FACOLTA’ MEDICINA E ODONTOIATRIA
Laurea triennale in
Tecniche di Laboratorio Biomedico
Traslocazioni cromosomiche e infertilità di coppia
Relatore
Liana Marcucci
Laureanda
Antonella Di Stefano
Matricola 1212077
Anno Accademico 2010/2011
Antonella Di Stefano
0
INDICE
1 INTRODUZIONE …………………………...……………………………….. 2
1.1 Traslocazioni cromosomiche ………...…………………………… 2
1.1.1 Meccanismi di origine ………...…………………………….... 2
1.1.2 Classificazione delle traslocazioni ….…………………....... 4
2 PARTE SPERIMENTALE ..………………………………………………. 10
2.1 Materiali e metodi ………………………………………………. 10
2.1.1 Studi citogenetici …..……………………………...… 10
2.1.2 Analisi FISH ………………………...………………… 13
2.1.3 Analisi PCR …………………......…………………..... 14
2.1.4 Analisi di alberi genealogici familiari ...………….. 15
3 RISULTATI ……………………………………………………………….… 36
4 CONCLUSIONI …………………………………………………………….. 39
5 BIBLIOGRAFIA ……………………………………………………………. 44
Antonella Di Stefano
1
1 INTRODUZIONE
1.1 Traslocazioni cromosomiche
Le traslocazioni cromosomiche sono tra le più comuni anomalie genetiche.
Queste alterazioni si riscontrano a seguito dell’analisi del cariotipo e da
ricerche statistiche si è visto che sono presenti nello 0,2% dei neonati,
nello 0,6% delle coppie infertili e fino al 9,2% nei pazienti con aborti
ricorrenti. I portatori di traslocazioni bilanciate hanno un rischio maggiore
di concepire embrioni con anomalie cromosomiche (Pappalardo, 2010).
1.1.1 Meccanismi di origine
Le traslocazioni sono riarrangiamenti cromosomici che si originano da
eventi di rottura a doppio filamento del DNA cromosomico. Eventi di
rottura insorgono fisiologicamente durante la duplicazione del DNA ad
opera delle Topoisomerasi. Le DNA topoisomerasi sono enzimi di
importanza cruciale per il mantenimento dell’integrità genomica e per la
regolazione
delle
strutture
topologiche
del
DNA.
Tutte
le
DNA
topoisomerasi presentano due caratteristiche fondamentali:
 la prima è la capacità di rompere e, poi, risaldare lo scheletro
fosfodiesterico
del
DNA
in
due
successive
reazioni
di
transesterificazione;
 la seconda caratteristica delle DNA topoisomerasi è che, una volta
formatosi
l’intermedio
DNA–proteina,
l’enzima
permette
alle
estremità dei filamenti spezzati di essere separate, aprendo così un
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2
passaggio per un altro segmento di DNA a doppio o a singolo
filamento.
Questo passaggio di un segmento di DNA attraverso la rottura di un altro
segmento provoca un cambiamento topologico del DNA, come ad
esempio una variazione del numero di legame, oppure la decatenazione di
due anelli di DNA catenati. Dalla scoperta della prima DNA topoisomerasi
I in E. coli nel 1971 questi enzimi sono stati trovati in tutte le cellule
eucariote e procariote. Sulla base della capacità di tagliare un singolo o un
doppio filamento di DNA, questi enzimi sono classificati, rispettivamente,
in DNA topoisomerasi di tipo I e II (Baker et al., 2009).
Un secondo evento fisiologico che determina rottura del DNA, si verifica
nella gametogenesi durante la profase I meiotica, mediante il processo di
crossing-over, un importante meccanismo di ricombinazione del materiale
genetico che permette una maggiore varietà nei prodotti della riproduzione
sessuata (Klug et al., 2007). Durante il crossing-over non si ha né perdita
né acquisizione di materiale genetico, perché esso determina scambi
reciproci.
Inoltre, le caratteristiche chimico-fisiche del DNA rendono questa molecola
stabile e dinamica e suscettibile di diversi tipi di risposta a insulti
ambientali. La sequenza nucleotidica può, infatti, modificarsi per gli errori
prodotti spontaneamente dalla DNA-polimerasi, per la rottura spontanea di
regioni cromosomiche fragili o per l’effetto di agenti chimici e fisici
genotossici. Fisiologicamente, le cellule hanno sviluppato differenti
meccanismi di riparazione del DNA che garantiscono una relativa stabilità
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3
del genoma attraverso l’intervento di “guardiani del genoma” come la
proteina ATM. Alcuni meccanismi di riparazione riparano correttamente
(error free) e non lasciano tracce della mutazione indotta. Tuttavia se il
danno è consistente e prolungato, intervengono meccanismi meno
accurati di riparazione che sono invece “error prone”, inclini quindi
all’errore, come ad esempio i Sister Chromatid Exchange (SCE),
visualizzazione citogenetica di crossing-over somatici.
1.1.2 Classificazione delle traslocazioni
Le traslocazioni possono essere classificate in:
1. traslocazioni germinali;
2. traslocazioni somatiche.
Traslocazioni germinali
Sono traslocazioni ereditarie presenti a livello degli ovociti e degli
spermatozoi; Sono causa di un aumentato rischio riproduttivo, sia per
abortività ricorrente, sia per la possibilità di avere figli nati vivi con uno
sbilanciamento cromosomico e quindi con una sindrome cromosomica. Se
ne possono distinguere diversi tipi.
- Traslocazione reciproca bilanciata: l’incidenza di queste traslocazioni è di
1 su 625 nati (Traversa et al., 2010) e sono dovute ad uno scambio di
regioni tra cromosomi non omologhi. Queste fanno seguito ad una rottura
singola di due cromosomi e possono comportare variazioni nella
lunghezza dei cromosomi che restano, però, sempre monocentrici. Solo di
rado nella traslocazione possono essere coinvolti anche più cromosomi
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(traslocazioni complesse o “jumping translocations”). Le traslocazioni
reciproche, quando bilanciate e familiari, non comportano anomalie del
fenotipo (Ventruto et al, 2001).
Per definizione, una traslocazione reciproca bilanciata conserva integra la
quantità di materiale cromosomico normale. I punti di rottura che si
trovano nella cromatina non
informativa
sviluppo
consentono
embrionale.
lo
Se,
invece, il punto di rottura
colpisce geni normalmente
espressi, la cui informazione
è essenziale per le varie fasi
dello
sviluppo,
potrebbe
essere
l’embrione
eliminato
con aborto spontaneo.
Per quanto riguarda i portatori maschili di una traslocazione bilanciata, la
possibilità di generare spermatozoi con anomalie cromosomiche varia dal
20 all’80%, secondo il tipo di traslocazione, i cromosomi coinvolti e la
posizione dei punti di rottura.
-
Traslocazioni
reciproche
bilanciate
“de
novo”:
insorgono
nella
gametogenesi di uno dei due genitori, che risultano quindi avere cariotipo
normale. Le cause che portano allo sviluppo di una mutazione de novo
possono essere diverse, ma comuni sono quelle indotte da mutageni fisici
quali le radiazioni. Il rischio di anomalie nel fenotipo è più elevato rispetto
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a quello determinato dalle traslocazioni reciproche bilanciate (circa il 10%)
e solitamente vengono scoperte casualmente in individui con insuccessi
riproduttivi, in adolescenti con anomalie dello sviluppo sessuale o durante
le analisi cromosomiche prenatali; in quest’ultimo caso, non essendo
possibile una conferma a livello fenotipico, è difficile stabilire se queste
traslocazioni siano realmente bilanciate.
- Traslocazioni sbilanciate robertsoniane: si verificano quando due
cromosomi acrocentrici si uniscono a livello dei centromeri; il risultato è un
singolo cromosoma anomalo che contiene entrambi bracci lunghi dei due
cromosomi originali, con conseguente perdita dei bracci corti e spesso di
un centromero, per cui le cellule dei portatori bilanciati risultano aneuploidi
(45 cromosomi). Poiché sui bracci corti di tutti i dieci cromosomi
acrocentrici sono localizzati i geni per l’RNA ribosomiale, la perdita di due
bracci corti non comporta effetti fenotipici. L’incidenza di queste
traslocazioni è di 1/900 nati (Traversa et al., 2010).
Il 5% di tutti i casi di Sindrome di Down è originato da una traslocazione
robertsoniana,
la maggior
parte delle
volte tra i
cromosomi 14
e 21. I portatori
di questa
traslocazione sono aneuploidi con apparenti 45 cromosomi dei quali uno è
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costituito dai due bracci lunghi dei cromosomi 14 e 21 e risultano
fenotipicamente normali (Berend et al, 2003).
Traslocazioni somatiche e cancro
Sono traslocazioni sporadiche poiché insorgono in una cellula somatica.
In relazione ai punti di rottura questa cellula può guadagnare un
vantaggio replicativo che, con successivi eventi di mutazione, la trasforma
in una cellula tumorale. In particolari situazioni, spesso in presenza di
concomitanti fattori ambientali mutageni che creano una situazione di
stress per la cellula, la frequenza di induzione del danno e la sua gravità
risultano superiori rispetto alla capacità dei sistemi di riparazione della
cellula. Si ha, quindi, un danno irreversibile nella cellula e di conseguenza
una proliferazione sregolata.
Il
meccanismo
di
attivazione
per
traslocazione
cromosomica
è
particolarmente frequente nelle neoplasie del sistema ematopoietico e nei
sarcomi. La caratteristica costante delle traslocazioni cromosomiche
studiate finora è rappresentata dall’alterazione nella struttura o nella
regolazione di un protooncogene. Due sono i meccanismi di base
attraverso cui una traslocazione può agire. Da un lato, la traslocazione
può allontanare il protooncogene dalle sue normali strutture regolatorie e
posizionarlo sotto nuovi elementi di controllo. Come conseguenza, il
protooncogene può essere espresso in tessuti nei quali normalmente è
silenziato o, nel caso sia espresso già nel tessuto normale da cui il tumore
deriva, può essere sottratto ai fini meccanismi di controllo che lo regolano
in condizioni fisiologiche.
Antonella Di Stefano
7
Un secondo meccanismo attraverso cui una traslocazione può agire è
rappresentato dalla formazione di un trascritto di fusione, derivante
dall'unione di due geni localizzati nei due punti di rottura dei cromosomi
coinvolti nella traslocazione.
T (9; 22)
Tutti i casi di leucemia mieloide cronica propriamente detta presentano
una caratteristica anomalia citogenetica, il cromosoma Philadelphia,
derivante dalla traslocazione t (9; 22). Questa traslocazione sposta
l’oncogene ABL,
che normalmente
mappa in 9q34 e
codifica per una
tirosinchinasi
citoplasmatica,
sul
cromosoma
22q11,
dove
si
localizza il gene
BCR. Di conseguenza si forma un trascritto di fusione che codifica per un
mRNA ibrido BCR/ABL e per una proteina chimerica chiamata p210. La
conseguenza funzionale della traslocazione BCR/ABL è la localizzazione
citoplasmatica e l’attivazione costitutiva del dominio tirosinchinasico di
ABL. Bersaglio della fosforilazione da parte di BCR/ABL sono numerose
proteine coinvolte nella proliferazione, differenziazione, sopravvivenza,
adesione e riparazione del DNA nelle cellule staminali emopoietiche.
Antonella Di Stefano
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Se una regione di un cromosoma viene rilocalizzata o riarrangiata in
seguito a traslocazione, la normale espressione dei geni contenuti in
quella regione cromosomica può essere modificata (effetto posizione).
Questo è particolarmente vero se il gene viene a essere posizionato
all’interno o vicino a certe regioni del cromosoma che sono compattate e
inerti da un punto di vista trascrizionale quale è l’eterocromatina.
Nonostante i molti danni, le traslocazioni, come tutte le mutazioni,
svolgono un ruolo importante nell'evoluzione: ad esempio, scimpanzé,
gorilla e oranghi hanno tutti 48 cromosomi, mentre l'uomo ne possiede 46.
Il secondo cromosoma umano, che è grosso e metacentrico, presenta
bande G sovrapponibili a quelle osservate su due differenti cromosomi
acrocentrici dei primati. Questo fatto, potrebbe essere il sintomo che in un
antenato dell'uomo si sia verificata una fusione centrica, che diede origine
ad un grosso cromosoma metacentrico. Inoltre, altri riarrangiamenti
cromosomici hanno portato all’evoluzione dei geni delle catene α e β
dell’emoglobina umana e all’evoluzione del cromosoma Y a partire da una
coppia di omologhi. Tuttavia l’insorgenza di una mutazione cromosomica
in una cellula, germinale o somatica, potrebbe causare mutazioni geniche
o anomalie durante la meiosi.
Quindi, data la diversità e la frequenza di questi riarrangiamenti
cromosomici, è consigliabile, soprattutto in presenza di anomalie
cromosomiche familiari e in caso di problemi di fertilità eseguire l’analisi
del cariotipo seguito, se necessario, da altre analisi specifiche.
Antonella Di Stefano
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2 PARTE SPERIMENTALE
Studio di:
 Traslocazioni bilanciate autosoma/autosoma;
 Traslocazioni sbilanciate robertsoniane;
 Traslocazioni reciproche bilanciate “de novo”;
 Traslocazioni cromosoma sessuale/autosoma.
L’analisi è stata effettuata mediante l’utilizzo di alberi genealogici familiari,
cariotipo standard, FISH e PCR.
2.1 MATERIALI E METODI
2.1.1 Studi citogenetici
Allestimento delle colture di linfociti periferici e dei preparati
cromosomici
I linfociti del sangue venoso periferico eparinizzato (0,5 ml) proveniente
dai pazienti analizzati, sono coltivati in terreno RPMI con aggiunta del 20%
di siero fetale, antibiotici (penicillina, streptomicina) e 0,1 ml di
fitoemoagglutinina M. Per ogni paziente sono allestite tre colture
indipendenti; le colture sono incubate per 72 ore a 37 °C; a due di esse, 6
ore
prima
della
fine
della
coltura,
viene
aggiunto
1cc
di
5-
Bromodessosiuridina (BudR), un analogo della Timina, al fine di ottenere
preparati sui quali eseguire le colorazioni differenziali per il bandeggio
cromosomico R. La terza coltura è mantenuta in terreno standard e verrà
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10
utilizzata per l’allestimento di preparati con bandeggio differenziale G.
Nelle ultime 2 ore viene aggiunta a tutte le colture la Colchicina, un
alcaloide che svolge azione antimitotica, compromettendo la stabilità dei
dimeri di tubulina dei microfilamenti del citoscheletro organizzati in fibre
del fuso. Al termine della coltura, le cellule sono centrifugate a 2000 rpm
per 6 minuti, viene aspirato il sopranatante e successivamente viene
aggiunta una soluzione ipotonica (KCl 0,67 M) per indurre la lisi dei globuli
rossi. A questo punto si incuba per 2 minuti in termostato (37 °C), si
centrifuga nuovamente e si aspira il sovranatante fino al pellet. Le cellule
vengono lavate e fissate per due volte con una soluzione fresca di
metanolo/acido acetico (3:1), centrifugate e conservate a +4 °C overnight
per consentire al fissativo di raggiungere tutta la cromatina e per rendere
rigida, e quindi fragile, la membrana cellulare dei linfociti. I preparati
cromosomici vengono quindi allestiti secondo la procedura standard e
colorati. Per la ricostruzione del cariotipo vengono analizzate almeno 30
metafasi con una risoluzione media di almeno 400 bande. L’eventuale
presenza di mosaicismi viene valutata su un numero minimo di 100
metafasi.
Tecniche di colorazione
I preparati sono stati colorati sia con la metodica di colorazione classica
con Giemsa (70cc di acqua di fonte e 2,5cc di Giemsa, per 10 minuti) sia
con le seguenti tecniche di colorazione differenziale:
BANDEGGIO RBG: si utilizzano 140cc di tampone Sorensen a pH 6,7
ottenuto unendo 70cc di soluzione A (500cc di H₂o distillata e 4,54 g di
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11
KH₂PO₄) e 70cc di soluzione B (500cc di H₂o distillata e 5,93 g di
Na₂HPO₄).
A 66,5 cc della soluzione
tampone si aggiungono 3,5cc di
soluzione Hoechst 33258 (5mg/100cc di H₂o distillata). I vetrini
vengono immersi in questa soluzione per 30’ a temperatura
ambiente e al buio. Si effettua il lavaggio dei vetrini in H₂o distillata
e si procede al montaggio con coprioggetto in 2-3 gocce di
tampone Sorensen. La fotolisi della cromatina viene ottenuta
mediante esposizione a raggi UV per 30 minuti o alla luce solare
per 2 ore. Terminata l’esposizione, i preparati sono denaturati per
1’40’’ a 82 °C e colorati con soluzione Giemsa per 6’.
Questo tipo di bandeggio colora selettivamente le regioni di DNA
early-replicating, consentendo inoltre la ricerca del cromosoma X
inattivato.
 BANDEGGIO CBG: i preparati vengono immersi per 10 minuti in
alcool etilico 95%, poi trasferiti in una soluzione satura di idrossido
di Bario Ba(OH)₂ a pH 13,2 per 8 minuti a temperatura ambiente.
Dopo essere stati sciacquati in H₂o distillata, vengono denaturati
per un’ora a 62°C in una soluzione salina SSC 2X e in seguito
colorati per 3’ con soluzione Giemsa al 5%. Questo tipo di
bandeggio
colora
selettivamente
l’eterocromatina
costitutiva
(centromeri, costrizioni secondarie dei cromosomi 1, 9, 16 e regione
eterocromatica del braccio lungo del cromosoma Y).
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2.1.2 Analisi FISH
L’ibridazione in situ con fluorocromi è stata eseguita secondo le indicazioni
date dalle ditte fornitrici. I cromosomi, fissati su vetrino, vengono
denaturati a 73 °C in formammide a pH 7 e diluita in SSC 2X fino ad una
concentrazione finale di 12,6 M. Il tempo di denaturazione è di 2-5 minuti a
seconda del periodo di invecchiamento del preparato. L’ibridazione con
sonde specifiche denaturate a 95 C° per 5’ è protratta per tutta la notte in
camera umida a 37 C°. Al fine di rimuovere sonde di DNA non legate o
legate in modo non specifico, vengono eseguiti, al buio, lavaggi stringenti:
2’ in SSC 0,4 a 73°C e 1’ in SSC 2X a temperatura ambiente. I cromosomi
sono controcolorati con DAPI (concentrazione finale 0,25 ng/ml) e
osservati al microscopio a fluorescenza (Zeiss) con filtri FITC TRIC.
Le sonde molecolari utilizzate sono:
 Sonde per le regioni subtelomeriche del cromosoma 1 (sonda
Chromoprobe Multiprobe T-System Cytocell);
 Sonde per le regioni pseudoautosomiche (PAR1, PAR2) comuni ai
cromosomi X e Y (sonda Chromoprobe Multiprobe T-System
Cytocell);
 Sonda per SRY (Vysis LSI SRY/CEP X);
 Sonda
locus
DNA
specifica
per
la
regione
Xp21.2/p21.3 (sonda cosmidica QUINT Essential);
 Sonda painting per il cromosoma X (sonda COATASOME).
Antonella Di Stefano
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2.1.3 Analisi PCR
La PCR è stata eseguita su DNA estratto da leucociti periferici ottenuti da
campioni di sangue con metodi standard. Sono state utilizzate sequenze
specifiche per le regioni AZFa, AZFb, e AZFc:
 Regione AZFa: primers sY85 e USP9Y
 Regione AZFb: primers sY117 e sY142
 Regione AZFc: primers sY158 e sY254
Sequenze specifiche per SRY, ZFX/ZFY sono state usate come controllo
interno positivo. Estratti di DNA genomico da parte di uomini e donne fertili
sono stati utilizzati per il controllo esterno.
PAZIENTI
Presso il Servizio di Citogenetica del Policlinico Umberto I di Roma
sono stati effettuati accertamenti citogenetici mediante cariotipo su
soggetti che presentavano problemi di infertilità o che dichiaravano la
presenza di anomalie cromosomiche ereditarie in famiglia.
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14
2.1.4 Analisi di alberi genealogici familiari

Traslocazioni bilanciate autosoma/autosoma
I cromosomi coinvolti negli esempi di famiglie riportate sono:
4, 7, 8, 10, 11, 14, 19, 20
Antonella Di Stefano
15
Famiglia 1: t (7;14) (q21;23)
II-6 probando
In questa famiglia è mostrata la trasmissione ereditaria della
traslocazione in 3 generazioni. Nella III generazione (3-9) è
significativa la formazione preferenziale di gameti sbilanciati
evidenziati dai numerosi aborti spontanei presenti in minor numero
anche nella II generazione.
Antonella Di Stefano
16
Famiglia 2: t (7;10) (q11.21;p15)
III-3 probando
Probabile trasmissione ereditaria in 4 generazioni. Traslocazione
bilanciata asintomatica in portatori e rilevata solo in analisi prenatale
nel feto della IV generazione. I punti di rottura presenti in questa
traslocazione e i cromosomi derivativi rendono difficoltoso
l’appaiamento in meiosi, sostenendo l’ipotesi che molti zigoti siano
abortiti precocemente.
Antonella Di Stefano
17
Famiglia 3: t (4;11) (q21;q23)
III-3 probando
Traslocazione che coinvolge il cromosoma 4, relativamente con bassa
densità genica, e il cromosoma 11 contenente loci sottoposti ad
imprinting con loro coinvolgimento nelle prime fasi dello sviluppo
embrionale: questo tipo di traslocazione appare compatibile con la
trasmissione alla progenie solo se sono le donne portatrici. Gli
individui III- 5 e III-6 non si sono sottoposti ad accertamento del
cariotipo, ma è ragionevole supporre che non siano portatori di
traslocazione, non avendo dichiarato alcun problema riproduttivo.
Antonella Di Stefano
18
Famiglia 4: t (11;20) (q23;q13)
III-1 probando
Traslocazione trasmessa in 3 generazioni. Il coinvolgimento dei
cromosomi 11 e 20 determina, come è evidente nella terza
generazione, la formazione di un numero significativamente alto di
gameti sbilanciati prodotti dalla portatrice II-2 e risultanti in numerosi
aborti spontanei. La proporzione attesa di produrre gameti normali e
bilanciati è dimostrata dalla nascita di individuo bilanciato (III-1) e da
soggetto che non presenta la traslocazione (III-5).
Antonella Di Stefano
19
Famiglia 5: t (8;19) (q23;p13)
III-2 probando
La traslocazione coinvolge il cromosoma 8, con relativa bassa densità
genica, e il cromosoma 19, denso di geni attivamente espressi. In
questo caso si ipotizza un evidente effetto epigenetico di questa
traslocazione che sembra non aver creato problemi riproduttivi nella
madre della probanda (II-2), mentre è causa di sterilità nella figlia,
costretta infatti a ricorrere a protocolli di fecondazione medicalmente
assistita.
Antonella Di Stefano
20
 Traslocazioni sbilanciate robertsoniane
Famiglia 6: der (14;21) (q10;q10)
II-2 probando
Esempio di famiglia con traslocazione sbilanciata robertsoniana
14, 21 che interferisce gravemente con gli aspetti epigenetici
della spermatogenesi.
Il soggetto II-2 presenta dispermia.
Antonella Di Stefano
21

Traslocazioni “de novo”
Traslocazioni insorte “de novo” nella gametogenesi di uno dei due
genitori.
Famiglia 7: t (2;3) (p24;p22)
II-3 probando
Traslocazione tra i bracci corti dei cromosomi più grandi e più ricchi in
geni del genoma. Anomalia cromosomica che comporta infertilità nel
maschio per interferenza con gli aspetti epigenetici della
spermatogenesi.
Antonella Di Stefano
22
Famiglia 8: t (5;19) (q10;q10)
II-1 probando
Traslocazione de novo nella probanda con genitori normali. Per
questa traslocazione il rischio di aborti è stimato essere del
50%, in quanto i previsti gameti sbilanciati non sono compatibili
con lo sviluppo fetale. Per III-1 è stata eseguita l’analisi del
cariotipo fetale con diagnosi di cariotipo normale.
Antonella Di Stefano
23
 Traslocazioni cromosoma sessuale/autosoma
Le traslocazioni cromosoma sessuale/autosoma compromettono la
fertilità
in
misura
autosoma/autosoma.
maggiore
Infatti,
tutti
rispetto
i
alle
maschi
traslocazioni
portatori
di
una
traslocazione X/autosoma e l’80% dei maschi con una traslocazione
Y/autosoma presentano azoospermia. Il restante 20% dei maschi
portatori di traslocazioni Y/autosomi ha un numero ridotto di gameti
e una frazione variabile di questi, ha un corredo cromosomico
sbilanciato. Le traslocazioni Y/autosoma sono riarrangiamenti
strutturali con un’incidenza di circa 1/2000 nella popolazione
generale e costituiscono un gruppo eterogeneo in quanto possono
coinvolgere molti degli autosomi e differenti regioni del cromosoma
sessuale.
Antonella Di Stefano
24
TRASLOCAZIONE X/16
Famiglia nella quale il probando è un maschio portatore di una
traslocazione t (X;16) (p21; p12) e con quadro clinico comprendente
ipogonadismo ipogonadotropo, genitali ambigui e ritardo di sviluppo
sessuale. La madre e la sorella del probando sono portatrici della stessa
traslocazione ma il loro fenotipo è normale. Il confronto dei fenotipi del
probando e delle due donne portatrici della stessa traslocazione
suggerisce l’esistenza di una regione cromosomica, localizzata sul
cromosoma X, che è espressa differentemente nei due sessi e che è sotto
controllo epigenetico.
Figura 1: Cariotipo parziale dei cromosomi coinvolti nella traslocazione
con colorazione differenziale RBG; le frecce sugli ideogrammi dei
cromosomi strutturalmente normali indicano i punti di rottura.
Antonella Di Stefano
25
Figura 2: t (X;16) (p21;p12)
III-2 probando
II-3 e III-3 sono portatrici della traslocazione, ma con fenotipo normale.
Non è stato possibile eseguire l’analisi del cariotipo a I-1 e I-2.
Antonella Di Stefano
26
A
B
Antonella Di Stefano
27
C
Analisi mediante FISH su cromosomi metafasici
A-B: ibridazione con sonda cosmidica QUINT Essential
DNA specifica per la regione Xp21.2-p21.3;
C: ibridazione con sonda painting COATASOME per il
cromosoma X;
In
B
e
C
le
frecce
indicano
il
cromosoma
X
strutturalmente normale.
Antonella Di Stefano
28
I risultati ottenuti mediante analisi FISH:

confermano i punti di rottura individuati mediante l’analisi standard del
cariotipo e permettono di escludere la presenza di altri riarrangiamenti
cromosomici oltre alla traslocazione (A, B);

dimostrano che la regione Xp21.2-p21.3 riconosciuta dalla sonda
specifica è interamente traslocata sul braccio corto del cromosoma 16,
indicando che i punti di rottura sono rispettivamente sul cromosoma X
nella regione p21.1-p11.4 e sul cromosoma 16 nella regione p12;

evidenziano nelle metafasi femminili (B) segnali della sonda di
intensità analoga sul cromosoma X strutturalmente normale e su quello
riarrangiato, suggerendo che la quantità di materiale genetico non sia
modificata, e nelle metafasi maschili (A) un unico segnale sul braccio
corto del cromosoma 16 di origine materna;

dimostrano
che
l’intera
regione
Xpterp21.2,
critica
per
il
differenziamento sessuale, e in particolare la regione DSS, non è
coinvolta dai punti di rottura della traslocazione.
Antonella Di Stefano
29
TRASLOCAZIONE Y /1
Il soggetto esaminato presenta infertilità con valori di FSH, LH e
inibina B normali. Le analisi dello sperma indicano una azoospermia
non ostruttiva. Il volume di entrambi i testicoli valutato mediante
ultrasonografia, risulta leggermente ridotto.
Il paziente ha due fratelli, uno riprodottosi, e tre sorelle di cui due
con figli.
I parenti del paziente non hanno effettuato l’analisi del cariotipo.
Antonella Di Stefano
30
Figura 3: t (Y;1) (q11.2;p35)
II-2 probando
Traslocazione de novo che comporta infertilità, insorta nella
gametogenesi paterna
Antonella Di Stefano
31
A
B
Figura 4: Riarrangiamento cromosomico bilanciato: traslocazione
reciproca tra il braccio lungo del cromosoma Y e il braccio corto del
cromosoma 1; [t (Y;1) (q11.2;p35)].
A. Metafase con bandeggio RBG.
B. Metafase con bandeggio CBG specifico per le regioni di etero
cromatina costitutiva.
Nei riquadri a destra sono mostrati il cromosoma 1 strutturalmente
normale e i cromosomi coinvolti nella traslocazione reciproca.
Antonella Di Stefano
32
A
Figura 5: Analisi FISH di metafasi con traslocazione reciproca
bilanciata (Y;1).
Freccia gialla: cromosomi strutturalmente normali.
Frecce bianche: cromosomi der (Y) e der (1).
A. Ibridazione con sonde per le regioni subtelomeriche del cromosoma
1
(segnale
verde
1p;
segnale
rosso
1q).
Il
cromosoma
1
strutturalmente normale, presenta entrambi i segnali. Il segnale verde
sul braccio lungo del cromosoma der (Y), conferma la traslocazione
della regione subtelomerica del braccio corto del cromosoma 1. Il
segnale rosso, come atteso, si presenta sul braccio lungo del
cromosoma der (1).
Antonella Di Stefano
33
B
B. Ibridazione con le sonde per le regioni pseudoautosomiche (PAR1,
PAR2) comuni ai cromosomi X e Y (segnale verde PAR1; segnale
rosso PAR2). Il cromosoma X strutturalmente normale presenta
entrambi i segnali. Der (Y) presenta solamente il segnale verde PAR1.
Der (1) presenta il segnale rosso PAR2 sul braccio corto confermando
l’avvenuta traslocazione dell’intera regione YqPAR.
Antonella Di Stefano
34
Figura 6: Analisi PCR relativa alle regioni AZFa, AZFb e AZFc.
L’elettroforesi dimostra che i profili del DNA delle tre regioni AZF sono
normali, sovrapponibili a quelli dei controlli di popolazione.
Antonella Di Stefano
35
3 RISULTATI
Nei portatori di traslocazioni bilanciate autosoma/autosoma il rischio
teorico di avere una progenie sbilanciata è più del 60%; in pratica, i dati
statistici ottenuti da analisi su ampi campioni di popolazione correggono il
grado di rischio stimandolo in circa il 50%, poiché una percentuale di
embrioni sbilanciati va incontro ad aborto in fasi molto precoci della
gestazione. Infatti, analisi mediante FISH di spermatozoi di portatori di
traslocazione bilanciata, hanno dimostrato che il 50 % dei gameti maschili
hanno corredo cromosomico normale o bilanciato in uguale percentuale, e
che il restante 50 % di gameti sbilanciati si originano per segregazione
adiacente 1.
Nella famiglia 1 [ t (7;14) ] e nella famiglia 2 [ t (7;10) ] è coinvolto in
entrambi i casi il cromosoma 7, ma nel primo caso questo è traslocato con
un acrocentrico e quindi l’appaiamento alla meiosi risulta particolarmente
instabile. Di conseguenza è possibile una trasmissione ereditaria, ma con
significativa presenza di aborti. Differentemente, nella famiglia 2, il
cromosoma 7 è traslocato su un altro cromosoma del gruppo C. La
trasmissione ereditaria è documentata in quattro generazioni con simile
incidenza di aborti e prole normale, probabilmente per una forte selezione
nelle precocissime fasi di sviluppo embrionale.
Nelle famiglie 3 [ t (4;11) ] e 4 [ t (11;20) ] è invece coinvolto il cromosoma
11 in cui sono localizzati geni critici per lo sviluppo embrionale (es.famiglia
β like delle emoglobine) e geni sottoposti ad imprinting (es. protooncogene
tumore di Wilms).
Antonella Di Stefano
36
Nella traslocazione robertsoniana [ t (14;21) ], l’appaiamento prende la
forma di un trivalente molto instabile con esposti i bracci corti degli
acrocentrici; queste regioni NOR, che ospitano i geni per rRNA e
intervengono nella formazione del nucleolo, determinano spesso, anche in
individui con cariotipo normale, disturbi nella spermatogenesi per
interferenza con l’appaiamento XY.
Per
le
traslocazioni
cromosomi
sessuali/autosoma
qui
descritte,
aberrazioni cromosomiche che coinvolgono invece il braccio corto del
cromosoma X sono state descritte in maschi con diverse anomalie quali la
Sindrome di Kallmann, l’ipoplasia congenita delle ghiandole surrenali
associata a ipogonadismo ipogonadotropo, il ritardo mentale associato a
macrorchidismo e la sindrome “sex reversal” associata a duplicazione
della regione DSS.
Poiché sia le due donne fenotipicamente normali che il maschio con gravi
anomalie dello sviluppo sessuale presentano gli stessi alleli attivi sui
cromosomi derivativi della traslocazione, si può ipotizzare che la regione
coinvolta nel punto di rottura del cromosoma X o del cromosoma 16
svolga un ruolo differente nei due sessi presumibilmente sotto l’azione di
fattori epigenetici. Tuttavia dati recenti relativi agli effetti fenotipici di
disomie uniparentali materne a carico del cromosoma 16 indicano che i
geni di questo cromosoma, sottoposti a imprinting, non svolgono un ruolo
specifico nel differenziamento sessuale. Alcuni studi suggeriscono inoltre,
che l’inattivazione del cromosoma X e l’imprinting di geni X-linked siano
Antonella Di Stefano
37
correlati. Pertanto il fenotipo anomalo del probando potrebbe essere
dovuto:
- al silenziamento di geni sottoposti a imprinting la cui espressione è
essenziale in alcune tappe dello sviluppo sessuale maschile;
- alla non corretta riprogrammazione epigenetica durante l’ovogenesi delle
regioni cromosomiche coinvolte nella traslocazione.
Per quanto riguarda invece i portatori di una traslocazione t (Y;1),
basandosi su dati di letteratura, questi risultano sterili quando i punti di
rottura si trovano nella regione Yq11 in cui sono localizzati loci AZF.
Tuttavia, nel caso qui riportato, nessuna delle regioni AZF è stata
interrotta, come dimostrato dall’analisi PCR (Figura 6). Pertanto si può
ipotizzare che l’azoospermia osservata nel probando può essere
conseguente a:
-
difetto nella spermatogenesi dovuto all’anomalo appaiamento
meiotico a carico del cromosoma Y che impedisce la formazione
del
bivalente
XY
e
quindi
la
sua
eterocromatizzazione,
determinando di conseguenza l’arresto della meiosi;
-
mutazione per interruzione della sequenza di geni localizzati nei
punti di rottura sul cromosoma Y o sul cromosoma 1;
-
effetto posizione: la giustapposizione dell’eterocromatina Yq
nella regione subtelomerica 1, ricca di geni attivamente espressi,
può causare la perdita funzionale di alcuni geni critici per la
progressione della meiosi causando un difettoso accoppiamento
e una difettosa ricombinazione meiotica.
Antonella Di Stefano
38
4 CONCLUSIONI
L’infertilità, intesa come incapacità di riprodursi dopo un anno di ripetuti e
validi tentativi, riguarda il 15% delle coppie nei paesi Occidentali. Nel 50%
circa di questi casi il fattore responsabile è di origine maschile (Carrel e
al., 2006).
Anche se la maggior parte dei casi di infertilità maschile è idiopatica, nel
15% dei maschi infertili la causa può essere ricondotta a fattori genetici
quali anomalie cromosomiche e mutazioni geniche.
I pazienti portatori di alcuni tipi di anomalie cromosomiche producono, con
un’alta frequenza, spermatozoi con assetto cromosomico sbilanciato,
risultato diretto di anomalie costituzionali ereditarie o conseguenza di
errori meiotici durante la spermatogenesi. La correlazione tra fattori
genetici e infertilità ha assunto particolare rilevanza soprattutto con
l’introduzione delle tecniche di fecondazione assistita. In particolare la
tecnica ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection), nella quale è assente
qualsiasi forma di selezione naturale dei gameti, permette la riproduzione
anche di individui sterili, portatori di mutazioni geniche o anomalie
cromosomiche. A differenza della FIVET che necessita sia di un numero
ottimale di spermatozoi sia della capacità di completare con successo la
sequenza di eventi che portano alla fecondazione, la ICSI consiste
nell’iniezione diretta di uno spermatozoo nel citoplasma dell’ovocita
(Merchant et al, 2011).
L’iniezione intracitoplasmatica di pronucleo maschile viene eseguita anche
con spermatidi ottenuti da biopsia testicolare in presenza di azoospermia,
Antonella Di Stefano
39
come nel caso di individui con Sindrome di Klinefelter a mosaico. Per
questo protocollo i dati sono però ancora preliminari per valutare eventuali
rischi per l’embrione.
Alcuni casi di infertilità maschile, con arresto parziale o completo della
spermatogenesi, risultano da errori durante la diacinesi nella profase
meiotica, nel corso dell’appaiamento dei cromosomi X e Y e della
formazione della “vescicola sessuale”, che deve garantire la completa
eterocromatizzazione e il silenziamento della coppia XY. Un errore
durante il processo meiotico può essere responsabile per il 9% di infertilità
maschile non ostruttiva. Altri meccanismi responsabili della ridotta
capacità riproduttiva, possono essere ricondotti a mutazioni geniche o
microdelezioni delle regioni AZF. Per ognuna di queste situazioni sono
naturalmente discriminanti le condizioni ambientali cellulari, che possono
influenzare diversamente l’effetto delle anomalie ereditarie, come mostrato
nella famiglia 5, in cui lo stesso tipo di traslocazione mostra diverse
conseguenze sulla fertilità.
La riduzione della fertilità nei portatori di traslocazione è quindi correlata
alla formazione di gameti sbilanciati e, nei maschi, a difetti della
spermatogenesi. Infatti, nelle traslocazioni robertsoniane e in quelle
reciproche, durante la profase I si verifica l’appaiamento tra i cromosomi
riarrangiati e i loro omologhi, formando una configurazione denominata
rispettivamente trivalente e quadrivalente. Le possibili segregazioni dei
cromosomi coinvolti possono generare gameti bilanciati o sbilanciati (J
Shamash et al., 2011). Studi meiotici hanno dimostrato che il difetto nella
Antonella Di Stefano
40
spermatogenesi, nei portatori de traslocazioni robertsoniane, è correlato
con un’aumentata frequenza di associazioni tra configurazione trivalente e
il bivalente X-Y durante lo stadio di pachitene. Inoltre, nei portatori di
traslocazioni reciproche, se i segmenti traslocati hanno una dimensione
ridotta, si può verificare mancanza di sinapsi tra regioni omologhe e
conseguente contatto di queste regioni con il bivalente X-Y (vescicola
sessuale). L’instaurarsi di contatti tra regioni cromosomiche e bivalente XY durante la meiosi maschile, costituisce un evento che disturba le
successive
fasi
della
meiosi
e
determina
quindi
arresto
della
spermatogenesi.
I primi studi di modalità di trasmissione delle traslocazioni sono stati
condotti sul materiale proveniente dagli aborti spontanei. L’analisi degli
spermatozoi provenienti dalle biopsie testicolari ha consentito, mediante
l’uso della ibridazione in situ (FISH), di ottenere significativi dati sul
comportamento e le modalità delle anomalie cromosomiche nel critico
processo di appaiamento e segregazione dei cromosomi omologhi
durante la meiosi. Questo studio non può essere eseguito sulla donna a
causa della mancanza di accesso diretto ai gameti femminili.
Con lo sviluppo della PGD (Diagnosi Genetica Preimpianto) è stato
possibile analizzare nuovi dati relativi alle situazioni di trasmissione sia
femminile che maschile sui portatori di traslocazioni bilanciate. Questa
tecnica ha contribuito a portare nuove informazioni sul comportamento
meiotico dei cromosomi e su come questi si ridistribuiscono durante il
processo, al fine di capire in particolare come si altera il meccanismo della
Antonella Di Stefano
41
meiosi nei portatori di traslocazione bilanciata. La PDG è una procedura
complementare alle tecniche di diagnosi prenatale, che permette di
identificare
la
presenza
di
malattie
genetiche
o
di
alterazioni
cromosomiche in embrioni in fasi molto precoci di sviluppo, generati in
vitro da coppie a elevato rischio riproduttivo, prima del loro impianto in
utero. La PDG associata all’ibridazione in situ fluorescente (FISH) offre
l’opportunità di individuare e selezionare gli embrioni da trasferire.
Nonostante i notevoli vantaggi forniti dalla FISH-PDG, ci sono ancora limiti
tecnici che comportano il rischio di avviare gravidanze di embrioni
sbilanciati o portatori della stessa incapacità riproduttiva parentale
(Shamash et al., 2011).
La casistica raccolta da Belén Lledó e dai suoi collaboratori dell’Istituto
Bernabeu in Spagna, dove la diagnosi preimpianto è permessa, ha
consentito di aumentare i dati a disposizione per comprendere il
comportamento delle anomalie cromosomiche durante la meiosi. Su un
totale di 260 ovociti trattati con la ICSI, se ne sono fecondati 183 (70,38%)
e la biopsia su una singola cellula embrionaria (blastomero) è stata
eseguita su 127 embrioni. Di questi solo 37 (31,4% del totale degli
embrioni analizzati) sono stati identificati come embrioni normali o
bilanciati.
I ricercatori hanno riscontrato un'incidenza complessiva di embrioni
sbilanciati del 68,6%, ma non hanno osservato una differenza se ad
essere portatori di traslocazione bilanciata siano le donne o gli uomini.
Antonella Di Stefano
42
In considerazione dell’alta frequenza di anomalie cromosomiche e
genetiche nelle coppie con poliabortività e dell’incalzante richiesta di
ricorrere a fecondazioni medicalmente assistite è opportuno e necessario
verificare, in via preliminare, l’accertamento del cariotipo dei pazienti e
successivamente del cariotipo fetale o del tessuto abortivo.
Antonella Di Stefano
43
BIBLIOGRAFIA
1. Antonelli A., Marcucci L., Elli R., Tanzi N., Paoli D., Radicioni A.,
Lombardo F., Lenzi A., Gandini L., 2010, ” Semen quality in men with Y
chromosome aberrations”, international journal of andrology ISSN 01056263
2. Braun-Falco M, Schemmp W, Nevinny-Stickel-Hinzpeter C & Ko¨hn
FM. (2007) Azoospermia due to a unique de novo balanced reciprocal
translocation (Y;1) (q12;q25). J Androl 28, 647–651
3. Carrel DT, De Jonge C, Lamb DJ, 2006, The genetic of male infertility: a
field of study whose time is now, Arch Androl 52:269-274
4. C.P. Chen, P C Wu, C J Lin, S R Chern, F J Tsai, C C Lee, D D Town,
W L Chen, L F Chen, M S Lee, C W Pan, W Wang, (2010), Unbalanced
reciprocal translocations at amniocentesi, Taiwanese Journal of Obstetrics
& Gynecology 50, 48-57
5. F.Sun, M.Oliver-Bonet, P.J. Turek, E.Ko and R.H. Martin, (2005),
Meiotic studies in an azoospermic human translocation (Y;1) carrier,
Molecular Human Reproduction Vol.11, No.5 pp. 361–364
Antonella Di Stefano
44
6. Gasser S., Raulet D., 2006, The DNA damage response, immunity and
cancer. Seminars in Cancer Biology, Natural killer cells in cancer, 16, 344347
7. G Ogur, E V Assche, W Vegetti, G Verheyen, H Tournaye, M Bonduelle,
A Van Steirteghem, I Liebaers, 2006, Chromosomal segregation in
spermatozoa of 14 Robertsonian translocation carriers, Molecular Human
Reproduction Vol.12, No.3 pp. 209–215
8. J Shamash,S Rienstein, H Wolf-Reznik, El Pras, M Dekel, T
Litmanovitch, M Brengauz, B Goldman, H Yonath, J Dor, J Levron, A
Aviram-Goldring, (2011), Preimplantation genetic haplotyping a new
application for diagnosis of translocation carrier’s embryos- preliminary
observations of two robertsonian translocation carrier families, J Assist
Reprod Genet 28:77–83
9. Marcucci Liana, Petrinelli P., Antonelli A., Proietti M., Elli R. 2001,
“Xp21.1-11.4 chromosome region could be involved in male sexual
development” Wurzburg, 14th International Chromosome Conference
10. Mary Ann Handel and John C. Schimenti, “Genetics of mammalian
meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility” . Nature reviews,
volume 11 (124-136) 2010
Antonella Di Stefano
45
11. Mridula Nambiar and Sathees C. Raghavan, (2011), How does DNA
break during chromosomal translocations?, Nucleic Acids Research, Vol.
39, No. 14 5813–5825
12. M.V. Traversa, L. Carey and D. Leigh, (2010), A molecular strategy for
routine preimplantation
genetic diagnosis in
both
reciprocal and
Robertsonian translocation carriers, Molecular Human Reproduction,
Vol.16, No.5 pp. 329– 337
13. Nicole M. Baker, Rakhi Rajan and Alfonso Mondrago, 2009, Structural
studies of type I topoisomerasi, Nucleic Acids Research, Vol. 37, No. 3
693–701
14.
R
Merchant, G
Gandhi
and
G
N
Allahbadia,
2011,
In
vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection for male infertility, Indian
J Urol. 2011 Jan-Mar; 27(1): 121–132
15. S A Berend, S L Page, W Atkinson, C McCaskill, N E Lamb, S L
Sherman, L G Shaffer, 2003, Obligate Short-Arm Exchange in De Novo
Robertsonian
Translocation
Formation
Influences
Placement
of
Crossovers in Chromosome 21Nondisjunction, Am. J. Hum. Genet.
72:488–495
Antonella Di Stefano
46
16. S Pappalardo, 2010, “Padri con traslocazioni cromosomiche e rischio
per i figli” ; Andrologia # 87, vitachenasce.org
17. V Tassistro, R Ghalamoun-Slaimi, J Saias-Magnan, M R Guichaoua,
(2009), Chronology of meiosis & synaptonemal complex abnormalities in
normal & abnormal spermatogenesis, Indian J Med Res 129, pp 268-278
18. Zheng X, Oancea C, Henschler R, Moore MAS, Ruthardt M (2009)
Reciprocal t(9;22) ABL/BCR Fusion Proteins: Leukemogenic Potential and
Effects on B,Cell Commitment. Plos one 4(10): e7661
LIBRI CONSULTATI:
1. R L Naussbaum, R R McInnes, H F Willard, 2007, Genetics in Medicine,
New York, Saunders
2. Valerio Ventruto, Gianfranco Sacco, Fortunato Lonardo, 2001, TestoAtlante di Citogenetica Umana – Guida al riconoscimento e alla
interpretazione delle anomalie cromosomiche in età prenatale e
postnatale, Milano, Springer Verlag
3. Ricki Lewis, 2011, Genetica Umana. Concetti ed applicazioni, Roma,
Piccin
Antonella Di Stefano
47