Metodi di Indagine Fisiologica
La fisiologia è una scienza eminentemente sperimentale e,
poichè ha l'ambizione di fondare la comprensione dei
meccanismi biologici sui principi delle scienze fisiche chimiche e
matematiche, condivide le modalità e le tecniche di indagine
con queste discipline.
La Fluorescenza
SINGOLETTO
SINGOLETTO Rilassato
Il fatto di maggior importanza in
questo processo è che l'energia
del fotone emesso è inferiore a
quella del fotone assorbito. La
lunghezza d'onda del fotone
assorbito è più bassa di quella del
fotone emesso. Questo fenomeno
si chiama spostamento di Stokes.
Indicatori fluorescenti: Fluorofori
•Molecole organiche
poliaromatiche o eterocicliche
•Assorbono emettono intorno alle
lungh. d’onda del visibile
•Coniugati a molecole che legano
le proteine (sonde fluorescenti)
Indicatori fluorescenti: Fluorofori
Indicatori fluorescenti : Indicatori
di concentrazione di ioni
•Fluoroforo+molecola affine per uno ione
•Il legame dello ione modifica le caratteristiche spettrali del
fluoroforo
•Esempi FLUO-3 e FURA-2 -> Fluoroforo + BAPTA (chelante)
APPLICAZIONI: misura di
variazioni di ioni untracellulari
come il Calcio (secondo
messaggero)
Proteine Fluorescenti
Aequorea Victoria
La GFP:
•Taglia molecolare 30 Kda
•Assorbe a 360 nm
•Le EGFP sono modificate
per assorbire nel visibile
Green Fluorescent Protein GFP
Uso della GFP come gene reporter
Puo’ essere inserito a monte o a
valle del gene di interesse
Microscopia in Fluorescenza
(epifluorescenza)
Sistemi di illuminazione: lampade a Mercurio o Xenon
Filtri: Eccitazione, Dicroico, Emissione
Obiettivo (condensatore): alta apertura numerica, bagno
d’olio per ingrandimenti superiori a 40X
Dispositivi di detezione del segnale: Oculari, Pellicola
fotografica, Sensore fotografico (CCD), Fotomoltiplicatore
Microscopia in Fluorescenza
(Microscopia Confocale laser)
La microscopia confocale si avvale di una particolare configurazione ottica messa a punto da M. Minsky nel
1957, che consiste essenzialmente nell'illuminare non tutto il campione, ma solo il piano focale che si sta
osservando e nel raccogliere la luce solo dal medesimo. L'immagine risultante viene quindi depurata dalle
componenti fuori fuoco e si ha un incremento della risoluzione massima.
Microscopia in Fluorescenza
(Epifluorescenza verso Confocale)
Il sistema Immunitario
Protegge l’organismo dalle infezioni ed agenti tossici
Antigene (Ag)
Immunogeno
(capace di indurre una risposta immune)
Anticorpo (Ab)
Immunoglobulina
Struttura delle Immunoglobuline (Ig)
•4 catene polipeptidiche:
2 catene pesanti
2 catene leggere
•Ponti disolfuro legano le
4 catene
•5 classi diverse di Ig
IgG, IgA, IgD, IgE, IgM
Sito di legame per
l’antigene
Sito di legame per
l’antigene
Catena
pesante
Regione
cerniera
Catena
leggera
Frammento
cristallizzabile
Un esempio……
Localizzazione di proteine
cellulari
Anticorpo anti-anticorpo
Coniugato ad un fluorocromo
Anticorpo primario
Microscopia in Fluorescenza
(Microscopia Confocale a due fotoni)
Alcuni fluorocromi possono essere eccitati assorbendo due fotoni di energia pari alla metà di quella
corrispondente all'assorbimento di un fotone singolo (da cui l'utilizzo di un laser infrarosso a
lunghezza d'onda di emissione variabile); questo passaggio di stato avviene solo se i due fotoni
vengono forniti in rapida successione temporale, nell'ordine dei femtosecondi (s-15). Come risultato
di queste particolari proprietà si ottiene un ridotto danneggiamento del preparato, perchè la luce
infrarossa ha meno energia di quella visibile; inoltre, la luce fornita è pulsante e, quindi, il preparato
è mediamente illuminato per un tempo inferiore e si ha una notevole riduzione del photobleaching,
che si verifica solo nel piano focale; infine, l'infrarosso ha una capacità di penetrazione maggiore
nei tessuti rispetto al visibile. L'unico inconveniente è costituito dal fatto che il tipo di laser
necessario è molto costoso e raddoppia i costi rispetto a un sistema di microscopia confocale
convenzionale.
Microscopia in Fluorescenza
(FRAP)
La FRAP (Fluorescence Recovery
After Photobleaching) e’ utile
nello studio della mobilita’ delle
molecole all’interno delle membrane
biologiche
Microscopia in Fluorescenza
(TIRFM)
Total Internal Refraction Fluorescence Microscopy
APPLICAZIONI: Interazioni di
proteine con la membrana
plasmatica
1. Obiettivo
2. Fluorescenza emessa
3. Olio per immersione
4. Vetrino
5. Campione (cellule)
6. Campo di evanescenza
7. Raggio di eccitazione
8. Prisma di quarzo
Microscopia in Fluorescenza
(FRET)
Fluorescence Resonance Energy Transfer
Trasferimento di energia per risonanza (senza emissione di fotoni)
Distanza tra le molecole < 100 Å e ben orientate
Permette di studiare: interazione tra domini di una proteina (a), interazione tra proteine (b)
SDS-PAGE
(Sodio Dodecil Solfato Poliacrilammide Gel Elettroforesi)
Immunoblotting
NBT, BCIP
(substrati)
Prodotto
Anti IgG-AP coniugato
1° anticorpo
(IgG)
Proteina
(precipitato
violetto)
Membrana
SDS-PAGE ed Immunoblotting
Interazione proteina-proteina
Co-immunoprecipitazione Co-precipitazione con
Proteine di fusione
Proteina A
Proteina di interesse
Ligandi non noti
Proteina di fusione
Immunoprecipitazione
Aggiungere un
Ab
Diretto contro la
Proteina nota
Estratto cellulare
I complessi sono sedimentati
L’aggiunta di proteina
L’Ab lega la proteina A o G rende il complesso ed isolati dal resto delle
proteine cellulari
di interesse
insolubile
Coprecipitazione