Diagnosi di infezione da virus
Dengue:
il ruolo del laboratorio
Licia Bordi
Laboratorio Virologia
Famiglia: Flaviviridae
Genere: Flavivirus
FLAVIVIRUS
Dengue
West Nile
Encefalite Giapponese
Febbre Gialla
Zika
Usutu
Foresta di Kyasanur
Alkhurma
Omsk
Encefalite trasmessa
da zecca (TBE)
Dengue Virus
(DENV)
4 sierotipi antigenicamente differenti
Denv-1 Denv-2 Denv-3 Denv-4
Genoma: ssRNA(+)
Ciclo di trasmissione
DENV è trasmesso
all’uomo attraverso la
puntura di una zanzara
infetta. Una volta che
l'insetto viene infettato
da uno dei virus della
dengue, lo rimane per
tutta la vita ed è in grado
di trasmetterlo dopo 810 giorni d' incubazione.
1
2
DENV è iniettato in
circolo durante il pasto di
sangue, con spillover
nell’epidermide e nel
derma (infezione cellule
dendritiche e
cheratinociti). Le cellule
infette migrano nei
linfonodi e l’infezione è
diffusa attraverso il
sistema linfatico
4
33
http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/08051999/00004/dengue_phf/sld006.htm
Sindromi Cliniche da Dengue :
Classificazione WHO - 2009
Ampio spettro di manifestazioni cliniche
Il periodo di incubazione è di 2-7 giorni.
Febbre Dengue
Dengue severa
Infezione
secondaria da
sierotipo differente
•
•
•
•
•
febbre
mal di testa
dolori muscolari e articolari
rash cutaneo
dolore retro-orbitale
• Sanguinamenti locali di varia
entità; petecchie
•Sindrome emorragica
• Grave compromissione degli
organi
•Sindrome da Shock
Negli ultimi 50 anni, l’incidenza è
aumentata di circa 30 volte
Casi di Dengue riscontrati all’INMI “L. Spallanzani” nel
2009-2012 in viaggiatori provenienti da zone endemiche
1
2
1
1
1
11
1
3
1
1 3
7
1
Dei 30 casi con PCR positiva, 10 erano Den-1(
Den-4 ( ), 5 non caratterizzati
), 6 Den-2 (
), 6 Den-3 (
Dengue in Promed, ultimi 6 mesi del 2014: 1678 allerte
), 3
Diagnosi di infezione da DENV
Metodi diretti
Ricerca di RNA virale
Ricerca di antigeni virali
Isolamento virale
Metodi indiretti
ELISA
Immunofluorescenza indiretta
(IFA)
Test di microneutralizzazione
METODI DIRETTI 1: Isolamento Virale (BSL3)
C6/36 e AP61 (cellule di zanzara):
Sono le linee cellulari più permissive per la crescita del virus; non si osserva
però Effetto Citopatico (CPE) per cui la presenza di virus viene evidenziata mediante RTPCR sul terreno di coltura prelevato 6gg dopo l’infezione oppure
mediante anticorpi monoclonali sierotipo-specifici)
Vero E6 e LLCLLC-MK2(cellule di rene di scimmia):
meno permissive; ma una volta isolato
il virus, si osserva un chiaro CPE
Inoculo intracranico nel topo neonato
Su quali campioni biologici?
•Sangue intero
•Siero o plasma
•urine
•Tessuti (fegato, milza e altri tessuti)
Vero E6 Mock
Vero E6 CPE
METODI DIRETTI 2: Rilevazione dell’antigene
Saggi basati sulla rilevazione NS1:
glicoproteina altamente conservata
prodotta sia in forma associata alla
membrana che in forma solubile
fortemente immunogenica; stimola
anticorpi con attività fissante il
complemento
presente in elevate concentrazioni
nel siero di pazienti infetti in fase
acuta molto precocemente (1-9gg
dopo comparsa sintomi)
Saggi ELISA
Test rapidi immunocromatografici
Su quali campioni biologici?
Pos
Neg
Siero o plasma
Sangue intero
Comparazione di tre saggi commerciali per la cattura dell’antigene NS1
Pannello di 450 sieri di cui 220 positivi al Dengue e 230 negativi
pan-E rileva con > efficienza Den-2; Platelia il Den-1; STRIP ha la stessa efficienza di rilevazione per
Den-1 e-2 ; tutti e tre i test rilevano con < efficienza Den-3
Si osserva per alcuni kit cross-reattività con altri virus (vedi tabella)
PLoS Negl Trop Dis. 2010 Jul 6;4(7):e738
Comparazione di tre saggi commerciali per la cattura dell’antigene NS1
Sieri positivi all’isolamento virale sono rilevati meglio da tutti e tre i test rispetto ai positivi in PCR
STRIP ha una maggiore efficienza nel rilevare sia infezioni primarie che secondarie; Platelia rileva
meglio infezioni primarie rispetto alle secondarie; pan-E ha la minore efficienza di rilevazione per
entrambi le infezioni
L’utilizzo di kit basati sulla rilevazione dell’antigene NS1 in combinazione con IgM MAC-ELISA
potrebbe essere ottimale
PLoS Negl Trop Dis. 2010 Jul 6;4(7):e738
METODI DIRETTI 3: Rilevazione dell’antigene o dell’RNA
Immunoistochimica:
Gli antigeni possono essere visualizzati in sezioni di
tessuto usando anticorpi monoclonali marcati
•Fegato: depositi granulari cell di Kupffer e endotelio
(Fig 1A)
•Macrofagi alveolari (Fig 1B)
•Polmoni: lume vascolare monociti ed endotelio (Fig 1C)
•Milza: citoplasma di macrofagi e cellule binucleate (Fig.
1E)
• Polpa bianca, tessuti linfoidi,simil-immunoblasti e similcentroblasti (Fig.1G)
• Linfociti periferici(Fig. 1 I)
Ibridazione in situ:
l’RNA virale può essere visualizzato in sezioni di
tessuto usando riboprobes antisenso marcati
• Polpa rossa splenica: citoplasma dei macrofagi (Fig.1D)
e cellule binucleate (Fig.1F)
•Polpa bianca simil- centroblasti e simil-immunoblasti e
(Fig.1 H)
• Linfociti periferici e linfociti (Fig. 1 J)
Su quali campioni biologici?
Sezioni di tessuto (autopsia o biopsia)
congelate o in paraffina
JID 2004:189 (15 April) • 1411
METODI DIRETTI 4: Rilevazione dell’RNA mediante PCR
Real-Time PCR (3’ UTR)
Journal of Clinical Virology 45 (2009) 61-66 Modificata
RT-PCR one step o nested di famiglia (NS5) e sequenziamento
I Round
II Round
Vector Borne Zoonotic Dis. 2007 ;7(4):467-77 Modificata
METODI DIRETTI 4: Rilevazione dell’RNA mediante PCR
Su quali campioni biologici?
Siero: la carica virale è molto alta nei primi giorni
sintomatologia e si riscontra fino a 5-7 giorni
dopo l’inizio della
METODI DIRETTI 4: Rilevazione dell’RNA mediante PCR
Su quali campioni biologici?
Siero: la carica virale è molto alta nei primi giorni
dopo l’inizio della
sintomatologia e si riscontra fino a 5-7 giorni
Urine: La carica virale è più bassa rispetto al siero ma il virus permane fino a
circa 14 giorni
Saliva: La carica virale è più bassa rispetto al siero ma il virus è stato
riscontrato anche dopo 8 giorni dalla comparsa dei sintomi
N:B: Urine e saliva possono essere utili nei casi in cui non si riscontra più il
virus nel sangue e anche laddove fosse difficile prelevare il sangue (es
bambini con sindrome emorragica)
METODI INDIRETTI: saggi sierologici
La risposta immunitaria all’infezione da Dengue consiste nella produzione di
Immunoglobuline (IgM, IgG, IgA) specifiche, principalmente dirette verso la proteina E
Poiché la proteina E contiene determinanti antigenici comuni a tutti i flavivirus, si osserva
una marcata cross-reattività tra i membri della famiglia flavivirus
Durante una infezione primaria la risposta IgM è generalmente ad alti titoli
e più specifica rispetto alla secondaria
La risposta delle IgG è a titoli più alti in una infezione secondaria rispetto alla primaria
E’ difficile, se non impossibile, usare la sierologia per identificare il sierotipo in seguito
ad infezione primaria recente, poiché gli anticorpi prodotti sono cross-reattivi con gli
altri sierotipi
Gli anticorpi che si formano in seguito ad infezione secondaria non solo sono crossreattivi tre i differenti sierotipi, ma sono fortemente cross-reattivi anche con altri
flavivirus
METODI INDIRETTI 1: saggi basati sulla rilevazione di IgM
La maggior parte dei saggi per la rilevazione delle IgM utilizza antigeni ricombinanti
verso la proteina E dei 4 sierotipi
•Saggi ELISA per le IgM:
I micro-pozzetti sono rivestiti da antigeni del virus. I campioni di siero,
pretrattati con sostanza in grado di catturare le IgG, vengono incubati nei
pozzetti e tutte le IgM presenti nel campione vanno a legarsi nei pozzetti con
l’antigene. Dopo lavaggio per rimuovere i legami aspecifici, un coniugato anti
IgM viene dispensato e consente poi la rilevazione delle IgM
• Saggi ELISA a cattura per le IgM:
I micro-pozzetti sono rivestiti da anticorpi anti-IgM umane. Una volta diluiti, i
campioni di siero e i controlli vengono incubati nei pozzetti e tutte le IgM
presenti nel campione vanno a legarsi nei pozzetti agli anticorpi anti-umano
(specifici per IgM). I reattivi aspecifici vengono allontanati mediante lavaggi.
Gli antigeni del virus della dengue vengono poi aggiunti nei pozzetti e incubati,
così che, se nel campione sono presenti IgM anti-DVF, gli antigeni di DVF
andranno a legarsi a tali anticorpi specifici nei relativi pozzetti
• Test rapidi per IgM che sfruttano l’immunocromatografia o le
particelle agglutinanti (antigeni ricombinanti)
350 sieri testati da 9 laboratori
Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 15, No. 3, March 2009
Sensibilità e specificità per i test ELISA
Sensibilità e specificità per i test rapidi
Le metodiche ELISA sembrano avere un miglior compromesso sensibilità/specificità rispetto ai test rapidi, che risultano
molto variabili in termini di sensibilità
Si sono riscontrati falsi positivi dovuti ad infezione con Malaria, infezione pregressa da Dengue,positività per fattore
reumatoide
Da tener presente che, poiché le IgM possono persistere anche per > 60 giorni, i saggi per le IgM non dovrebbero essere
utilizzati come test di conferma in paesi dove la Dengue è endemica
I test per IgM devono essere supportati da altre evidenze diagnostchei, in aggiunta alla clinica e alle informazioni
epidemiologiche; è fonfdamentale dimostrare una sieroconversione utilizzando una coppia di sieri
METODI INDIRETTI 2: saggi basati sulla rilevazione di IgG
Dengue IgG ELISA indiretta
Ratio
Result
< 0.8
Negative
0.8 < Ratio < 1.1
borderline
≥ 1.1
positive
Dengue IgG ELISA a cattura
165 sieri:
140: campioni di donatori sani di Zanzibar
9: Campioni da 7 pazienti con diagnosi di Dengue effettuata all’INMI
1: Campione da paziente negativo
2: Pazienti con AHFV o WNV
13: pazienti con IgM/IgG perEBV/ CMV/ B19/ Rosolia/ Morbillo/ HAV
Gold standard: IFA
Test
N. positives
(prevalence)
Sensitivity Specificity
VVP
VPN
IFA in house
75/165 (45.5%)
100%
100%
100%
100%
Euroimmun DENV
IgG indirect ELISA
98/165 (59.4%)
96%
71.1%
73.5%
95.5%
Panbio DENV IgG
indirect ELISA
109/165 (66.1%)
98.7%
61.1%
67.9%
98.2%
Panbio DENV IgG
capture ELISA
4/165(2.4%)
5.3%
100%
100%
55.9%
Gold standard:IFA
Test
N. positives
Sensitivity
IFA in house
7
100%
Euroimmun DENV
IgG indirect ELISA
5
71.4%
Panbio DENV IgG
indirect ELISA
6
85.7%
Panbio DENV IgG
capture ELISA
1
14.3%
Sieri di 7 pazienti con
diagnosi di Dengue
confermata mediante PCR
e IFA IgM e IgG
analizzati con i tre metodi
ELISA
Pazienti con altre infezioni da Flavivirus
IFA
DIAGNOSIS
AHFV
WNV
TBE
JEV
YFV vaccine
POS
POS
equivocal
equivocal
equivocal
Euroimmune DENV
IgG indirect ELISA
POS
POS
borderline
POS
NEG
TEST
Panbio DENV IgG
indirect ELISA
POS
POS
POS
POS
equivocal
Panbio DENV IgG
capture ELISA
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
Metodi indiretti 3:
Test di Microneutralizzazione (BSL3)
Diluizioni
Seriali dei sieri
Piastra di Vero E6
1.5x104
cell/pozz
sieri
1/2 ora
37°C
aggiunta Virus
100 TCID50/pozz
3-4 giorni
37°C
Titolazione
CPE
Non consente di discriminare tra differenti sierotipi di dengue
Consente di fare diagnosi differenziale con altri flavivirus
•Campione Negativo : non compaiono altre
bande oltre a quella di controllo (C).
•Campione Positivo per le IgM Dengue:
appare una banda violacea nella porzione
posta subito sotto la banda di controllo
(M)
Campione Positivo per le IgG Dengue:
appare una banda violacea nella porzione
posta più distalmente rispetto alla banda
di controllo (G)
Campione Positivo per le IgG e le IgM
Dengue: appaiono 2 bande violacee in
corrispondenza delle posizioni (G) ed (M)
N.B.
Il risultato positivo non esclude la presenza di altri virus, né identifica il sierotipo
specifico.
In caso di negatività non si può escludere che la concentrazione degli antigeni del virus nel
campione sia inferiore al limite di rilevazione del test.
METODI INDIRETTI 4: (BSL3)
Immunofluorescenza con vetrini home-made
Allestimento di vetrini per IFA mediante infezione
di colture cellulari di C6/36 e di Vero E6
Risultati:
Vetrini C6/36: poco idonei a causa di un’alta
fluorescenza di fondo, dovuta verosimilmente alla
presenza nei sieri umani di anticorpi diretti contro le
cellule di insetto
controllo Negativo
Vetrini Vero E6: non presentano fluorescenza di
fondo, consentendo una più nitida lettura dei risultati
Campione Positivo
METODI INDIRETTI 5:
Immunofluorescenza con vetrini commerciali per flavivirus
L’utilizzo
di vetrini a mosaico in grado di vedere i 4 sierotipi di Dengue e altri
L
Flavivirus
(TBE,YF,WN,JE) ha un valore aggiunto:
’
In alcuni casi mette in luce la presenza di anticorpi specifici per altri flavivirus in
assenza di anticorpi per dengue (es: YF)
In altri casi la forte creoss-reattività delle IgG per tutti i flavivirus in presenza
di IgM cross-reattive può essere un campanello di allarme…
A recent experience at INMI
Symptoms: 2 days later, during the flight to Italy, he developed high fever,
shaking chills, anorexia, malaise, nausea and vomiting, Over the following 5
days the symptoms worsened and he was admitted to hospital (May 10)
Travel history and retrospective reconstruction of possible exposure:
Frequent traveler; (vaccinated against yellow fever in 1998). April 29 he
visited the camel market of Shalatin; tick bite on a foot, followed by a small
papular lesion and (48 hours after the bite) blurred vision
Laboratory results:
leukopenia (white blood cells: 2250/mmc),
thrombocytopenia (platelets: 67000/mmc);
increased liver enzymes (AST 469, ALT 406 U/L) d
Aetiology: not defined
Discharged 11 days after hospitalization, in good general condition despite
persistence of asthenia
Samples were referred to the Virology Lab at INMI with request for
Dengue and WNV serology for retrospective diagnosis
Collection date
May 10th
Sample type WNV
Serum
(Day 10 post
exposure)
May 27th
Serum
Dengue
Serology
Serology
IgG: ≥1:640
IgG: ≥ 1:640
IgM: ≥ 1:20
IgM: ≥ 1:20
IgG: ≥ 1:640
IgG: ≥ 1:640
IgM: ≥ 1:20
IgM: ≥ 1:20
Sequence analysis of NS5
Mosquito-borne
Flaviviruses
Tick-borne
Flaviviruses
Diagnosi sierologica infezione primaria
ELISA / IFA
IgM: 5 giorni dalla comparsa dei sintomi (80% casi)
IgG: 7 giorni dopo la comparsa dei sintomi
RT-PCR / real-time RT-PCR
• RNA virale nel siero fino a 5-7 giorni dalla
comparsa dei sintomi
• RNA virale nellle urine e nella saliva fino a 14
giorni dalla comparsa dei sintomi
• Identificazione del sierotipo
Ricerca Antigene NS1
1 – 9/10 giorni dalla comparsa dei sintomi
Diagnosi sierologica infezione secondaria
ELISA / IFA
IgM hanno titoli più bassi e durano meno.
IgG presenti durante la fase viremica ed aumentano
velocemente
Handbook for Clinical Management of Dengue
Who’s next?