lavaggio, prestando attenzione
ad eliminare tutto il fluido.
Ripetere tale operazione 5 volte.
Dopo il lavaggio finale, dare
dei leggeri colpetti ai pozzetti
con carta assorbente finchè da
tali pozzetti non fuoriesce più
alcun fluido. Nota: i pozzetti non
possono essere sottoposti ad
un lavaggio eccessivo.
7. Aggiungere 2 gocce (100 µl)
di soluzione substrato TMB
in ciascun pozzetto (vedere
l’illustrazione F). Incubare per 5
minuti a temperatura ambiente
(15°C–30°C).
8. Aggiungere 1 goccia (25 µl) di
soluzione bloccante in ciascun
pozzetto d'analisi. Mescolare
dando dei leggeri colpetti in
modo da porre termine alla
reazione. Il colore rimarrà
stabile per 15 minuti.
9. Effettuare la lettura visiva
dei risultati. Per questo
tipo di procedura di analisi,
l’interpretazione fornita da uno
spettrofotometro è imprecisa.
Affinché l’analisi possa essere
considerata valida, il controllo positivo
deve sviluppare un colore blu netto.
Il controllo negativo deve essere
trasparente o colorato in maniera
estremamente leggera. Per analisi non
attendibili, è possibile che sia stata
seguita una metodica inappropriata e
si dovrebbe ripetere l’analisi.
Interpretazione dei risultati
Confrontare il colore del campione
con il colore del controllo negativo.
Qualora il colore del campione sia
meno intenso od uguale al colore
del controllo negativo, il campione
deve essere classificato negativo per
l’antigene p27 FeLV.
Qualora un campione presenti una
colorazione più intensa del controllo
negativo, il campione deve essere
classificato reattivo all’antigene
p27 e deve essere sottoposto ad
una nuova analisi per mezzo del
procedimento di conferma.
Protocollo di conferma
1. Togliere dal sacchetto il numero
di pozzetti necessari per l’analisi e
collocarli nell'apposito supporto.
Considerare che per il non trattati
controllo negativo non trattato è
necessario un pozzetto. Si prega
di notare che ai fini dell’analisi
di conferma, il controllo positivo
ed ogni campione richiedono
ciascuno due pozzetti per analisi:
uno per la parte trattata con il
diluente per campione (soluzione
A) e l’altro per la parte trattata
con il reagente neutralizzante
(soluzione B). Il controllo negativo
rimane non trattato. Annotare
le posizioni dei campioni e dei
19
controlli su un foglio dati.
2. Collocare nel portaprovette le
provette di pretrattamento in
numero uguale a quello dei
campioni e dei controlli positivi
rispettando esattamente la
sequenza riportata sul foglio dati.
3. Aggiungere 1 goccia (50
µl) di controllo positivo in
ciascuna delle due provette di
pretrattamento pulite. Assegnare
quindi ad una provetta di
pretrattamento l’identificazione
di “A” e all’altra provetta di
pretrattamento quella di “B”.
4. Usando la micropipetta e un
puntale diverso per ciascun
campione, aggiungere 50 µl di
plasma o siero da confermare
in due provette pulite per
pretrattamento (non usare
sangue intero in questa fase).
Contrassegnare una provetta
di pretrattamento con A e l'altra
provetta di pretrattamento con B.
5. Aggiungere 10 µl di soluzione
A a ciascuna provetta “A”, e
dopo aver aggiunto la soluzione
A mescolare il contenuto di
ciascuna provetta pipettando il
campione con la pipetta da 5
a 10 volte. Usando un pipetta
di precisione e un puntale per
pipetta per ciascun campione
6. Aggiungere 10 µl di soluzione
B a ciascuna provetta “B”, e
dopo aver aggiunto la soluzione
B mescolare il contenuto di
ciascuna provetta pipettando il
campione con la pipetta da 5
a 10 volte. Usando un pipetta
di precisione e un puntale per
pipetta per ciascun campione.
7. Incubare per 5 minuti a
temperatura ambiente
(15°C–30°C).
8. Controllare le posizioni dei
20
campioni sul foglio dati.
9. Distribuire 1 goccia (50 µl) di
controllo negativo nel primo
pozzetto per analisi. Trasferire
50 µl del controllo positivo trattato
con la soluzione A nel secondo
pozzetto per analisi. Trasferire 50
µl del controllo positivo trattato
con la soluzione B nel terzo
pozzetto per analisi.
10. Di ciascun campione, trasferire
50 µl di siero trattato con
soluzione A (provetta di
pretrattamento A) in un pozzetto
per analisi; trasferire 50 µl di
siero trattato con soluzione B
(provetta di pretrattamento B) nel
successivo pozzetto per analisi.
Usare la micropipetta e puntali
diversi, procedere finché tutti i
campioni sono stati trasferiti dalle
provette di pretrattamento ai
pozzetti per analisi.
11. Aggiungere 1 goccia (50 µl) di
anticorpo anti-FeLV coniugato
con HRPO in ciascun pozzetto.
Picchiettare con delicatezza
in modo da favorire la
miscelazione. Incubare per 5
minuti a temperatura ambiente
(15°C–30°C).
12. Eliminare il liquido dai pozzetti
rovesciandolo dentro un
contenitore adatto, quindi dare
dei colpetti leggeri ma decisi
ai pozzetti sopra una carta
assorbente. Lavare i pozzetti con
un getto energico di soluzione
di lavaggio diluita preparata in
un flacone di lavaggio. Riempire
completamente tutti i pozzetti
ed eliminare il liquido. Dare dei
leggeri colpetti ai pozzetti sopra
la carta assorbente dopo ciascun
lavaggio, prestando attenzione
ad eliminare tutto il fluido.
Ripetere tale operazione 5 volte.
Dopo il lavaggio finale, dare dei
13.
14.
15.
16.
leggeri colpetti ai pozzetti sopra
la carta assorbente finché da
tali pozzetti non sia uscito tutto
il liquido. Nota: i pozzetti non
possono essere sottoposti ad un
lavaggio eccessivo.
Aggiungere 2 gocce (100 µl)
di soluzione substrato TMB in
ciascun pozzetto per analisi.
Incubare per 5 minuti a
temperatura ambiente
(15°C–30°C).
Aggiungere 1 goccia (25 µl) di
soluzione bloccante in ciascun
pozzetto. Mescolare dando dei
leggeri colpetti in modo da porre
termine alla reazione.
Effettuare la lettura visiva dei
risultati.
Risultati (Protocollo di conferma)
Affinché l’analisi di conferma
possa essere considerata valida,
il controllo negativo deve essere
trasparente o colorato in maniera
estremamente leggera. La parte
di controllo positivo trattata con
la soluzione A deve sviluppare
un colore blu netto e la parte di
controllo positivo trattata con la
soluzione B deve avere invece una
colorazione di intensità inferiore
alla meta di quella della parte
trattata con la soluzione A. In
caso di risultati non attendibili,
è possibile che sia stata seguita
una metodica non corretta e si
dovrebbe ripetere l’analisi.
Interpretazione dei risultati
1. Qualora il campione trattato con la
soluzione A abbia una colorazione
di intensitá uguale o inferiore al
controllo negativo, il campione
deve essere classificato negativo, e
non reattivo in modo riproducibile
per l’antigene p27 FeLV.
2. Se il campione ha una
colorazione più intensa di
quella del campione negativo,
il campione viene considerato
ripetibilmente reattivo e quindi si
deve valutare la neutralizzazione
del campione dopo trattamento
con la soluzione B. La
classificazione sarà completata
seguendo le indicazioni del
paragrafi a, b e c seguenti.
a. Se il campione trattato con la
soluzione A ha una colorazione
di intensità uguale o inferiore
a quella del controllo positivo
ma il campione trattato con
la soluzione B non è stato
neutralizzato almeno per il 50%
(il campione trattato con la
soluzione B ha una colorazione
più intensa della metà dalla
colorazione del campione trattato
con la soluzione A), il campione
si classifica come campione
negativo in quanto non soddisfa il
Protocollo di Conferma.
b. Se il campione trattato con la
soluzione A ha una colorazione
di intensità superiore al campione
Positivo di controllo trattato con
la soluzione A e il campione
trattato con la soluzione B non è
stato neutralizzato almeno per il
50% (il campione trattato con la
soluzione B ha una colorazione
più intensa della metà dalla
colorazione del campione
trattato con la soluzione A), al
deve rianalizzare il campione
diluendolo 1:11 con la Soluzione
A di diluente dei campioni (eg.:
10 mcl di campione + 100 mcl
di Soluzione A di diluente dei
campioni). Rianalizzare secondo
21
il Protocollo di Conferma.
c. Qualora il campione trattato
con la soluzione A abbia una
colorazione più intensa del
controllo negativo e il campione
trattato con la soluzione B sia
stato neutralizzato almeno al
50% (il campione trattato con la
soluzione B ha una colorazione
di intensitá inferiore alla metá
di quella del campione trattato
con la soluzione A), vi è quindi
la conferma che il campione è
positivo per l’antigene p27 FeLV.
Bibliografia
•
•
•
Hardy, W. D. Jr. 1985. Feline Retroviruses.
In Advances in Viral Oncology, Vol. 5 Ed.
Klien, G. pp. 1-33.
Hardy, W. D. Jr. 1981. The Feline Leukemia Virus. J. Amer. Animal Hosp. Assoc.
17: 951-980.
Hardy, W. D. Jr. 1981. Feline Leukemia
Virus Non-Neoplastic Diseases. J. Amer.
Animal Hosp. Assoc. 17:941-949.
NOTA: a causa della natura
dell’infezione FeLV, i gatti che
danno risultati positivi dovrebbero
essere sottoposti ad una nuova
analisi entro 3 o 4 settimane.
Per l’assistenza tecnica,
00-800-1234-3399
*PetChek é un marchio di proprietà di, e/o registrato da, IDEXX Laboratories, Inc. o di suoi associate e protetto negli
Stati Uniti e/o in altri paesi.
©2010 IDEXX Laboratories, Inc. Tutti i diritti sono riservati.
22
Versión Española
Kit para la detección de Antígeno del Virus de la Leucemia Felina
(Detección y confirmación)
Para uso veterinario exclusivo.
Nombre y uso propuesto
PetChek* FeLV es un inmunoanálisis
enzimático diseñado para detectar y
confirmar la presencia del antígeno
del virus de la leucemia felina (FeLV)
en suero o plasma de felinos.
Pueden usarse muestras de sangre
entera en el protocolo de detección,
pero es necesario utilizar muestras
de suero o plasma en el protocolo
de confirmación.
Descripción y principios
Este kit de análisis utiliza pocillos de
microtitulación, organizados en tiras
de 12, recubiertos de anticuerpos
específicos para el p27 del FeLV.
En el protocolo de detección,
las muestras se incuban en los
pocillos de análisis con anticuerpos
conjugados con peroxidasa de
rábano (HRPO). Los antígenos de
FeLV presentes en la muestra se unen
con los anticuerpos que tapizan el
pocillo de análisis y con el conjugado
anticuerpo:HRPO. El material no unido
se elimina de los pocillos con un
lavado; luego se agrega un sustrato y
un cromógeno. La intensidad del color
que se forma es proporcional a la
concentración del antígeno específico
p27 del FeLV presente en la muestra
de análisis.
Sin embargo, en el protocolo de
detección, es posible que ciertas
muestras que contienen material
no relacionado con el FeLV (como
por ejemplo, anticuerpos felinos
anti-ratón) reaccionen con el
kit de análisis. Por este motivo,
cualquier resultado positivo debe
verificarse mediante el protocolo de
confirmación.
El protocolo de confirmación
verifica la exactitud de los
resultados positivos obtenidos con
el protocolo de detección.
El protocolo de confirmación
es idéntico al protocolo de
detección, excepto en un paso de
pretratamiento de la muestra. Una
muestra clasificada como positiva
se trata previamente con anticuerpo
neutralizante. Los antígenos
presentes en el suero o plasma
reaccionan con los anticuerpos,
formando complejos en los sitios
de unión disponibles. Esta muestra
tratada se transfiere a un pocillo
de análisis y se analiza según el
protocolo de confirmación. Ya que la
mayoría de los puntos de enlace del
antígeno ya han formado complejos,
la muestra produce valores de
absorbancia mucho menores. Con
fines de comparación, la muestra
también se trata con un diluyente
no reactivo y se analiza junto con la
muestra neutralizada. La muestra se
considera positiva si el anticuerpo
neutralizante reduce la intensidad
del color en un 50% o más,
comparado con la muestra tratada
con el diluyente no reactivo.
23
Reactivos
1. Placas recubiertos con anti-FeLV
2. Conjugado de peroxidasa de rábano:anti-FeLV,
conservado con gentamicina
3. Control positivo
conservado con gentamicina
4. Control negativo
conservado con gentamicina
5. Solución de sustrato TMB
7. Concentrado para lavado (10X)
conservado con gentamicina
8. Solución de frenado
A. Solución A - Diluyente para la muestra
conservado con gentamicina
(para el protocolo de confirmación)
B. Solución B - Reactivo neutralizante conservado con gentamicina
(para el protocolo de confirmación)
Materiales necesarios no suministrados
1. Agua destilada o desionizada
2. Frasco para lavado
3. Pipeta de precisión que permite
dispensar 10 μl.
4. Puntas de pipeta desechables.
Otros componentes que se suministran
1. Tubos para el pretratamiento de
las muestras (para el protocolo de
confirmación)
Precauciones y advertencias para
los usuarios
1. Trate todos los materiales biológicos como si fueran capaces de
transmitir el FeLV.
2. El control positivo contiene FeLV
inactivado químicamente. Sin embargo, no suponga que el virus
está completamente inactivado.
3. No use la boca para pipetear.
4. No coma, beba ni fume en los
lugares donde se esté
trabajando con las muestras o
con los reactivos del kit.
5. No exponga las soluciones de
TMB a la luz solar directa ni a
agentes oxidantes.
24
Volumen
5
25 ml
2 ml
2 ml
2 x 25 ml
100 ml
25 ml
0,5 ml
0,5 ml
6. Almacene todos los reactivos
entre 2°C y 8°C. Deje que
alcancen la temperatura
ambiente (15°C–30°C) antes
de usarlos y refrigérelos a
2°C–8°C después de usarlos.
La solución de frenado puede
precipitar. Déje que alcance la
temperatura ambiente y mézclela
cuidadosamente mediante
movimientos circulares antes de
utilizarla.
7. Todos los desechos deben
descontaminarse correctamente
antes de desecharse.
8. Procure evitar la contaminación
de los componentes del kit.
9. No utilice los componentes
después de su fecha de
caducidad, ni mezcle
componentes que tengan
números de serie diferentes.
10. Se obtienen resultados óptimos
sólo si se sigue este protocolo
estrictamente. Para mantener
la precisión y la exactitud, es
necesario efectuar el pipeteado
y el lavado cuidadosamente a lo
largo de todo este procedimiento.
11. Sólo para uso veterinario.
Deje que todos los reactivos alcancen
la temperatura ambiente (15°C–30°C)
antes de usarlos. Los reactivos
deben mezclarse suavemente con un
movimiento circular.
Información sobre las muestras
1. En esta análisis puede usarse
suero o plasma, frescos o
previamente congelados, o
almacenados a 2°C–8°C. El
suero o el plasma pueden
almacenarse hasta 7 días a
2°C–8°C. Si la muestra se
almacena por un tiempo
prolongado, debe congelarse (a
-20°C o menos).
2. La sangre entera puede usarse
sólo en el protocolo de
detección. La sangre
entera debe tratarse con un
anticoagulante, por ejemplo
EDTA, heparina o citrato, y
puede usarse fresca o
refrigerarse (2°C–8°C) hasta una
semana.
3. Es importante asegurarse de
que el suero o el plasma estén
exentos de células. Pueden
usarse muestras hemolizadas.
Sin embargo, las muestras
altamente hemolizadas podrían
dar lugar a una absorbancia de
fondo elevada.
4. El EDTA, la heparina o el citrato
en el plasma no afectan
los resultados.
5. Las muestras precongeladas
o de más edad deben
centrifugarse antes de usarse.
Preparación de la solución para lavado
De vez en cuando, pueden
formarse cristales salinos durante
el almacenamiento del concentrado
de lavado. Si esto sucede, deje
que el concentrado se equilibre a
temperatura ambiente (15°C–30°C),
y agítelo con un movimiento circular
para redisolver los cristales antes de
preparar la solución de lavado.
Diluya el concentrado 10 veces
con agua destilada o desionizada
(por ejemplo, 3 ml de concentrado
para lavado con 27 ml de agua por
cada tira a analizar). La solución de
lavado diluida puede almacenarse a
temperatura ambiente (15°C–30°C),
por un máximo de una semana.
No almacene la solución de lavado
diluida en presencia de luz solar
directa.
25
Protocolo de detección
B.
C.
D.
PetChe
26
A.
IDEXX
1. Cuente el número de muestras
a analizar y agregue dos
pocillos, uno para el control
positivo y uno para el negativo.
Saque el número necesario de
pocillos de análisis de la bolsa
y colóquelos en la gradilla que
se proporciona. No separe los
pocillos de análisis de la tira
(refiérase a la ilustración A).
Anote las posiciones de las
muestras y los controles en una
hoja de trabajo.
2. Agregue 1 gota (50 µl) de control
positivo al primer pocillo de
análisis (refiérase a la ilustración
B) y 1 gota (50 µl) de control
negativo al segundo pocillo de
análisis.
3. Usando la pipeta de precisión
y una punta de pipeta
independiente para cada
muestra, añada 50 µl de suero,
plasma o sangre entera a
los pocillos adecuados (ver
ilustración C).
4. Agregue 1 gota (50 µl) de
HRPO:anti-FeLV a cada pocillo
de análisis (refiérase a la
ilustración D). Golpee el costado
de la gradilla suavemente para
mezclar.
5. Incube durante 5 minutos a
temperatura ambiente
(15°C–30°C).
6. Deseche el líquido de los
pocillos de análisis invirtiéndolos
sobre un recipiente adecuado,
luego golpee firmemente sobre
papel absorbente. Con una
pipeta, lave los pocillos con un
chorro de solución de lavado
diluida. Llene los pocillos por
completo y deseche todo el
líquido (refiérase a la ilustración
E). Golpee los pocillos sobre
E.
F.
Interpretación de los resultados
IDEXX
PetChe
papel absorbente después
de cada lavado, teniendo
cuidado de desechar todo
el líquido. Repita este paso 5
veces. Después del lavado final,
golpee los pocillos sobre papel
absorbente hasta que no quede
más líquido de los pocillos. Nota:
Es imposible lavar los pocillos
demasiado.
7. Agregue 2 gotas (100 µl) de
solución de sustrato TMB
(refiérase a la ilustración F).
incube durante 5 minutos
a temperatura ambiente
(15°C–30°C).
8. Agregue 1 gota (25 µl) de
solución de frenado a cada
pocillo de análisis. Golpee
suavemente para mezclar y
terminar la reacción. El color es
estable por 15 minutos.
9. Lea los resultados visualmente.
Un espectrofotómetro no
proporciona un resultado exacto
para este procedimiento de
análisis.
Resultados (Protocolo de detección)
Para que el análisis sea válido, debe
formarse un color azul bien definido
en el control positivo. El control
negativo debe ser incoloro o tener un
color muy tenue. Para los análisis no
válidos, debe sospecharse que hubo
un error en la técnica y el análisis debe
repetirse.
Compare la intensidad del color de la
muestra con la del control negativo. Si
la intensidad del color de la muestra
es menor o igual que la del control
negativo, la muestra se clasifica como
negativa para el antígeno p27 del
FeLV.
Si el color de una muestra es más
intenso que el control negativo, la
muestra se clasifica como reactiva
para el antígeno del p27 y debe volver
a analizarse usando el protocolo de
confirmación de lectura visual o de
laboratorio.
Protocolo de confirmación
1. Saque el número necesario de
pocillos de análisis de la bolsa y
colóquelos en la gradilla que se
proporciona. Asigne un pocillo
para el control negativo sin tratar.
Note que tanto el control positivo
como cada muestra requieren
dos pocillos de análisis para el
ensayo de confirmación: uno para
la porción tratada con diluyente
para la muestra (solución A) y el
otro para la porción tratada con
el reactivo neutralizante (solución
B). El control negativo se deja sin
tratar. Anote las posiciones de las
muestras y los controles en una
hoja de trabajo.
2. Coloque un número equivalente
de tubos de pretratamiento
en la gradilla de manera
que correspondan con la
configuración de controles
positivos y muestras en la hoja de
trabajo.
3. Agregue 1 gota (50 µl) de
control positivo a cada uno
de los dos tubos limpios para
pretratamiento. Marque un tubo
de pretratamiento con una “A”, y
27
el otro con una “B”.
4. Usando la pipeta de precisión
y una punta de pipeta
independiente para cada
muestra, añada 50 µl de plasma
o suero para confirmación
dentro de dos tubos limpios de
pretratamiento (no usar sangre
entera en este protocolo). Marque
un tubo de pretratamiento
como “A” y el otro tubo de
pretratamiento como “B”.
5. A cada tubo “A”, agregue 10 µl
de solución A; aspire y expulse
la solución 5-10 veces con una
pipeta para mezclarla. Usando
una pipeta de precisión y una
punta de pipeta distinta para cada
muestra.
6. A cada tubo “B”, agregue 10 µl
de solución B; aspire y expulse
la solución 5-10 veces con una
pipeta para mezclarla. Usando
una pipeta de precisión y una
punta de pipeta distinta para cada
muestra.
7. Incube durante 5 minutos
a temperatura ambiente
(15°C–30°C).
8. Verifique las posiciones de las
muestras en la hoja de trabajo.
9. Agregue 1 gota (50 µl) de control
negativo al primer pocillo de
análisis. Transfiera 50 µl del
control positivo tratado con la
solución A al segundo pocillo
de análisis. Transfiera 50 µl del
control positivo tratado con la
solución B al tercer pocillo de
análisis.
10. Para cada muestra, transfiera
50 µl de la porción tratada
con la solución A (tubo de
pretratamiento “A”) a un pocillo;
transfiera 50 µl con la porción
tratada con la solución B (tubo
de pretratamiento “B”) a un
pocillo consecutivo. Use una
28
11.
12.
13.
14.
15.
16.
pipeta de precisión y puntas de
pipeta independientes. Continue
hasta que todas las muestras
hayan sido transferidas de los
tubos de pretratamiento a los
pocillos.
Agregue 1 gota (50 µl) de
conjugado HRPO:Anti-FeLV
a cada pocillo de análisis.
Golpee suavemente para
mezclar. Incube durante 5
minutos a temperatura ambiente
(15°C–30°C).
Deseche el líquido de los
pocillos de análisis invirtiéndolos
sobre un recipiente adecuado,
luego golpee firmemente sobre
papel absorbente. Con el frasco
para lavado, lave los pocillos
con un chorro de solución de
lavado diluida. Llene los pocillos
por completo y deseche todo el
líquido. Después de cada lavado,
golpee los pocillos sobre papel
absorbente, teniendo cuidado de
desechar todo el líquido. Repita
este paso 5 veces. Después del
lavado final, golpee los pocillos
sobre papel absorbente hasta
que no quede más líquido de los
pocillos. Nota: Es imposible lavar
demasiado los pocillos.
A cada pocillo, agregue 2
gotas (100 µl) de solución de
sustrato TMB.
Incube durante 5 minutos
a temperatura ambiente
(15°C–30°C).
Agregue 1 gota (25 µl) de
solución de paro a cada pocillo
de análisis. Golpee suavemente
para mezclar y terminar la
reacción.
Lea el resultado visualmente.
Resultados (Protocolo de confirmación)
Para que la análisis de confirmación
tenga validez, el control negativo
debe ser incoloro o tener un color
muy tenue. En la porción del control
positivo tratada con solución A
debe formarse un color azul bien
definido, y la intensidad del color
de la porción del control positivo
tratada con solución B debe ser
menos de la mitad que la del de
la porción tratada con solución A.
Para los análisis no válidos, debe
sospecharse que hubo un error en
la técnica y el análisis
debe repetirse.
Interpretación de los resultados
1. Si la muestra tratada con la
solución A tiene un color que
es igual o menos intenso que el
del control negativo, la muestra
se clasifica como negativa, no
repetidamente reactiva hacia el
antígeno p27 del FeLV.
2. Si la muestra tratada con la
Solución A tiene un color que
es más intenso que el del
control negativo, la muestra se
clasifica como repetidamente
reactiva y se debe examinar la
neutralización de la muestra
tratada con la solución B
como sigue:
a. Si la muestra tratada con
la solución A tiene un color
que es igual o menos
intenso que el color de la
parte del control positivo
tratado con la solución A
pero la muestra tratada
con la solución B no se ha
neutralizado en un 50%
como mínimo (es decir, la
intensidad de la muestra
tratada con la solución
B tiene un color que es
más de la mitad que la de
la muestra tratada con la
solución A), la muestra se
clasifica como negativa no
confirmada.
b. Si la muestra tratada con
la solución A tiene un color
que es más intenso que
el color de la parte del
control positivo tratado con
la solución A y la muestra
tratada con la solución B
no se ha neutralizado en un
50% como mínimo (es decir,
la intensidad de la muestra
tratada con la solución
B tiene un color que es
más de la mitad que la de
la muestra tratada con la
solución A), debe repetirse
el análisis diluyendo la
muestra 1:11 con solución
diluyente A (por ejemplo:
10 µl de muestra + 100
µl de solución diluyente
A). Repetir el análisis
siguiendo el protocolo de
confirmación.
c. Si la muestra tratada con
la solución A tiene un
color que es más intenso
que el color del control
negativo la muestra tratada
con la solución B se ha
neutralizado en un 50%
como minimo (es decir, la
intensidad de la muestra
tratada con la solución
B tiene un color que es
menos de la mitad que la
de la muestra tratada con
la solución A), la muestra
se clasifica como positiva
confirmada para el antígeno
p27 del FeLV.
29
Bibliografía
• Hardy, W. D. Jr. 1985. Feline Retroviruses. In
Advances in Viral Oncology, Vol. 5 Ed. Klien,
G. pp. 1-33.
• Hardy, W. D. Jr. 1981. The Feline Leukemia
Virus. J. Amer. Animal Hosp. Assoc. 17: 951980.
• Hardy, W. D. Jr. 1981. Feline Leukemia Virus
Non-Neoplastic Diseases. J. Amer. Animal
Hosp. Assoc. 17:941-949.
Para obtener asistencia técnica, IIame al Servicio Técnico de IDEXX
00800 1234 3399.
*PetChek es una marca o una marca registrada de IDEXX Laboratories, Inc. o sus filiares, en los Estados Unidos de
America y/o en otros paises.
©2010 IDEXX Laboratories, Inc. Todos los derechos reservados.
30
Deutsche Version
Testkit zum Nachweis des Felinen Leukämievirus-Antigens
(Screening/Bestätigung)
In vitro-Diagnostikum. Gebrauchsinformation. Nur zum tierärztlichen Gebrauch.
Name und Verwendungszweck
PetChek* FeLV ist ein Enzymimmunoassay für Screening und zur
Bestätigung des Vorliegens von Felinem Leukämievirus-Antigen (FeLV)
in felinem Serum oder Plasma.
Vollblutproben können beim Screeningtest verwendet werden, aber
beim Bestätigungstest muss Serum
oder Plasma verwendet werden.
Beschreibung des Testprinzips
Dieser Test verwendet Antikörper
(Maus und Huhn), die FeLV-spezifisch
sind. Diese Antikörper werden als
Beschichtung in Mikrotitrationsvertiefungen eingebracht, die in Streifen à
12 Vertiefungen gruppiert sind.
Beim Screeningtest werden die Proben in den Vertiefungen mit HRPOkonjugierten Antikörpern inkubiert.
Eventuell in der Probe vorliegendes
FeLV-Antigen bindet sich sowohl an
die Antikörper in der Beschichtung
als auch an das Antikörper:HRPOKonjugat. Ungebundenes Material
wird herausgewaschen und dann
ein Substrat und ein Chromogen
hinzugefügt. Die nachfolgende
Farbentwicklung ist proportional zur
Konzentration von FeLV-gruppenspezifischem Antigen (p27) in der
Probe.
Im Screening ist es jedoch möglich,
dass Proben, die FeLV-fremdes
Material enthalten (wie z.B. AntiMaus-Antikörper) eine Reaktion mit
den Testreagenzien hervorrufen. Aus
diesem Grund sollten alle positiven
Ergebnisse mit dem Bestätigungstest überprüft werden.
Der Bestätigungstest überprüft die
Genauigkeit positiver Resultate
aus dem Screeningtest.
Der Bestätigungstest stimmt
weitgehend mit dem Screeningtest
überein; jedoch enthält er
als zusätzlichen Schritt eine
Probenvorbehandlung. Proben,
die im Screening ein positives
Ergebnis bewirkt haben, werden
mit neutralisierendem Antikörper
vorbehandelt. Sofern in der Serumoder Plasmaprobe Antigen vorliegt,
reagiert es mit dem Antikörper und
bindet sich an den freien Stellen an.
Die so vorbehandelte Probe wird
dann in eine Testvertiefung gegeben
und mit dem Bestätigungstest
getestet. Da die meisten der
Bindestellen auf dem Antigen
bereits belegt sind, ergeben sich
für die Probe erheblich verminderte
Absorptionswerte. Zum Vergleich
wird die Probe ebenfalls mit einer
nichtreaktiven Verdünnungslösung
behandelt und gleichzeitig mit der
neutralisierten Probe getestet. Die
Probe gilt als positiv, wenn der
Neutralisationsantikörper die Farbentwicklung im Vergleich zu der mit
nichtreaktiver Verdünnungslösung
behandelten Probe um 50% oder
mehr reduziert.
31
Reagenzien
Menge
1.
2.
3.
4.
5.
7.
8.
A.
Mit Anti-FeLV beschichtete
5
Platten
Anti-FeLV:HRPO-Konjugat.
Konservierungsmittel: Gentamicin.
25 ml
Positive Kontrolle
2 ml
Konservierungsmittel: Gentamicin.
Negative Kontrolle
2 ml
Konservierungsmittel: Gentamicin.
TMB-Substratlösung
2 x 25 ml
Waschkonzentrat (10x)
100 ml
Konservierungsmittel: Gentamicin.
Stopplösung
25 ml
Lösung A - Probenverdünnungslösung
0,5 ml
Konservierungsmittel: Gentamicin (für den Bestätigungstest)
B. Lösung B - Neutralisationsreagenz
0,5 ml
Konservierungsmittel: Gentamicin (für den Bestätigungstest)
Erforderliche, jedoch nicht
mitgelieferte Materialien
1. Destilliertes oder
deionisiertes Wasser
2. Waschbehälter
3. Präzisionspipette für 10 μl
4. Einweg-Pipettenspitzen
Weitere mitgelieferte Testbestandteile
1. Probenvorbehandlungsröhrchen (für den Bestätigungstest)
Vorsichtsmaßnahmen und Warnhinweise
1. Alle biologischen Materialien wie
potentielle Überträger von FeLV
handhaben.
2. Die Positive Kontrolle enthält
chemisch inaktiviertes FeLV.
Es kann jedoch nicht von einer
vollständigen Inaktivierung
ausgegangen werden.
3. Nicht mit dem Mund pipettieren.
4. Wo mit Reagenzien gearbeitet
wird, sollte nicht gegessen,
getrunken oder geraucht werden.
32
5. TMB-Lösungen vor starkem Licht
oder oxidierenden Mitteln schützen.
6. Lagerung der Reagenzien
bei 2°C–8°C. Vor Gebrauch
auf Zimmertemperatur (15°C30°C) bringen und nach
Gebrauch wieder bei 2°C–8°C
lagern. Präzipitation kann in
der Stopplösung auftreten.
Bitte schütteln Sie die auf
Raumtemperatur gebrachte
Lösung vor dem Gebrauch.
7. Alle Abfallmaterialien vor
der Entsorgung sorgfältig
dekontaminieren.
8. Eine Verunreinigung der
Testbestandteile muss sorgfältig
vermieden werden.
9. Testkit nicht nach Ablauf des
Verfallsdatums benutzen.
Testbestandteile aus Kits
mit unterschiedlichen
Chargennummern nicht mischen.
10. Bei strenger Befolgung dieses
Protokolls werden optimale
Ergebnisse erzielt. Sorgfältiges
Pipettieren und Waschen
während der Testprotokolle sind
erforderlich, um die Genauigkeit
der Resultate zu gewährleisten.
11. Nur für den tierärztlichen
Gebrauch.
Alle Reagenzien vor Gebrauch auf
Zimmertemperatur (15°C–30°C)
bringen. Sie sollten durch leichtes
Schwenken gemischt werden.
Probeninformation
1. Für diesen Test können Serumoder Plasmaproben verwendet
werden, die frisch, tiefgefroren
und aufgetaut oder gekühlt bei
2°C–8°C gelagert worden sein
können. Die Serum- oder Plasmaproben können bis zu 7 Tage
bei 2°C–8°C aufbewahrt werden.
Bei längerer Lagerung sollten
die Proben tiefgefroren (-20°C
oder kälter) werden.
2. Vollblut kann nur im Screeningtest verwendet werden. Es
muss mit EDTA, Heparin oder
Zitrat antikoaguliert sein und
kann entweder frisch oder
nach gekühlter Lagerung (bei
2°C–8°C bis zu einer Woche)
verwendet werden.
3. Es sollte sichergestellt werden,
dass die Serum- oder Plasmaproben kein Zellmaterial
enthalten. Hämolysierte Proben
können verwendet werden;
stark hämolysierte Proben können jedoch eine starke Hintergrundfarbe bewirken.
4. EDTA, Heparin oder Zitrat in
Plasmaproben beeinträchtigen
die Resultate nicht.
5. Proben, die tiefgefroren waren
oder nicht frisch sind, sollten vor
dem Test zentrifugiert werden.
Zubereitung der Waschlösung
In seltenen Fällen können sich
während der Lagerung im
Waschkonzentrat Salzkristalle
bilden. In diesem Fall sollte das
Waschkonzentrat auf Zimmertemperatur (15°C–30°C) gebracht und vor
der Zubereitung der Waschlösung
durch Schwenken gemischt werden;
hierdurch lösen sich die Salzkristalle
wieder. Waschkonzentrat 10-fach mit
destilliertem oder deionisiertem Wasser
verdünnen (z.B. 3 ml Waschkonzentrat
und 27 ml Wasser pro zu testendem
Streifen).Die fertige Waschlösung kann
bei Zimmertemperatur (15°C–30°C)
bis zu einer Woche aufbewahrt
werden. Sie sollte jedoch vor direkter
Sonneneinstrahlung geschützt werden.
Screeningtest
1. Die Anzahl der zu testenden
Proben ermitteln und zwei
Vertiefungen für die Positive
und Negative Kontrolle
hinzuzählen. Die erforderliche
Anzahl Vertiefungen dem
Beutel entnehmen und in den
mitgelieferten Halter setzen.
Dabei die Vertiefungen nicht
voneinander trennen, sondern
als Streifen belassen (s. Abb.
A). Die Positionen der Proben
und Kontrollen auf einem
entsprechenden Arbeitsblatt
vermerken.
2. 1 Tropfen (50 µl) Positive
Kontrolle in die erste Vertiefung
(s. Abb. B) sowie 1 Tropfen
(50 µl) Negative Kontrolle in die
zweite Vertiefung geben.
3. Mit Hilfe der Präzisionspipette
und einer neuen Pipettenspitze
je Probe 50 µl der Serum-,
Plasma- oder Vollblutprobe
in die entsprechenden Vertiefungen geben (siehe Abb. C).
33
B.
C.
D.
PetChe
E.
F.
IDEXX
PetChe
34
A.
IDEXX
4. In jede Vertiefung 1 Tropfen
(50 µl) Anti-FeLV:HRPO-Konjugat
hinzugeben (s. Abb. D). Durch
leichtes Klopfen gegen die Seiten
des Halters vorsichtig mischen.
5. 5 Minuten bei Zimmertemperatur
(15°C–30°C) inkubieren.
6. Die Flüssigkeit aus den
Vertiefungen durch Umkehren
des Streifens in einen geeigneten
Auffangbehälter ausgießen und
anschließend den Streifen fest
auf Saugpapier ausklopfen. Die
Vertiefungen großzügig und kräftig
mit der verdünnten Waschlösung
aus dem Waschbehälter abspülen.
Alle Vertiefungen vollständig
auffüllen, dann die Flüssigkeit
ausgießen (s. Abb. E). Nach jedem
Waschvorgang den Streifen auf
Saugpapier ausklopfen, bis die
Flüssigkeit vollständig entfernt
ist. Diesen Vorgang fünfmal
wiederholen. Nach dem letzten
Waschvorgang den Streifen wieder
auf Saugpapier ausklopfen, bis
die Flüssigkeit vollständig entleert
ist. ANMERKUNG: Eine zu starke
Auswaschung der Vertiefungen ist
nicht möglich.
7. In jede Vertiefung 2 Tropfen (100
µl) TMB-Substratlosüng (s. Abb. F).
5 Minuten bei Zimmertemperatur
(15°C–30°C) inkubieren.
8. In jede Vertiefung 1 Tropfen
(25 µl) Stopplösung zugeben.
Durch leichtes Klopfen mischen;
hierdurch wird die Reaktion
gestoppt. Die Farbentwicklung
bleibt nun 15 Minuten lang stabil.
9. Ergebnis visuell ablesen. Bei
dieser Testmethode würde die
Benutzung eines Spektrophotometers zu einer ungenauen
Interpretation führen.
Ergebnisse (screening)
Damit der Test gültig ist, muss in der
Positiven Kontrolle eine deutliche
blaue Farbentwicklung stattfinden.
Die Negative Kontrolle muss farblos
oder nur sehr leicht verfärbt sein.
Bei einem ungültigen Test sollte von
einem verfahrenstechnischen Fehler
ausgegangen werden; ein solcher
Test ist zu wiederholen.
Interpretation der Ergebnisse
Die Färbung der Probe mit der
Färbung der Negativen Kontrolle
vergleichen. Wenn die Färbung der
Probe weniger oder gleich intensiv
ist wie die der Negativen Kontrolle,
wird die Probe als nicht reaktiv für
FeLV p27-Antigen eingestuft.
Ist die Farbintensität in der Probe
höher als in der Negativen Kontrolle,
so wird die Probe als reaktiv für FeLV
p27-Antigen eingestuft und sollte
mit dem Bestätigungstest erneut
getestet werden.
Bestätigungstest
1. Die erforderliche Anzahl von
Vertiefungen aus dem Beutel
nehmen und in den mitgelieferten
Halter setzen. Eine Vertiefung
für die unbehandelte Negative
Kontrolle hinzuzählen. ACHTUNG:
Für den Bestätigungstest sind für
jede Probe sowie für die Positive
Kontrolle zwei Vertiefungen
erforderlich, nämlich eine für die
mit Probenverdünnungslösung
(Lösung A) und eine für die
mit Neutralisationsreagenz
(Lösung B) behandelte Probe.
Die negative Kontrolle bleibt
unbehandelt. Die Positionen der
Proben und Kontrollen auf einem
entsprechenden Arbeitsblatt
eintragen.
2. Die gleiche Anzahl von
Probenvorbehandlungsröhrchen
gemäß der Verteilung von Proben
und Positiven Kontrollen auf dem
Arbeitsblatt in den Halter setzen.
3. In je zwei saubere
Probenvorbehandlungsröhrchen
je 1 Tropfen (50 µl) Positive Kontrolle geben. Markieren Sie eines
der beiden Röhrchen mit der
Aufschrift “A”, das andere mit “B”.
4. Mit Hilfe der Präzisionspipette
und einer neuen Pipettenspitze je
Probe 50 µl der zu bestätigenden
Serum- oder Plasmaprobe in
jedes von zwei sauberen
Probenvorbehandlungsröhrchen
geben (für den Bestätigungstest
keine Vollblutproben verwenden!). Kennzeichnen Sie ein
Vorbehandlungsröhrchen mit
dem Buchstaben "A", das andere
mit "B".
5. In jedes mit “A” markierte
Röhrchen 10 µl Lösung A geben
und anschließend den Inhalt jedes
Röhrchens durch 5-10 maliges
Aufnehmen und Ausstoßen mit
einer Pipette mischen. Dabei für
jede Probe eine Präzisionspipette
und eine neue EinwegPipettenspitze verwenden.
6. In jedes mit “B” markierte
Röhrchen 10 µl Lösung B geben
und anschließend den Inhalt jedes
Röhrchens durch 5-10 maliges
Aufnehmen und Aus-stoßen mit
einer Pipette mischen. Dabei für
jede Probe eine Präzisionspipette
und eine neue EinwegPipettenspitze verwenden.
7. 5 Minuten bei Zimmertemperatur
(15°C–30°C) inkubieren.
8. Die Positionen der Proben auf
dem Arbeitsblatt überprüfen.
9. In die erste Vertiefung 1 Tropfen
(50 µl) Negative Kontrolle
geben. In die zweite Vertiefung
35
50 µl mit Lösung A behandelte
Positive Kontrolle geben. In
die dritte Vertiefung 50 µl mit
Lösung B behandelte Positive
Kontrolle geben.
10. Geben Sie für jede Probe 50 µl
der mit Lösung A behandelten
Probe (Probenvorbehandlungsröhrchen "A") in eine
Vertiefung; in die nächste
Vertiefung geben Sie 50 µl der
mit Lösung B behandelten
Probe (Probenvorbehandlungsröhrchen "B"). Verwenden Sie
hierzu die Präzisionspipette
und für jeden Vorgang eine
neue Pipettenspitze. Fahren
Sie auf diese Weise fort, bis alle
Proben von den Vorbehandlungsröhrchen in die Testvertiefungen übertragen sind.
11. Jeder Vertiefung 1 Tropfen (50
µl) Anti-FeLV:HRPO-Konjugat
zugeben. Durch Klopfen vorsichtig mischen. 5 Minuten bei
Zimmertemperatur (15°C–30°C)
inkubieren.
12. Die Flüssigkeit aus den Vertiefungen durch Umkehren des
Streifens in einen geeigneten
Auffangbehälter ausgießen und
anschließend den Streifen fest
auf Saugpapier ausklopfen.
Die Vertiefungen großzügig
und kräftig mit der verdünnten
Waschlösung aus dem Waschbehälter abspülen. Alle
Vertiefungen vollständig
auffüllen, dann die Flüssigkeit ausgießen. Nach jedem
Waschvorgang den Streifen auf
Saugpapier ausklopfen, bis die
Flüssigkeit vollständig entfernt
ist. Diesen Vorgang fünfmal
wiederholen. Nach dem letzten
Waschvorgang den Streifen wieder auf Saugpapier ausklopfen,
bis die Flüssigkeit vollständig
36
entleert ist. ANMERKUNG: Eine
zu starke Auswaschung der
Vertiefungen ist nicht möglich.
13. In jede Vertiefung zunächst 2
Tropfen (100 µl) TMBSubstratlösung
14. 5 Minuten bei Zimmertemperatur
(15°C–30°C) inkubieren.
15. In jede Vertiefung 1 Tropfen
(25 µl) Stopplösung geben.
Durch leichtes Klopfen mischen;
hierdurch wird die Reaktion
gestoppt.
16. Ergebnis visuell ablesen.
Ergebnisse (Bestätigung)
Damit der Bestätigungstest gültig ist,
muss die Negative Kontrolle farblos
oder nur sehr leicht verfärbt sein.
Der mit Lösung A behandelte Teil
der Positiven Kontrolle muss eine
deutliche blaue Farbentwicklung aufweisen, während die Farbintensität
des mit Lösung B behandelten Teils
der Positiven Kontrolle weniger als
halb so stark sein sollte wie die des
mit Lösung A behandelten Teils.
Bei einem ungültigen Test sollte von
einem verfahrenstechnischen Fehler
ausgegangen werden; ein solcher
Test ist zu wiederholen.
Interpretation der Ergebnisse
1.Wenn die Farbintensität der mit
Lösung A behandelten Probe
weniger oder gleich stark ist
wie die der Negativen Kontrolle,
wird die Probe als “negativ, nicht
wiederholbar reaktiv für FeLV p27Antigen” eingestuft.
2. Wenn die Farbintensität der mit
Lösung A behandelten Probe
stärker ist als die der Negativen
Kontrolle, so wird die Probe als
“wiederholbar reaktiv für FeLV
p27” eingestuft; in diesem Falle ist
eine Beurteilung der mit Lösung
B behandelten Probe erforderlich. Die Beurteilung erfolgt durch
Befolgen der nachstehenden
Abschnitte a, b und c.
und das Bestätigungsprotokoll
befolgen.
c.Wenn die Farbintensität der mit
Lösung A behandelten Probe
stärker ist als die der Negativen
Kontrolle und die mit Lösung B
behandelte Probe mindestens
zu 50 % neutralisiert wurde
(d.h. die Farbintensität der mit
Lösung B behandelten Probe
weniger als die Hälfte der mit
Lösung A behandelten Probe
ausmacht), wird die Probe als
“bestätigt positiv für FeLV p27Antigen” eingestuft.
a. Wenn die Farbintensität der mit
Lösung A behandelten Probe
gleich oder schwächer ist als
die des mit Lösung A behandelten Teils der Positiven Kontrolle, jedoch die mit Lösung B
behandelte Probe nicht mindestens zu 50% neutralisiert wurde
(d.h. wenn die mit Lösung B
behandelte Probe mehr als halb
so farbintensiv ist wie die mit
Lösung A behandelte Probe),
dann wird die Probe als “negativ, nicht bestätigt” klassifiziert.
b. Wenn die Farbintensität der
mit Lösung A behandelten
Probe stärker ist als die des mit
Lösung A behandelten Teils der
Positiven Kontrolle und die mit
Lösung B behandelte Probe
nicht mindestens zu 50 % neutralisiert wurde (d.h. wenn die
mit Lösung B behandelte Probe
mehr als halb so farbintensiv ist
wie die mit Lösung A behandelte Probe), dann wird der
Test wiederholt, indem Sie die
Probe 1:11 mit der Probenverdünnungslösung A verdünnen
(z.B.10 µl Probe +100 µl
ANMERKUNG: Aufgrund
der Charakteristika einer FeLVInfektion sollten Katzen mit
einem positiven Testergebnis
nach ca. 3-4 Wochen erneut
getestet werden.
Literaturverzeichnis
•
•
•
Hardy, W. D. Jr. 1985. Feline Retroviruses.
In Advances in Viral Oncology, Vol. 5 Ed.
Klien, G. pp. 1-33.
Hardy, W. D. Jr. 1981. The Feline Leukemia Virus. J. Amer. Animal Hosp. Assoc.
17: 951-980.
Hardy, W. D. Jr. 1981. Feline Leukemia
Virus Non-Neoplastic Diseases. J. Amer.
Animal Hosp. Assoc. 17:941-949.
Probenverdünnungslösung A)
Bei technischen Fragen wenden Sie sich bitte an den IDEXX-Kundendienst
unter der Nulltarif-Nummer 00800 1234 3399
Zul.-Nr.: BGAF-B021
*PetChek ist eine Schutzmarke oder eine eingetragene Schutzmarke von IDEXX Laboratories, Inc. oder eines Tochterunternehmens von IDEXX, in den Vereinigten Staaten und/oder in anderen Ländern.
©2010 IDEXX Laboratories, Inc. Alle Rechte vorbehalten.
37
Manufacturer
One IDEXX Drive
Westbrook, Maine
04092 USA
EU-Representative
IDEXX Europe B.V.
P.O. Box 1334
2130 EK Hoofddorp
The Netherlands
idexx.com