e proteine
e
• 1OD = 50mg/ml di ds DNA
• 1OD = 40mg/ml di RNA
• 1OD = 33mg/ml di ssDNA
Legge di Lambert-Beer
l in cm
c in M
Al = -log10T = el c l
● E’ una legge monocromatica
● Soluzioni diluite: 10-3 – 10-5 M
A
2
1
0
concentrazione
STRUMENTAZIONE
SORGENTE: lampada di tungsteno (visibile) o lampada a
scarica di deuterio (UV)
CAMPIONE: si alloggia in celle al quarzo (UV) o in vetro
o policarbonato (visibile)
CONCENTRAZIONE: bisogna sceglierla in modo tale
che l’assorbanza non superi il valore di 2-3
Strumentazione
Il materiale usato nelle parti ottiche dipende dalla lunghezza d’onda usata.
UV: prismi, …. , cuvettes in quarzo o polimetil metacrilato
sopra i 350 nm vetro borosilicato o provettine di plastica
(polistirene)
Colorimetria e spettrofotometria
Il “detector” è una fotocellula dove una superficie sensibile riceve fotoni ed
una corrente viene generata che è proporzionale all’intensità del raggio di
luce che raggiunge la superficie.
Per strumenti UV/VIS ci sono due lampade:
1 al tungsteno -----> VIS
1 all’idrogeno o deuterio ------> UV
La lunghezza d’onda di 350 nm è il punto di “switch” fra l’una e l’altra.
Specchi per riflettere
Monocromatore -----> seleziona la lunghezza d’onda con prismi
(rifrazione) o mediante reticoli (diffrazione).
Cromoforo: parte di una molecola che indipendentemente dà
assorbimento (aminoacidi aromatici )
La sostanza è in soluzione !!! E’ sciolta cioè in un “mezzo” che di
solito è l’acqua o un tampone.
Sia il “mezzo” che il “contenitore” non devono assorbire e devono
essere scelti a seconda della lunghezza d’onda.
DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE
DI PROTEINE IN SOLUZIONE
Metodo gravimetrico (pesata)
Bisogna avere molto campione a disposizione ed allo stato puro altrimenti
l’errore può essere molto elevato.
Ha siti che possono reagire con altri gruppi, molecole,...
Cromofori di una proteina:
legame peptidico
Tyr max a 276 nm
Trp max a 280 nm
Phe max a 256-260 nm (poco)
ci si riferisce
all’ aminoacido libero
Cromofori nelle proteine
Il legame peptidico
(210 nm)
Ponte disolfuro
(250 nm)
Centrato a 280 nm
Metodo diretto
E’ necessario avere a disposizione molta proteina (metodo assoluto).
A 280 nm qual è il contributo di ciascun aa all’Assorbanza totale?
e Phe Tyr Trp cambia da proteina a proteina
Non c’è solo un problema di composizione ma di interazione fra anelli
aromatici diversi
Se ci sono più Tyr e non è dato dalla somma, dipende dalla posizione che
occupano sulla catena.
Metodo indiretto
Ad es. Bradford sono metodi relativi Blu di Comassie legato alla proteina è
blu se non è legato è marroncino. A 595 nm si misura l’Assorbanza del
complesso PD e non D.
METODI INDIRETTI
Molto spesso non è importante sapere la quantità assoluta,
ma avere un metodo riproducibile che sia sensibile e che permetta
di valutare la quantità in maniera relativa (avendo a disposizione uno standard).
Blu di Comassie si lega alle proteine, ma a tutte in egual misura?
P+C
PC
L’equilibrio deve essere tutto spostato a destra
Deve essere completa, bisogna usare cioè un largo eccesso di colorante.
Riassumendo:
1) la quantità che si lega deve essere la stessa per tutte le proteine;
2) la reazione deve essere completa;
3) il colorante libero non deve assorbire.
Metodo di Lowry
sensibilità: qtà inferiori a 10 mg/ml
Quando si mescola alla soluzione proteica il reagente di Folin (tungstato, molibdato e fosfato
di sodio) ed una soluzione di solfato di rame si sviluppa un colore blu-porpora che può essere
letto a 600 nm. Tris e tamponi zwitterionici (PIPES, HEPES) interferiscono.
Il colore sviluppato dipende dal contenuto di tirosina e triptofano.
Reaction schematic for the Modified Lowry Protein Assay.
Metodi dell’acido bicinconinico (BCA).
Simile al Lowry, dipende dalla conversione di Cu++ in Cu+ in condizioni alcaline che viene
poi rilevato mediante reazione con il BCA per ottenere un color porpora letto a 562 nm. E’
più sensibile rispetto al Lowry (qtà inferiori a 0.5mg/ml) e più tollerante per la presenza di
altri composti.
Bradford Protein Assay
The Bradford assay is a protein determination method that involves the binding
of Coomassie Brilliant Blue G-250 dye to proteins.
The dye exists in three forms:
cationic(red), neutral (green), and anionic (blue).
Under acidic conditions, the dye is predominantly in the doubly protonated red
cationic form (Amax = 470 nm). However, when the dye binds to protein, it is
converted to a stable unprotonated blue form (Amax = 595 nm).
It is this blue protein-dye form that is detected at 595 nm in the
assay using a spectrophotometer or microplate reader.
Work with synthetic polyamino acids indicates that Coomassie Brilliant Blue G-250
dye binds primarily to basic (especially arginine) and aromatic amino acid residues.
The extinction coefficient of a dye-albumin complex solution is constant over a 10fold concentration range. Thus, Beer's law may be applied for quantitation of protein.
Certain chemical-protein and chemical-dye interactions interfere with the assay.
Interference from non-protein compounds is due to their ability to shift the
equilibrium levels of the dye among the three colored species.
Selezione della proteina standard
La proteina ideale da usare come standard è la forma
assolutamente pura della proteina da dosare. In assenza di tale
proteina si può usare un’altra proteina come standard relativo.
Il miglior standard relativo deve dare una colorazione simile a
quella della proteina da saggiare. Le proteine più usate come
standars sono il BSA e la gamma-globulina
2) Spettroscopia a raggi gamma
Raggi gamma sono di origine nucleare, ad alta energia e quindi alto potere
penetrante.
Una importante applicazione dell’emissione a raggi gamma e’ l’uso di un elemento Tc
(tecnezio). Non e’ un elemento naturale ma prodotto dall’industria nucleare.
Tc è utile per studi medici perche’ se complessato con una sostanza si concentra in
alcuni tessuti (ossa, fegato, cervello) e può essere individuato grazie al suo
spettro di emissione.
3) Spettroscopia a raggi X
Raggi X: a differenza dei gamma originano dagli elettroni, possono essere assorbiti
dalla materia e questo produce spettri di emissione a raggi X. Si applicano regole
simili alla legge di Lambert e Beer. Applicazioni in campo forense e studi di
inquinamento ambientale perche’ permette di rivelare molti elementi e le loro
concentrazioni.
4) Luminometria
Luminescenza: emissione di radiazione elettromagnetica nella regione visibile come
risultato di una reazione chimica.
Luminometria: la tecnica usata per misurare la luminescenza.
Chemioluminescenza: come risultato di una reazione chimica (ad es. luminolo reagisce
con ossigeno e dà chemioluminescenza).
Bioluminescenza: viene emessa della luce in seguito ad una reazione catalizzata da un
enzima (di solito luciferasi). La lunghezza d’onda emessa dipende dal substrato usato
e varia da 560 nm (giallo verde) a 620 nm (rosso). Il metodo e’ estremamente
sensibile.
STRUMENTAZIONE
Non c’è necessità di un monocromatore.
1. Bisogna amplificare il segnale prima di registrarlo, viene infatti raccolto da
un fotomoltiplicatore collegato ad un amplificatore di corrente.
2. Controllare la T.
APPLICAZIONI
Il sistema della luciferasi di lucciola.
luciferina + ATP + O2
luciferasi
ossiluciferina + AMP + PPi + CO2 + luce
1. Misurazione dell’ATP
2. Utilizzo del luminolo (e derivati) come substrati di reazioni.
3. Misurazione della luciferasi come gene “reporter”.
1. Misurazione dell’ATP
2. Utilizzo del luminolo (e derivati) come substrati di reazioni.
Il luminolo assieme all’enzima microperossidasi può costituire la base del dosaggio di molti
enzimi tra cui l’acetilcolinesterasi (ACE), coinvolta nella trasmissione sinaptica:
acetilcolina
colina + O2 + H2O
H2O2 + luminolo
ACE
acido acetico + colina
colina ossidasi
microperossidasi
betaina + 2H2O2
acido aminoftalico + N2 + luce
3. Misurazione della luciferasi come gene “reporter”.
5) Spettrofluorimetria
La fluorescenza è un fenomeno di emissione.
La transizione di energia da uno stato più alto ad uno più basso è
accompagnata da una emissione di radiazione piuttosto che assorbimento.
Affinchè ciò avvenga deve prima avvenire un evento di eccitazione, ad es.
causato da assorbimento di radiazione elettromagnetica.
La l della radiazione di assorbimento deve essere più bassa
(energia più alta) di quella emessa (fluorescenza). La differenza di queste
due l è nota come “shift di stokes”.
E’ possibile per un composto assorbire (o essere eccitato) nel
UV ed emettere (o fluorescere) nel visibile.
Fosforescenza, simile ma l’emissione ha un tempo di decadimento più lungo e persiste anche quando l’eccitazione è terminata.
L’emissione della luce avviene a l maggiori della fluorescenza.
• Il meccanismo di diseccitazione con emissione di un fotone è quello
che accade in fluorescenza.
• Le proteine sono macromolecole facimente studiabili con la tecnica
della spettrofluorimetria in cui la lunghezza d'onda dell'energia emessa
è maggiore della lunghezza d'onda dell'energia assorbita. L’aumento di
lunghezza d'onda è chiamato spostamento o shift di Stokes.
• Poiché un quanto è pari all'energia necessaria per permettere il salto di
un elettrone, l'efficienza quantica Q è il rapporto tra i quanti emessi per
fluorescenza e i quanti assorbiti ed è indipendente dalla lunghezza
d'onda della luce di eccitamento.
• A basse concentrazioni, vale la relazione seguente tra l'intensità di
fluorescenza If e la radiazione incidente Io:
If = Io 2,3 e l c d Q
dove c=concentrazione molare del composto fluorescente;
d=cammino ottico, in cm, della soluzione fluorescente;
e= coefficiente di estinzione molare del composto che assorbe alla
lunghezza d'onda l
La tecnica della spettrofluorimetria è accurata a basse
concentrazioni dove la spettrofotometria non lo è.
100 pg catecolamine
100 mg catecolamine
spettrofluorimetria
spettroscopia
Selettività spettrale
Strumentazione:
due monocromatori
controllo T
E’ influenzata dal pH, temperatura, polarità del solvente ma
soprattutto dal “quenching” -----> la luce emessa viene persa
per collisione con altre molecole ====> bassa concentrazione
Applicazioni
Molte anche se pochi composti manifestano questo
fenomeno.
Il rilevamento di un composto non fluorescente può essere
ottenuto legandolo ad un probe fluorescente (fluorescenza
estrinseca). Se invece il composto nativo ha fluorescenza
(fluorescenza intrinseca).
aa legati tramite il gruppo -NH2 a cloruro di dansile
acridina orange dà coniugati diversi con DNA ss e ds.
L’utilizzo maggiore è la determinazione di sostanze presenti
in scarsa quantità:
vitamina B1 nel cibo, NADH, ormoni, droghe, pesticidi,
carcinogeni,…..
Spettrofluorimetria e studio del folding di una proteina
• La fluorescenza è diversa a seconda dell’ambiente
più o meno polare dell’ambiente proteico in cui si
trovano e risente dell’effetto quenching creato
dall’interazione con altre molecole o altre struttura
chimiche delle proteine (ponti disolfuro)
• Le fluorescenze sono diverse a seconda che
conservino la struttura terziaria o no
• La denaturazione comporta un allungamento dello
shift di Stokes e del cambiamento di intensità
dello spettro di emissione
• Abbiamo spettri caratteristici dello stato folded
che unfolded
• E’ possibile calcolare la % di proteina nei due stati
fu = (yf - y) / (yf - yu)
fu: frazione unfolded;
yf : fluorescenza della proteina folded;
yu: fluorescenza della proteina unfolded
Y: fluorescenza del campione ad una particolare concentrazione di denaturante
5. Separatore di cellule a fluorescenza (FACS)
515 nm
580 nm
650 nm
Analisi citofluorimetrica dei leucociti del sangue periferico. Si noti come si possono
facilmente identificare tre popolazioni, ovvero i linfociti, monociti e granulociti, ed
eventualmente disegnarci intorno un “gate” elettronico che permetterà in seguito l’analisi
del segnale di fluorescenza proveniente soltanto dalla popolazione scelta.
Lo studio dei parametri fisici applicato a nuclei isolati (provenienti da cellule trattate con
una soluzione ipotonica) permette anche di discriminare immediatamente cellule normali
da cellule apoptotiche, i cui nuclei sono infatti condensati e raggrinziti, ovvero diminuiscono il FSC ed aumentano il SSC.
Spettroscopia in dicroismo circolare (CD)
Questo tipo di spettroscopia
sfrutta la capacità degli isomeri
ottici di ruotare il piano della luce
polarizzata. La luce può essere
polarizzata in modo da selezionare
le onde elettromagnetiche che
oscillano su uno stesso piano
mediante il passaggio
della luce attraverso uno schermo
polarizzante o un prisma di Nicol.
La radiazione polarizzata in un piano
corrisponde alla sovrapposizione di
onde polarizzate circolarmente a
destra e a sinistra della stessa
intensità.
Se le due onde polarizzate circolarmente
a destra e a sinistra hanno intensità
diversa, la radiazione derivante dalla
loro somma è polarizzata ellitticamente.
Questa tecnica permette di misurare la variazione
dell'angolo di polarizzazione dopo che la luce ha
attraversato una sostanza chirale (otticamente
attiva).
Entrando in un materiale che assorbe
differentemente la radiazione
circolarmente polarizzata a destra e
quella circolarmente polarizzata a
sinistra, la luce incidente, polarizzata nel piano, esce
polarizzata ellitticamente.
L'ellitticità q è il parametro che viene misurato nella
spettroscopia CD ed è dato da:
q = 2.303 DE (180/4 p) = 33 DE gradi
DE è dato dalla differenza tra le componenti R ed L.
APPLICAZIONI
La principale è lo studio della conformazione delle macromolecole biologiche che si
integra con dati di NMR.
PROTEINE
Si possono avere informazioni sulla proporzione relativa delle strutture secondarie
(a eliche, foglietti b) presenti in una proteina in soluzione.
Nelle regioni del cosiddetto near UV si possono identificare picchi che derivano
dal contributo alla rotazione della luce polarizzata fornito da residui di triptofano
(intorno a 290 nm) di Phe e Tyr intorno a 280 nm e del disolfuro intorno a 270 nm.
- Determinazione della struttura secondaria di una proteina
- Studio dell’effetto del legame di farmaci sulle proteine
- Folding /denaturazione delle proteine
- Studio di interazione proteina-proteina e proteina-DNA
Il segnale CD di una proteina dipende dalla sua struttura secondaria
Gli spettri CD possono essere interessanti per:
- distinguere B, A e Z DNA;
- studiare variazioni della struttura causate da modificazione del pH, della forza
ionica o anche dall'interazione con DNA binding proteins.
Circular dichroism spectroscopy of HMGI-C binding to DNA. Near-UV CD
spectrum of 2 mM double-stranded CAnt1 oligonucleotide +/- 2 mM HMGI-C (1:1
molar ratio). The ellipticity values are given in terms of the molar concentration of
oligonucleotides. The solid line represents the oligonucleotide alone, while the
dashed line represents the oligonucleotide plus protein.
7. Turbidometria e nefelometria
Utilizzate per determinare la concentrazione di sospensioni diluite.
Nella turbidometria viene misurato l’assorbimento apparente della radiazione
quando attraversa la sospensione. La legge di Lambert e Beer non è applicabile .
Non avviene assorbimento ma fenomeni di dispersione in cui la luce è diffratta
dalle particelle sospese. Si usa sempre lo spettrofotometro.
APPLICAZIONI
Misura di sospensioni di microrganismi (batteri, lievito) lettura a 600 nm.