ANALISI DI BIOMOLECOLE
PROTEINE E AMINOACIDI
Determinazione della struttura primaria
HCl 6N
proteina
Amino acidi
110°C
24-72 ore
In queste condizioni drastiche alcuni amino acidi, come cisteina, triptofano
Asparagina, glutamina vengono distrutti
Accorgimenti specifici
Separazione e quantificazione degli amino acidi nell’idrolizzato
derivatizzazione
1-Dopo
2-Prima
separazione
1-Derivatizzazione dopo separazione:
-separazione su colonna a scambio ionico
-reazione con ninidrina
Gli amino acidi vengono fatti ragire a 100°C con la ninidrina
Si formano derivati colorati che vengono letti a 570 nm
2-Derivatizzazione prima della seprazione
-Reazione con dansil cloruro
fenilisotiocianato
o-ftaldeide
-Separazione su HPLC
Separazione su HPLC
Rottura dei ponti disolfuro
Determinazione della struttura primaria
• Metodo chimico
– Degradazione di Edman
• Metodo basato sul DNA ricombinante
Tappe sequenziali
1) Analisi sequenziale della porzione N-terminale della proteina
2) Scissione della proteina in peptidi, mediante proteolisi chimiche o enzimatiche
metodi enzimatici:
tripsina
chimotripsina
proteasi A
proteasi V8
metodi chimici:
BrCN
3) Separazione dei peptidi ottenuti
4) Analisi degli amminoacidi di ciascun peptide
5) Analisi sequenziale di ciascun peptide (Edman)
6) Allineamento dei peptidi
Polypeptide Fragmentation
Cleavage by Endopeptidases
NH
Rn-1
O
CH
C
NH
Rn
O
CH
C
scissile
peptide bond
Enzyme:
Trypsin
chains)
Specificity:
Rn-1 = Arg or Lys (positively charged side
Rn ≠ Pro
(highly specific enzyme; most useful)
Chymotrypsin
Rn-1 = Phe or Trp or Tyr
Rn ≠ Pro
N
N
N
C
C
C
C
N
trypsin
trypsin
trypsin
trypsin
chymotrypsin
chymotrypsin
CNBr
chymotrypsin
CNBr
Informazioni sulla proteina
ottenuta
• Confronto con le altre proteine conosciute
• Confronto con la stessa proteina in specie
diverse
• Sequenze per la localizzazione cellulare
• Ipotesi sulla struttura secondaria
• Sito attivo e mutazioni
• Sintesi sonde oligonucletidiche
Struttura secondaria e terziaria
• Molto difficoltosa
• Molto importante il contributo della
tecnologia del DNA ricombinante
• Metodi
–
–
–
–
spettrofluorimetria
Dicroismo circolare
NMR
Cristallografia ai raggi X
5) Spettrofluorimetria
La fluorescenza è un fenomeno di emissione.
La transizione di energia da uno stato più alto ad uno più basso è
accompagnata da una emissione di radiazione piuttosto che assorbimento.
Affinchè ciò avvenga deve prima avvenire un evento di eccitazione, ad es.
causato da assorbimento di radiazione elettromagnetica.
La l della radiazione di assorbimento deve essere più bassa
(energia più alta) di quella emessa (fluorescenza). La differenza di queste
due l è nota come “shift di stokes”.
E’ possibile per un composto assorbire (o essere eccitato) nel
UV ed emettere (o fluorescere) nel visibile.
Fosforescenza, simile ma l’emissione ha un tempo di decadimento più lungo e persiste anche quando l’eccitazione è terminata.
L’emissione della luce avviene a l maggiori della fluorescenza.
• Il meccanismo di diseccitazione con emissione di un fotone è
quello che accade in fluorescenza.
• Le proteine sono macromolecole facilmente studiabili con la
tecnica della spettrofluorimetria in cui la lunghezza d'onda
dell'energia emessa è maggiore della lunghezza d'onda
dell'energia assorbita. L’aumento di lunghezza d'onda è
chiamato spostamento o shift di Stokes.
• Poiché un quanto è pari all'energia necessaria per permettere il
salto di un elettrone, l'efficienza quantica Q è il rapporto tra i
quanti emessi per fluorescenza e i quanti assorbiti ed è
indipendente dalla lunghezza d'onda della luce di eccitamento.
• A basse concentrazioni, vale la relazione seguente tra l'intensità
di fluorescenza If e la radiazione incidente Io:
If = Io 2,3 e l c d Q
dove c=concentrazione molare del composto fluorescente;
d=cammino ottico, in cm, della soluzione fluorescente;
e= coefficiente di estinzione molare del composto che
assorbe alla lunghezza d'onda l
La tecnica della spettrofluorimetria è accurata a basse
concentrazioni dove la spettrofotometria non lo è.
100 pg catecolamine
100 mg catecolamine
spettrofluorimetria
spettroscopia
Selettività spettrale
Strumentazione:
due monocromatori
controllo T
E’ influenzata dal pH, temperatura, polarità del solvente ma
soprattutto dal “quenching” -----> la luce emessa viene persa
per collisione con altre molecole ====> bassa concentrazione
Applicazioni
Molte anche se pochi composti manifestano questo
fenomeno.
Il rilevamento di un composto non fluorescente può essere
ottenuto legandolo ad un probe fluorescente (fluorescenza
estrinseca). Se invece il composto nativo ha fluorescenza
(fluorescenza intrinseca).
aa legati tramite il gruppo -NH2 a cloruro di dansile
acridina orange dà coniugati diversi con DNA ss e ds.
L’utilizzo maggiore è la determinazione di sostanze presenti
in scarsa quantità:
vitamina B1 nel cibo, NADH, ormoni, droghe, pesticidi,
carcinogeni,…..
Spettrofluorimetria e studio del folding di una proteina
• La fluorescenza è diversa a seconda
dell’ambiente più o meno polare
dell’ambiente proteico in cui si trovano e
risente dell’effetto quenching creato
dall’interazione con altre molecole o altre
struttura chimiche delle proteine (ponti
disolfuro)
• Le fluorescenze sono diverse a seconda che
conservino la struttura terziaria o no
• La denaturazione comporta un allungamento
dello shift di Stokes e del cambiamento di
intensità dello spettro di emissione
• Abbiamo spettri caratteristici dello stato
folded che unfolded
• E’ possibile calcolare la % di proteina nei due
stati
fu = (yf - y) / (yf - yu)
fu: frazione unfolded;
yf : fluorescenza della proteina folded;
yu: fluorescenza della proteina unfolded
Y: fluorescenza del campione ad una particolare concentrazione di denaturante
Spettroscopia in dicroismo circolare (CD)
Questo tipo di spettroscopia
sfrutta la capacità degli isomeri
ottici di ruotare il piano della luce
polarizzata. La luce può essere
polarizzata in modo da selezionare
le onde elettromagnetiche che
oscillano su uno stesso piano
mediante il passaggio
della luce attraverso uno schermo
polarizzante o un prisma di Nicol.
La radiazione polarizzata in un piano
corrisponde alla sovrapposizione di
onde polarizzate circolarmente a
destra e a sinistra della stessa
intensità.
Se le due onde polarizzate circolarmente
a destra e a sinistra hanno intensità
diversa, la radiazione derivante dalla
loro somma è polarizzata ellitticamente.
Questa tecnica permette di misurare la variazione
dell'angolo di polarizzazione dopo che la luce ha
attraversato una sostanza chirale (otticamente
attiva).
Entrando in un materiale che assorbe
differentemente la radiazione
circolarmente polarizzata a destra e
quella circolarmente polarizzata a
sinistra, la luce incidente, polarizzata nel piano, esce
polarizzata ellitticamente.
L'ellitticità q è il parametro che viene misurato nella
spettroscopia CD ed è dato da:
q = 2.303 DE (180/4 p) = 33 DE gradi
DE è dato dalla differenza tra le componenti R ed L.
APPLICAZIONI
La principale è lo studio della conformazione delle macromolecole biologiche che si
integra con dati di NMR.
PROTEINE
Si possono avere informazioni sulla proporzione relativa delle strutture secondarie
(a eliche, foglietti b) presenti in una proteina in soluzione.
Nelle regioni del cosiddetto near UV si possono identificare picchi che derivano
dal contributo alla rotazione della luce polarizzata fornito da residui di triptofano
(intorno a 290 nm) di Phe e Tyr intorno a 280 nm e del disolfuro intorno a 270 nm.
- Determinazione della struttura secondaria di una proteina
- Studio dell’effetto del legame di farmaci sulle proteine
- Folding /denaturazione delle proteine
- Studio di interazione proteina-proteina e proteina-DNA
Il segnale CD di una proteina dipende dalla sua struttura secondaria
Gli spettri CD possono essere interessanti per:
- distinguere B, A e Z DNA;
- studiare variazioni della struttura causate da modificazione del pH, della forza
ionica o anche dall'interazione con DNA binding proteins.
Circular dichroism spectroscopy of HMGI-C binding to DNA. Near-UV CD
spectrum of 2 mM double-stranded CAnt1 oligonucleotide +/- 2 mM HMGI-C (1:1
molar ratio). The ellipticity values are given in terms of the molar concentration of
oligonucleotides. The solid line represents the oligonucleotide alone, while the
dashed line represents the oligonucleotide plus protein.
7. Turbidometria e nefelometria
Utilizzate per determinare la concentrazione di sospensioni diluite.
Nella turbidometria viene misurato l’assorbimento apparente della radiazione
quando attraversa la sospensione. La legge di Lambert e Beer non è applicabile .
Non avviene assorbimento ma fenomeni di dispersione in cui la luce è diffratta
dalle particelle sospese. Si usa sempre lo spettrofotometro.
APPLICAZIONI
Misura di sospensioni di microrganismi (batteri, lievito) lettura a 600 nm.
Cristallografia ai raggi X
Sono necessari cristalli di proteina
Componenti di una determinazione cristallografica
-La deviazione è proporzionale al numero di elettroni
-Le onde diffratte si rinforzano l’un l’altra se sono in fase o si si cancellano
se sono fuori fase
-La ricombinazione delle onde diffratte dipende dalla disposizione degli atomi
Lipidi
• relativa insolubilità in acqua
• estrazione con solventi organici: acetone, etere,
cloroformio in diversi rapporti tra loro.
• E’ possibile estrarre selettivamente alcune classi
di lipidi. Solventi non polari, come esano, etere,
cloroformio permettono l’estrazione di lipidi
neutri da tessuti adiposi.
• I lipidi di membrana richiedo solventi più polari
metanolo ed etanolo. Utilizzati sono anche i
metodi cromatografici: cromatografia di
adsorbimento e cromatografia su strato sottile.
Misurazione del glicerolo
I trigliceridi possono essere determinati misurando il glicerolo
rilasciato dopo idrolisi seguita da una reazione enzimatica accoppiata (test ottico accoppiato):
triacilglicerolo
H2C
OH
HC OH + ATP
glicerolo + acidi grassi
GLYCEROL KINASE
L-GLYCEROL-3-PHOSPHATE + ADP
H2C OH
PYRUVATE KINASE
ADP + PHOSPHOENOLPYRUVATE
PYRUVATE + NADH + H
+
PYRUVATE + ATP
L-LACTATE DEHYDROGENASE
L-LACTATE + NAD +
Misurazione del colesterolo
Il colesterolo viene determinato per reazione enzimatica con colesterolo ossidasi.
L’acqua ossigenata liberata può essere determinata colorimetricamente:
CHOLESTEROL + O2
METHANOL + H2O2
CHOLESTEROL OXIDASE
CATALASE
4-CHOLESTENON + H2O2
FORMALDEHYDE + 2 H2O
FORMALDEHYDE + NH4+ + 2 ACETYLACETONE
3,5-DIACETYL-1,4-DIHYDROLUTIDINE + 3 H2O
Estrazione DNA ed RNA
• Lisi cellulare
• Rimozione delle proteine (estrazione
organica fenolo/cloroformio equilibrata a
pH acido o neutro)
• Precipitazione acidi nucleici con etanolo
• Separazione DNA/RNA (centrifugazione)
pH neutro o alcalino
pH acido
Fase acquosa (DNA e RNA)
Interfaccia
(proteine denaturate)
Fase fenolica (proteine solubili)
.
Importanza del pH della saturazione del fenolo
Fase acquosa ( RNA)
Interfaccia
(proteine denaturate)
Fase fenolica
(proteine solubili e DNA)