Davide Schiavone
Biochimica
A.A. 2004-2005
I miRNA NEI MECCANISMI
ANTIVIRALI
I processi di difesa antivirale operati da RNA sfruttano diversi meccanismi
che sono raggruppati sotto il nome di RNA silencing.
La prima indicazione del ruolo biologico dell’RNA silencing avvenne in
esperimenti di overespressione di transgeni in piante. In tali esperimenti si
volevano inserire copie soprannumerarie degli enzimi responsabili della
pigmentazione per ottenere piante con fiori intensamente colorati. Cio che
inaspettatamente si ottenne furono piante con fiori bianchi. Si comprese in
seguito che si erano instaurati dei meccanismi che portavano al
silenziamento dei transgeni introdotti e del corrispondente gene endogeno.
Una seconda indicazione dell’ esistenza di meccanismi di silenziamento
operati da RNA, fu il fatto che piante infettate da virus accumulano
vsRNAs (viral short RNAs).
Esistono diversi meccanismi tramite cui agisce il silenziamento che si
dividono in: silenziamento pre-trascrizionale e silenziamento posttrascrizionale.
La maggior parte degli studi sui meccanismi di protezione antivirale
operati da RNA sono stati compiuti in piante.
I meccanismi antivirali nelle piante
Tutti i processi di silenziamento che sono stati individuati nelle piante,
hanno la caratteristica comune di essere innescati da dsRNA (double
strand RNA). Le fonti primarie di dsRNA variano a seconda del tipo di
virus che infetta la pianta. Il caso più comune è rappresentato dai virus a
RNA che costituiscono il 90% dei virus delle piante. Tali virus possiedono
un genoma ad RNA a singolo filamento e si replicano tramite un
intermedio di replicazione a doppio filamento di RNA. Tale dsRNA può
essere incorporato dagli enzimi dell’RNA silencing ed innescare il
processo di silenziamento. Un’altra fonte di RNA a doppio filamento e
costituita dagli hairpin che si formano grazie al ripiegamento di ssRNA
virali, sfruttando l’appaiamento di zone omologhe presenti lungo la
sequenza. Un discorso analogo può essere fatto per i retrotrasposoni e con
i virus a DNA. Il concetto fondamentale e lo stesso, ossia che durante le fasi
replicative del virus si vengono a formare degli intermedi di RNA a doppio filamento
che possono essere riconosciuti e incorporati dagli enzimi dell’apparato di
silenziamento.
Fig.1: fonti primarie di dsRNA
I pathways antivirali nelle piante
Esistono diversi meccanismi di silenziamento che variano a seconda
dell’origine del dsRNA.
• TGS pathway (transcripional gene silencing): ha luogo nel nucleo ed
è solitamente innescato da retrotrasposoni i quali possono produrre
dsRNA che sono processati da DCL3 (DICER-like protein 3) a dare
siRNA. Un’altra possibilità è che i retrotrasposoni producano ssRNA
che vengono utilizzati come stampo da una RNA polimerasi RNAdipendente (RDR2) per produrre dsRNA che vengono a loro volta
processati in siRNA. Un’ultima possibilità è che i ssRNA si
ripieghino su se stessi a formare hairpin che vengono nuovamente
processati per dare siRNA. In tutti e tre i casi il risultato finale è la
metilazione del gene target (o del suo promotore) con il conseguente
silenziamento trascrizionale.
• VIGS pathway (virus-induced gene silencing): il pathway primario
ha luogo nel citoplasma in cui DCL2 interagisce con gli stem-loop
presenti sull’RNA virale e porta alla formazione di viral small
interfering RNA. Questi siRNA di origine virale vengono “srotolati”
da una RNA elicasi ed incorporati in RISC che contatta la sequenza
target e la degrada clivandola. Esiste un pathway secondario del
VIGS in cui i siRNA prodotti nel pathway primario vengono replicati
grazie ad una RNA polimerasi, permettendo l’amplificazione del
silenziamento.
• miRNA pathway: ha origine nel nucleo in cui gli hairpin che si
vengono a formare dall’RNA virale sono processati da Dicer a dare
dei miRNA che vengono trasportati nel citoplasma da una esportina.
Nel citoplasma i frammenti di RNA vengono legati da RISC che
degrada le sequenze target.
In questo pathway quindi, gli RNA
virali danno origine a miRNA i quali vengono però processati come
siRNA e come tali agiscono, causando il silenziamento tramite
degradazione della sequenza target.
I meccanismi tramite i quali si può avere silenziamento genico sono
quindi: METILAZIONE e CLIVAGGIO.
Fig.2: pathways antivirali nelle piante
Il silenziamento è un fenomeno sistemico
Una caratteristica molto interessante del sistema di protezione antivirale
presente nelle piante è quella di essere in grado di diffondersi da una
zona localizzata (ad es.una foglia) all’intera pianta conferendo una
resistenza completa contro il virus.
Questo fenomeno è stato dimostrato in piante transgeniche per GFP che
quando illuminate emettono fluorescenza verde.Iniettando in una foglia
di queste piante un costrutto in grado di dare origine a siRNA anti-GFP
si osserva una scomparsa della fluorescenza a livello locale indicando
che effettivamente si ha la distruzione dell’mRNA codificante per GFP.
Con il passare del tempo si osserva però che la fluorescenza scompare
anche in altre zone, inizialmente lungo i vasi linfatici ed in seguito in
tutta la pianta.
Questo avviene grazie ad un meccanismo di amplificazione dei siRNA
(siRNA amplification cycle) operato da RNA polimerasi RNAdipendenti (RDR6) e da elicasi (SDE3). I siRNA così amplificati sono
in grado di diffondere alle cellule adiacenti tramite dei canali e
diffondere il silenziamento all’intera pianta.
Questo meccanismo può quindi essere considerato un vero e proprio
sistema immunitario GENETICO della pianta in quanto conferisce una
protezione contro agenti virali in modo altamente specifico (sequenzaspecifico) e diffuso all’intera pianta.
Fig.3: induzione sistemica del silenziamento nelle piante
Strategie virali anti-silenziamento
Come in tutte le interazioni ospite-parassita, i virus hanno evoluto delle
contromosse per sfuggire ai meccanismi di silenziamento operati dalle
piante. Queste strategie virali operano in vario modo, ad esempio:
• Interferendo con le molecole effettrici: è stata identificata una
proteina virale, la proteina P19 in grado di legare i siRNA ed i
miRNA non rendendoli disponibili a RISC e bloccando il
silenziamento. La cosa sorprendente e che questa proteina
funziona con tutti i siRNA/miRNA (basta che abbiano una
lunghezza di circa 21 bp) sia nelle piante che in altri organismi
come C.elegans e addirittura nell’uomo (come si vedrà più avanti).
• Alterando il trascrittoma dell’ospite: alcuni virus sono in grado di
far produrre alla pianta delle proteine endogene in quantità molto
maggiore rispetto al normale.Tali proteine ad alte concentrazioni
si comportano da dominanti-negativi nei confronti di altre proteine
del pathway di silenziamento inibendolo.
• Producendo miRNA/siRNA difettivi: i virus sono in grado di
mutare rapidamente portando alla formazione di hairpin con
strutture anomale (es. diverso ripiegamento della sequenza di
RNA e formazione di loop in zone differenti) che non vengono
riconosciute dall’ apparato di silenziamento.
• Evadendo il sistema di silenziamento: alcuni virus adottano una
strategia evasiva piuttosto che inibitoria e compiono tutti gli stadi
replicativi racchiusi in vescicole. In questo modo le fasi più
pericolose per il virus in cui si vengono a formare degli intermedi
a dsRNA che possono innescare i processi di silenziamento
avvengono in compartimenti isolati.
Esiste quindi una continua lotta che vede contrapposti i meccanismi
difensivi adottati dalle piante contro i meccanismi evasivi virali.
E’importante notare che i meccanismi di RNA silencing di difesa
contro i virus presenti nelle piante sono basati sul processo dell’RNA
interference.
E per quanto riguarda i vertebrati?
Meccanismi antivirali analoghi a quelli presenti in piante ed insetti
non erano mai stati dimostrati fino all’uscita di un lavoro che
dimostra la presenza di un meccanismo di silenziamento mediato da
miRNA nelle cellule umane.
Proteina inibitoria P19
Alterazione del trascrittoma dell’ospite
Produzione di siRNA difettivi
La difesa antivirale nei vertebrati
(Lecellier et al. A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells SCIENCE 2005 VOL308 557)
In questo articolo è riportato lo studio sul virus PFV-1, un retrovirus
della famiglia dell’HIV in grado di infettare cellule umane. Ciò che
ha attirato l’attenzione dei ricercatori è stata l’osservazione che
cellule esprimenti la proteina virale P19 (la proteina in grado di
legare i siRNA/miRNA vista in precedenza) accumulano RNA
virale. Questo ha suggerito ai ricercatori la presenza di un pathway di
siRNA o miRNA operante nelle cellule in grado di limitare la
replicazione virale.
Per dimostrare l’esistenza di tale meccanismo hanno trasfettato delle
cellule wild-type con dei costrutti costituiti da vari frammenti del
genoma virale legati al gene reporter GFP. Hanno quindi osservato
che i livelli proteici di GFP di uno dei costrutti (GFP-F11) era
nettamente più basso, pur non variando la quantità di mRNA. E’
stata quindi ipotizzata la presenza di un meccanismo di silenziamento
traduzionale operato da miRNA.
La sequenza del costrutto F11 è stata quindi inserita in un
programma di predizione computazionale che ha trovato una
corrispondenza ad alta probabilità con il microRNA umano miR-32.
Il passo successivo è stato quello di andare a vedere se effettivamente
il miR-32 è in grado di silenziare la traduzione di GFP legata alla
sequenza target del microRNA. E’ stato visto che effettivamente si
ottiene il silenziamento della sequenza target ma non della stessa
sequenza contenente mutazioni.
Dimostrata la presenza e l’efficacia di un miRNA antivirale i
ricercatori sono andati a ricercare l’eventuale presenza di una
proteina virale anti-silenziamento. Il fatto che i virus delle piante
puntualmente sviluppano delle contromosse difensive ha fatto
ritenere che lo stesso fenomeno dovesse verificarsi anche nelle
cellule di vertebrato.
L’attenzione è stata rivolta verso la proteina virale Tas (ritenuta
interessante grazie a studi bioinformatici) e la sua efficacia è stata
testata in un sistema eterologo: Arabidopsis.
Questo tipo di pianta normalmente produce dei semi di colore
marrone a causa di un pigmento prodotto dall’enzima Calcone
Sintasi. Esiste una linea transgenica di Arabidopsis che esprime un
costrutto che da origine ad un siRNA contro la Calcone Sintasi con la
conseguente produzione di semi gialli a causa della mancata
produzione di pigmento.
L’espressione di Tas in tali piante porta alla produzione di semi
marroni come nelle piante wild-type, confermando che tale proteina
virale è in grado di inibire i pathway di miRNA/siRNA.
Conclusioni
Questo lavoro ha dimostrato che un meccanismo antivirale basato sul
fenomeno dell’RNA silencing è presente anche nei vertebrati e che si
tratta quindi di un meccanismo conservato dall’evoluzione.
La dimostrazione dell’esistenza di tale meccanismo nelle cellule
umane, apre inoltre interessanti prospettive terapeutiche in chiave di
terapie antivirali anche se si tratta solo di uno studio preliminare che
richiede ulteriori chiarimenti e dimostrazioni.
Bibliografia :
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Voinnet Induction and suppression of RNA silencing: insights from viral infection
NATURE 2005 Vol.6 , 206-221
Lecellier et al. A cellular MicroRNA mediates antiviral defense in human cells
SCIENCE 2005 Vol.308 , 557-560
Waterhouse et al. Gene silencing as an adaptive defence against viruses
NATURE 2001 Vol 411, 834-842
Voinnet RNA silencing as a plant immune system against viruses
TRENDS in Genetics 2001 Vol.17, 449-459
Bartel MicroRNAs:genomics, biogenesis mechanism, and function
Cell 2004 Vol.116, 281-297