La cellula e i suoi componenti:
Tecniche di visualizzazione
Fluorescence image of actin in yeast
EM
image of
yeast
DIC image of yeast cell
Tecniche di visualizzazione invasive:
implicano la morte e/o rottura cellulare.
Yeast cell
ElettroMicroscopia : permette di studiare la struttura della cellula
Attenzione agli artefatti del fissaggio!!!
Tomografia
Permette di
visualizzare strutture
intracellulari e di
averne una immagine
tridimensionale
Microscopia ottica
Tecniche non invasive:permettono lo studio delle
cellule vive e quindi sono utilizzate per lo studio
della dinamica dei processi
Yeast cells
DIC image
Nel microscopio ottico a campo chiaro la luce della sorgente di
illuminazione converge sul preparato attraverso il condensatore.
I campioni analizzati attraverso il microscopio a campo chiaro
vengono spesso colorati, poichè il basso contrasto rende il
campione poco visibile.
Microscopia a contrasto di fase
•
indice di rifrazione:
•
Parametro che rappresenta il fattore
numerico per cui la velocità di propagazione
di una radiazione elettromagnetica viene
rallentata, rispetto alla sua velocità nel vuoto,
quando questa attraversa un materiale.
Microscopio a contrasto di fase
si basa sull'incremento delle differenze di
contrasto tra il campione da analizzare e il
mezzo circostante, in modo tale da
consentirne la visualizzazione senza ricorrere
a metodologie di colorazione.
•
Il principio alla base di questo tipo di
microscopia è che il campione, per esempio
un preparato di cellule, ha un indice di
rifrazione differente dal mezzo circostante
e quando la luce lo attraversa viene deviata e
ritardata.
•
L'obiettivo del microscopio a contrasto di
fase amplifica questo effetto e porta alla
formazione di una immagine scura su campo
chiaro.
Proteine fluorescenti
Cellule HeLa che esprimono GFP
Il fenomeno della fluorescenza è stato
descritto per la prima volta da Sir. George
Stroke
Le molecole fluorescenti agiscono come
fonte di luce localizzata nell’area specifica
in cui viene emessa la fluorescenza
Che cosa è la
fluorescenza
esattamente?
L’energia
assorbita eccita
gli elettroni nel
fluoroforo a uno
stato energetico
più elevato.
Questi vibrando
e ruotando
perdono parte
dell’energia
acquisita, il
resto è restituita
come luce
fluorescente
quando gli
elettroni
ritornano allo
stato quiescente
Che cosa è la
fluorescenza
esattamente?
L’energia
assorbita eccita
gli elettroni nel
fluoroforo a uno
stato energetico
più elevato.
Questi vibrando
e ruotando
perdono parte
dell’energia
acquisita, il
resto è restituita
come luce
fluorescente
quando gli
elettroni
ritornano allo
stato quiescente
Green Fluorescent Protein (GFP)
Struttura
http://wwwbioc.rice.edu/
Bioch/Phillips/
Papers/gfpbio
.html
Fluoroforo di GFP:
Ser65-Tyr66-Gly67
It is very resistant to denaturation requiring treatment with 6 M
guanidine hydrochloride at 90 C or pH of <4.0 or >12.0. Partial
to near total renaturation occurs within minutes following
reversal of denaturing conditions by dialysis or neutralization.
Images from http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/GFP.html
Le proprietà spettrali delle proteine
fluorescenti sono dipendenti dalla
struttura
del fluoroforo così come dalla
localizzata interazione
dei residui aminoacidici nelle
immediate vicinanze, e in alcunicasi ,
dei residui lontani dal fluoroforo
Sorgente luminosa
Shift di STROKE
L’energia di una fonte luminosa viene catturata dal
fluoroforo della proteina fluorescente e viene riemessa
ad una lunghezza d’onda maggiore
Ogni fluoroforo ha una lunghezza d’onda di eccitazione
e di emissione specifica
La variazione di lunghezza d’onda assorbita ed emessa
si chiama Shift di Stroke
Video microscopia: studio della dinamica
delle proteine in vivo
Wagner et al.,2002
Time lapse:4 focal plane 0.2 micron apart x image
Visualizzazione dell’anello actomiosinico durante
a contrazione con l’utilizzo di proteine fuse a GFP
wt+Myo1GFP
Myo1GFP
Microscopia confocale
Mlc1p-YFP
Sec2p-CFP
Immagine
microscopia epifluorescente
Nuove tecnologie:
High throughput / High content microscopy
Microscopia ottica:
The cell is identified by the software
using DAPI intensity within the nuclei
Metodi di rottura delle cellule
Metodi meccanici :
1.Omogenizzatori
2.Frantumazione con abrasivi
3.Presse
4.Sonicazione
Metodi enzimatici:
Lisozima (batteri),
Zimoliasi, Liticasi (lieviti)
Chitinasi (funghi filamentosi)
Metodi meccanici : 1. omogenizzatori
1.Prodotto non
omogenizzato
2.Prodotto non
omogenizzato
1a. Omogenizzatori a pestello:
adatto per cellule animali e tessuti vegetali
non va bene per cellule di microorganismi.
-Il tessuto viene messo in un provettone di vetro all'interno del quale agisce un
pestello di vetro o di metallo
-Il tessuto è forzato a passare tra le pareti della provetta, che viene mantenuta
ferma, e il pistone mobile che ruota..
Le forze frizionali che si svilupperanno dipenderanno anche dalla velocità di
rotazione del pestello sono maggiori alla superficie del pestello e minori vicini alle
pareti dela provetta..
Microscopia a contrasto di fase
Cellule di lievito visualizzate tramite microscopia a contrasto di fase:
prima (1)
durante (2)
dopo (3)
DIC image:
Al punto di fuoco i raggi di luce convergente mostrano un interferenza che si
traduce in un aumento o diminuzione dell’ampiezza dell’onda risultante
percepita dall’occhio come una differenza di luminosità
1b. Omogenizzazione con palline di vetro:
per lieviti e batteri
Rottura meccanica delle cellule con GLASS BEADS
Cellule di lievito visualizzate tramite microscopia a contrasto di fase:
prima (1)
durante (2)
dopo (3)
Figure 1.
Figure 2
Figure 3.
Negative control
yeast without glass
beads.
Yeast disrupted for 5
min. with 425-600
mesh
glass beads.
Yeast disrupted for
10 min. with 425-600
mesh glass beads.
segue….Metodi meccanici :
2. Frantumazione con abrasivi:
Sospensioni di cellule vegetali e batteriche.
Le cellule vengono disgregate dall’abrasivo
Si può effettuare a mano con un pestello in un mortaio in presenza
di allumina o sabbia e tampone.
3. French Press::
Adatta cellule microbiche
La rottura avviene a causa di forze taglienti
4. ultrasuoni:
Viene utilizzato per piccole preparazioni di cellule di
microorganismi.
le cellule vengono introdotte in una camera dove vengono
generate onde sonore ad alta frequenza (maggiori di 20kHz)
per tempi variabili (30-60 secondi).
Queste onde generano ondate pressorie elevate che
rompono le cellule tramite forze taglienti e cavitazionali. Le
bolle di gas presenti nel mezzo inizialmente sono sotto
pressione ma quando si decomprimono si producono onde
d’urto che causano la rottura cellulare .
Questo metodo determina un elevato sviluppo di calore,
è quindi preferibile operare mantenendo il campione in
ghiaccio.
Perché
la lisi cellulare va effettuata in
Tamponi di lisi ?
I processi biologici richiedono un pH ottimale
Il pH ottimale per un dato enzima sarà il pH del
compartimento cellulare in cui l’enzima lavora :
Es. citoplasma pH =neutro,
Lisosomi pH=5,
succhi gastrici pH=1
Gli studi in vitro dei processi metabolici devono quindi
considerare il pH ottimale del processo enzimatico o cellulare
da studiare
pH e Soluzioni tampone
Gli elettroliti che reagiscono con l’H2O e aumentano
la quantità di OH- sono BASI, mentre gli acidi
aumentano la quantità di H+
una soluzione tampone
e’ una soluzione salina che permette di mantenere il pH
della soluzione inalterato anche in presenza di basi
o acidi aggiunti….
naturalmente entro certi limiti!!!
(capacità tamponante)
Una soluzione tampone
resiste alle variazioni di concentrazione
degli ioni H+ in seguito all’aggiunta di acidi o basi
La capacità tamponante  = db / d(pH)
db= db = quantità di base aggiunta
d(pH)= aumento del valore del pH risultante
dall’aggiunta della base
La capacità tamponante sarà massima quando pH=pKa
Ed ad alta concentrazione del tampone
Nella pratica le soluzioni tampone sono costituite da una
miscela di acido o base debole e dal loro sale
Es. acido acetico e sodio acetato
Tamponi di estrazione: COSA CONTENGONO?
Soluzioni tampone comunemente usate
Tris-HCl, K-fosfato
con forze ioniche tra 0.1 e 0.3 M e un pH tra 7 e 8
Che cos’altro contengono i tamponi di lisi ?
1.Antiossidanti:
DTT, -mercaptoetanolo, cisteina o glutatione ridotto.
La cellula ha un ambiente riducente ma dopo rottura le proteine si trovano
esposte ad un ambiente ossidante
SH- HS
S- S
ossidazione
2.Substrati enzimatici e cofattori
3.Agenti chelanti ioni divalenti:EDTA, EGTA
4.Sodio azide
Inibitori degli enzimi.
1) Inibitori di serin proteasi:
PMSF (fenilmetil sulfonilfluoro).
DFP (di-isopropilfosfofluoruro),
TPCK (Tosilfenilalanil-clorometilchetone)
2) Inibitori dell’ tiolo proteasi:
iodoacetato ;
cistatina.
3) Inibitore dell’ aspartico proteasi :
pepstatina.
4) Inibitori delle metalloproteasi:
EDTA ; 1,10-fenantrolina
5) Inibitori della esopeptidasi:
Amastatina; Bestatina
METODI DI Estrazione delle proteine
DETERGENTI
Si usano per solubilizzare
proteine intrinseche di
membrana
Ionici:
SDS, sodio deossicolato,
CTAB e CHAPS
Non – ionici:
Triton X-100 e Nonoident P-40
Proteine di membrana: Integrali e transmembrana
Image from :
http://en.wikipedia.org/wiki/Membrane_protein
Richiedono detergenti o solventi nonpolari per l’estrazione, sebbene alcune di
loro (beta-barrels) possono essere estratte
usando agenti denaturanti.
Membrana
Proteine periferiche
di membrana
Image from
:http://en.wikipedia.org/wiki/Membrane
_protein
Le
proteine
periferiche
di
membrana
sono
temporaneamente attaccate alla membrana lipidica o a
proteine
integrali
di
membrana
tramite
una
combinazione di legami idrofobici, elettrostatici e altre
interazioni non covalenti
Proteine solubili possono associarsi reversibilmente o
permanentemente a membrane grazie a modificazioni
Post-traduzionali che aggiungono code lipidiche
(es: prenili o GPI=glycosylphosphatidylinositol)
Esempio
di estrazione di
proteine associate
alle membrana
Le proteine intrinseche
di membrana si
solubilizzano con
detergenti
Quelle periferiche di
membrana dissociano a
seguito di un
trattamento con
reagenti polari, come
soluzioni che possiedono
un elevato pH o alte
concentrazioni saline