Metodi per la rilevazione e
quantificazione della
resistenza in patogeni fungini
R.M. De Miccolis Angelini, S. Pollastro,
S. Toffolatti, A. Vercesi
DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA
E CHIMICA AGROFORESTALE ED AMBIENTALE
- DiBCA
DIPARTIMENTO DI SCIENZE AGRARIE E AMBIENTALI
PRODUZIONE, TERRITORIO, AGROENERGIA
Perché?
z
z
z
z
z
z
Verificare casi di sospetta resistenza
Segnalare la comparsa di forme
resistenti
Seguire l’evoluzione della resistenza
Verificare l’efficacia delle strategie antiresistenza
Modulare la scelta dei fungicidi a livello
locale
Migliorare le conoscenze
Obiettivo
Sensibilità di base
CE50
% Inibizione
100
50
0
MIC (CE100)
Curve dose-risposta
S
Inibizione (%)
100
80
LR
60
HR
40
20
0
0
0,1
1
10
100
Log concentrazione fungicida
Distribuzione di
ceppi di P.
viticola in
funzione
dell’EC50 a
fenamidone
EC50
0,1
1
10
100
Risposta di ceppi di Botryotinia
fuckeliana a fenhexamid
EC50 Resistente
FR =
EC50 Sensibile
Campionamento
Campionamento
Un numero eccessivo di
campioni può essere inutile ai
fini del monitoraggio
PCR in tempo reale
Quantificazione di DNA mutato
z
Conteggio delle colonie
z
Germinazione conidica
z
Crescita micelica
Saggi di germinazione sulle oospore
2
1
•Isolamento delle
oospore
•Risospensione
in acqua dopo
filtrazione
3
•
Incubazione di 1200 oospore a 20°C su:
1. Substrato di controllo (agar-acqua 1%)
2. Agar-acqua addizionato con fungicida
•
Concentrazione discriminante
•
Concentrazione crescente
Conteggio delle oospore germinate
Trascorsi 7-10-14
giorni
dall’inoculazione
4 Calcolo delle percentuali di germinazione
nr. oospore germinate
× 100
G=
nr. totale di oospore
Calcolo della percentuale di oospore
resistenti (RO)
RO =
Gfungicida
× 100
Gagar − acqua
Piastre per microtitolazione
Composizione del substrato
Es: Resistenza alle anilinopirimidine, SDHI
Colony growth inhibition (%)
Saggi in vitro per la resistenza a QoI
100
80
60
MEA
MEA+SHAM
40
20
0,01
0,1
1
10
100
Trifloxystrobin concentration (μg ml-1)
Substrato addizionato di inibitori specifici di respirazioni alternative
(es. SHAM, n-propyl gallate)
z
Resistenza associata ad una alterazione genica
z
Presenza/assenza di mutazioni (SNPs)
z
Percentuale di allele mutato
z
Interpretazione del risultato (ploidia,eterocariosi,eteroplasmia)
Molecolari
Eterocariosi e eteroplasmia
Resistente
Fungicida
DNA mutato
DNA
‘wild-type’
Sensibile
Tecnica
Single-stranded
conformational polymorphism
PCR (PCR-SSCP)
Allele-Specific PCR
High-resolution melting
detection
TaqMan real-time PCR
Luminex Molecular
Diagnostics
Nested PCR-RFLP
primer-introduced restriction
analysis PCR (PIRA-PCR)
rolling circle amplification
amplification (RCA-PCR)
PCR-restriction fragment
length polymorphism
(PCR-RFLP)
Reverse Transcription
PCR Assay
Allele-specific probe and
primer amplification assay
(ASPPAA PCR)
Patogeno
Riferimento bibliografico
Srinivasa et al., 2012;
Plant Pathogenic
Nahiyan et al., 2011;
Bacteria; Fusarium sp.;
Patel et al., 2011;
Pyrenophora tritici;
Veloukas et al., 2011
Botrytis cinerea
Cercospora beticola
Malandrakis et al., 2011
Botrytis cinerea
Billard et al., 2010
Botrytis cinerea;
Plasmopara viticola
Billard et al., 2012;
Samuel et al., 2011;
Valsesia et al., 2005
Clinically Relevant Fungi
Babady et al., 2011
Botrytis cinerea
Saito et al., 2007
Fusarium graminearum
Luo et al., 2009
Penicillium marneffei
Jiufeng et al., 2010
Botrytis cinerea;
Magnaporthe oryzae;
Colletotrichum
gloeosporioides
Mycosphaerella
graminicola
Botrytis cinerea
Kim et al., 2009;
Wei et al., 2009;
Chung et al., 2009
Guo et al., 2005
Billard et al., 2012
z
Impiego di enzimi di restrizione
z
Analisi del profilo elettroforetico
z
Discriminazione tra genotipi sensibili (S) o resistenti (R)
AluI
S
R
S
1000 pb
500 pb
R
Primer Allele-Specifici (AS)
C3387
G3387
Genotipo Sensibile
(S)
Genotipo Resistente
(R)
G
G
G
C
S R S
S S R R
S R S R R
Rilevazione della mutazione G143A nel gene cytb
1
2
SOSPENSIONE DI
OOSPORE/CONIDI
IN ACQUA
ESTRAZIONE E QUANTIFICAZIONE
DEL DNA TOTALE
3
Sonde Taqman
REAL TIME PCR ALLELE SPECIFICA E QUANTIFICAZIONE DELLA % DI
ALLELE MUTATO NELLA POPOLAZIONE (MA)
Costruzione curve standard per quantificazione di DNA
DNA totale
DNA mutato
Rilevazione della mutazione G143A nel gene cytb
Molecolari
Real-time PCR – SYBR green
Punti critici
Metodi standard
Punti critici
Esempio
Botrytis cinerea - Muffa grigia
Da usare per
Tipo di saggio
Proposto da
AP
Pianta intera
X
Microtitolazione
Microtitolazione
Altri
X
Lachase
X
Mehl
X
Microtitolazione
Crescita radiale
delle colonie
SBI SDHI QoI
X
X
X
X
Sierotzki
Stammler
Takagaki
Comparazione tra metodi
esempio: Botrytis cinerea
Microtitolazione
Fenotipo
BosS
BosLR
BosHR
BosMR
Germinazione
conidica
Substrato liquido
CE50
0,2
> 10
> 10
0,94
CE95
> 10
> 10
> 10
> 10
Crescita
micelica
Substrato agarizzato
CE50
< 0,01
1-40
> 100
-
CMI
0,1
> 100
> 100
-
CE50
0,29
> 100
> 100
15,25
CMI
10
> 100
> 100
> 100
esempio: oospore e QoI
% Oospore resistenti
% Allele mutato
100
80
60
40
20
BBD
BAI
BBC
BAM
BAR
BAT
BAH
BAU
BAO
BAN
BAP
BAB
BAZ
BAF
BAG
BAS
BAD
BAA
BAE
0
Conclusioni
La tecnica ideale
z
In grado di fornire risultati:
- realistici
- quantitativi
- riproducibili
- di facile ed univoca interpretazione
z
Di facile applicabilità (dotazione strumentale,
competenze dell’operatore, ecc.)
z
Economica, ad elevata processività in tempi brevi