SSMT Locarno 2012/2013 Lavoro di diploma per il corso di Tecnici in Analisi Biomediche Presso l’Istituto Cantonale di Patologia di Locarno Messa a punto dell’analisi della traslocazione RET/PTC Lavoro di Diploma di AMBRA CATTANI Responsabili Dott.ssa Francesca Molinari Dott. Milo Frattini 1
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Sommario 1. Abstract ......................................................................................................................................................... 4 2. Abbreviazioni ................................................................................................................................................. 7 3. Introduzione .................................................................................................................................................. 8 3.1 I tumori tiroidei ........................................................................................................................................ 8 3.2 Alterazioni molecolari del carcinoma tiroideo ........................................................................................ 9 3.3 Alterazioni molecolari del carcinoma papillare ..................................................................................... 10 3.3.1 La mutazione del gene BRAF .......................................................................................................... 10 3.3.2 La traslocazione RET/PTC ............................................................................................................... 11 4. Scopo del lavoro .......................................................................................................................................... 15 5. Pazienti, materiali e metodi......................................................................................................................... 16 5.1 Pazienti .................................................................................................................................................. 16 5.2 Materiali e metodi ................................................................................................................................. 16 5.2.1 Estrazione degli acidi nucleici ......................................................................................................... 16 5.2.2 Quantificazione degli acidi nucleici estratti dai tessuti .................................................................. 17 5.2.3 Amplificazione del DNA genomico tramite PCR ............................................................................. 17 5.2.4 Analisi dello stato mutazionale del gene BRAF .............................................................................. 18 5.2.5 Elettroforesi su gel di agarosio ....................................................................................................... 19 5.2.6 Purificazione del DNA amplificato .................................................................................................. 19 5.2.7 PCR di sequenza (cyclesequencing) ................................................................................................ 20 5.2.8 Purificazione del DNA dopo PCR di sequenza ................................................................................ 20 5.2.9 Il sequenziamento .......................................................................................................................... 20 5.2.10 Retrotrascrizione dell’RNA a cDNA ............................................................................................... 21 5.2.11 Messa a punto dell’analisi delle traslocazioni RET/PTC tramite metodica di RT‐PCR .................. 23 5.2.12 Scelta dei primers e PCR a gradiente di temperatura .................................................................. 23 5.2.13 Validazione della metodica di analisi di traslocazione RET/PTC ................................................... 26 5.2.14 Amplificazione dei geni di controllo PGK1 e PAX8 ....................................................................... 27 5.2.15 Analisi dei prodotti di amplificazione tramite elettroforesi capillare .......................................... 28 6. Risultati ........................................................................................................................................................ 31 6.1 Messa a punto delle reazioni di PCR per l’analisi delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3 ................ 31 6.2 Validazione della metodica per l’analisi dei frammenti delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3, tramite RT‐PCR ed analisi dei frammenti .................................................................................................... 36 6.3 Analisi dello stato mutazionale del gene BRAF ..................................................................................... 39 2
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 7. Discussione .................................................................................................................................................. 42 8. Conclusione ................................................................................................................................................. 45 9. Bibliografia ................................................................................................................................................... 46 10. Ringraziamenti ........................................................................................................................................... 48 11. Allegati ....................................................................................................................................................... 49 11.1 Estrazione di DNA genomico da tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina (FFPE) ................. 49 11.2 Estrazione RNA da tessuto FFPE .......................................................................................................... 50 11.3 Quantificazione degli acidi nucleici ..................................................................................................... 51 11.4 Costituzione della miscela di reazione per la PCR ............................................................................... 52 11.5 Elettroforesi su gel di agarosio ............................................................................................................ 53 11.6 Purificazione del DNA amplificato ....................................................................................................... 54 11.7 PCR di sequenza (cyclesequencing) ..................................................................................................... 54 11.8 Purificazione del DNA dopo PCR di sequenza ..................................................................................... 55 3
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 1. Abstract Introduzione analisi dei frammenti nel Laboratorio di Patologia Molecolare dell’Istituto Cantonale I tumori tiroidei rappresentano il principale di Patologia di Locarno. tipo di tumore endocrino, con una prevalenza dei tumori papillari (circa l’80%). Il metodo di indagine diagnostica preoperatorio più diffuso e accurato per la valutazione della natura benigna o maligna dei noduli tiroidei è l’esame citologico su aspirazione bioptica con ago sottile. Tuttavia, nel 15‐20% circa delle analisi citologiche non è possibile giungere a diagnosi certa. In questi casi le analisi delle alterazioni di marcatori molecolari specifici del carcinoma tiroideo possono essere d’aiuto nel discriminare i campioni patologici e aiutare nelle scelte terapeutiche. Nei carcinomi papillari tiroidei le alterazioni più frequenti e specifiche di tale tumore sono rappresentate da mutazioni puntiformi del gene BRAF e dalle traslocazioni RET/PTC, ovvero riarrangiamenti del gene RET con geni eterologhi espressi ubiquitariamente. Le due forme più frequenti di riarrangiamento sono RET/PTC1 e RET/PTC3, determinate dalla fusione del gene RET con i geni CCDC6 e NCOA4 rispettivamente. Scopo del lavoro Materiali e metodi Per la messa a punto del protocollo delle analisi RET/PTC sono stati usati due costrutti plasmidici contenenti le traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3. I protocolli di PCR, specifici per individuare le traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3, sono stati messi a punto tramite PCR a gradiente di temperatura e validati su 17 campioni di RNA estratto da tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina di pazienti affetti da tumore papillare tiroideo. I campioni di RNA analizzati sono stati estratti tramite un kit commerciale e retrotrascritti a cDNA tramite protocolli già in uso presso l’ICP. I cDNA ottenuti sono stati analizzati tramite PCR seguendo il protocollo messo a punto sui costrutti plasmidici e gli amplificati ottenuti sono stati analizzati al sequenziatore. Inoltre, per ottenere un quadro molecolare più completo, è stata valutata la mutazione dell’esone 15 del gene BRAF tramite PCR e sequenziamento diretto, partendo da DNA genomico dei pazienti analizzati, seguendo i Lo scopo di questo lavoro di diploma è quello protocolli già in uso presso l’ICP. di ottimizzare un protocollo di analisi delle traslocazioni RET/PTC tramite RT‐PCR ed 4
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno Risultati e conclusione specific molecular markers of thyroid I risultati ottenuti dalle PCR a gradiente di temperatura e dalla successiva analisi dei frammenti effettuati su costrutti plasmidici, si sono rilevati ottimi a tutte le temperature provate, e pertanto è stata stabilita come temperatura di ibridazione la temperatura media del gradiente pari a 57°C. Due campioni di tessuto tumorale su 17 (11,8%), a fronte di nessuno dei tessuti sani, sono risultati positivi per le traslocazioni RET/PTC, risultato concordante con la letteratura. L’analisi del gene BRAF ha identificato una mutazione in 10 campioni su 17 (58,8%), una percentuale alta, ma comunque concordante con diversi testi presenti in letteratura. In conclusione si può dire che le metodiche messe a punto sono state validate con successo e possono essere introdotte in diagnosi. Thyroid tumors are the main type of endocrine tumor, with a prevalence of papillary tumors (about 80%). The most and carcinoma may be helpful in discriminating the pathological samples and help with therapeutic choices. In papillary thyroid carcinomas, the most frequent and specific alterations of this tumor are represented by point mutations of the BRAF gene and RET/PTC translocations, or rearrangements of the RET gene with heterologous genes ubiquitously expressed. The two most frequent forms of rearrangement are RET/PTC1 and RET/PTC3 and determined by a fusion of the RET gene with the genes NCOA4 and CCDC6 respectively. The aim of this study The aim of this diploma work is to optimize a protocol analysis of RET/PTC translocations using RT‐PCR and fragments analysis in the Molecular Pathology Laboratory of Locarno. Materials and methods Background popular 2012/2013 accurate method of preoperative diagnostic evaluation of benign or malignant thyroid nodules is the cytologic examination of fine needle aspiration biopsy. However, in 15‐20% of cytological analysis it is not possible to arrive at a diagnosis. In these cases the analysis of alterations of For the elaboration of the Protocol of the RET/PTC analysis, two plasmid constructs containing translocations RET/PTC1 and RET/PTC3 were used. PCR Protocols, specific to identifying translocations RET/PTC1 and RET/PTC3, were developed by means of temperature gradient PCR and tested on 17 RNA samples retrieved from formalin‐fixed paraffin‐embedded tissue of patients’ thyroid papillary cancer. The RNA samples analyzed 5
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 were extracted using a commercial kit and were found excellent at all temperatures retrotranscripted to cDNA using protocols tested, and thus the average temperature already in use at the ICP. The cDNA obtained gradient of 57°C was established as were analyzed by PCR using the Protocol hybridization temperature. Two samples of developed on plasmid constructs and the tumor tissue in 17 (11.8%), compared with amplified samples obtained were analyzed on none of the healthy tissues, were positive for the sequencer. In addition, to obtain a more translocations RET/PTC, results consistent complete molecular framework, genomic with the literature. The BRAF gene analysis DNA of the analyzed patients, was evaluated has identified a mutation in 10 samples out for the mutation of the Exon 15 of the BRAF of 17 (58.8%), a high percentage, but still gene by PCR and direct sequencing, following consistent with several texts presented in the protocols already in use at the ICP. literature. In conclusion we can say that the Results and conclusion methods developed were validated successfully and can be introduced in The results obtained from temperature gradient PCR and subsequent analysis of the fragments performed on plasmid constructs, diagnosis. . 6
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 2. Abbreviazioni bp: paia di basi ddNTPs: dideossinucleotidi trifosfati dNTPs: deossinucleotidi trifosfati FFPE: tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina FTC: tumore follicolare tiroideo Fw: forward ICP: Istituto Cantonale di Patologia PCR: Polymerase Chain Reaction PTC: tumore papillare tiroideo RTK: recettori tirosin chinasici RT‐PCR: Reverse Transcription Polimerase Chain Reaction Rw: reverse Tm: temperature di melting WT: Wild‐Type 7
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 3. Introduzione 3.1 I tumori tiroidei I carcinomi della tiroide rappresentano la neoplasia più frequente del sistema endocrino e la loro incidenza è in costante crescita negli Stati Uniti e nella maggior parte degli altri paesi (Nikiforov, 2011). L’aumento complessivo dell’incidenza del tumore è maggiore nelle donne rispetto agli uomini ed è maggiore nei soggetti di età compresa tra i 45 e i 50 anni. Uno dei principali fattori di rischio predisponenti allo sviluppo del tumore tiroideo è rappresentato dall’esposizione a radiazioni ionizzanti. Tale associazione è stata accertata da diversi studi condotti dopo il disastro di Chernobyl del 1986, che hanno evidenziato un aumento dell’incidenza di neoplasie tiroidee nei soggetti che al momento dell’esposizione avevano un’età compresa tra i 5 e i 10 anni. Altre condizioni predisponenti includono una familiarità per tumore tiroideo, una preesistente patologia tiroidea benigna, fattori ormonali e gravidanze, aumenti di peso ed un insufficiente apporto di iodio nella dieta (Romei et al, 2012). Più del 95% dei tumori tiroidei originano dalle cellule dell’epitelio follicolare e comprendono adenomi, carcinomi ben differenziati, carcinomi poco differenziati e carcinomi anaplastici, mentre il 3,2% dei tumori tiroidei sono derivati dalle cellule C o parafollicolari (Chien et al, 2012). I carcinomi ben differenziati rappresentano circa l’80% di tutti i tumori tiroidei e comprendono due tipi principali: il carcinoma papillare (PTC) e il carcinoma follicolare (FTC). Il PTC è il tipo più comune e rappresenta l’80% di tutte le neoplasie tiroidee. Il PTC è generalmente indolente e curabile, ma questo tumore può comunque diffondere localmente ai linfonodi e molto comuni sono la persistenza della malattia e le recidive. Il FTC rappresenta il 15% di tutte le neoplasie tiroidee ed è il secondo tipo più comune di carcinoma ben differenziato originato dall’epitelio follicolare della tiroide ed è anch’esso caratterizzato da un fenotipo indolente (Nikiforov, 2009). I carcinomi poco differenziati e i carcinomi anaplastici sono invece molto aggressivi e possono insorgere de novo o da preesistenti carcinomi follicolari o papillari (Kondo et al, 2006). Importanti fattori sia da un punto di vista prognostico sia da quello decisionale terapeutico risultano essere: l’età alla diagnosi, il tipo istologico e l’estensione della neoplasia. Tale estensione è definita dal sistema di stadiazione TNM che classifica il tumore in base alle dimensioni e al grado di infiltrazione (T), all’implicazione dei linfonodi (N) e alla presenza di metastasi a distanza (M). I noduli tiroidei sono molto frequenti nella popolazione adulta con una frequenza negli USA del 4‐
7%, ma solo una minima percentuale di questi noduli (5‐10%) risulta essere maligna (Romei et al, 8
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 2012). Poiché la maggioranza dei noduli tiroidei sono benigni e poiché la maggior parte dei tumori tiroidei sono curabili con tecniche chirurgiche se identificati precocemente, è molto importante distinguere tra i noduli benigni e maligni in modo tale che il paziente possa ricevere un trattamento appropriato, minimizzando il rischio di interventi non necessari. Attualmente la citologia su aspirazione bioptica con ago sottile (FNA), sotto controllo ecografico, è il metodo di indagine preoperatorio più diffuso che permette di diagnosticare accuratamente la maggior parte delle lesioni benigne o maligne, indirizzando quindi le decisioni terapeutiche o i follow‐up. In generale nel 15% dei casi si ottiene un campione non diagnostico e in circa il 20% dei casi i campioni sono classificati nella categoria diagnostica di proliferazione follicolare di significato indeterminato per malignità (TIR3). In questa categoria, solo il 20% dei casi risultano poi essere carcinomi all’esame istologico, eseguito dopo emitiroidectomia diagnostica (Nelva et al, 2011). Il trattamento d’elezione per il carcinoma differenziato della tiroide prevede l’asportazione totale della tiroide. Tale trattamento viene completato somministrando radio‐iodio a scopo ablativo di eventuali residui tiroidei e successiva terapia ormonale sostitutiva a vita con L‐tiroxina (LT4) con lo scopo di correggere l’ipotiroidismo indotto e di sopprimere i livelli ematici di TSH di secrezione ipofisaria. 3.2 Alterazioni molecolari del carcinoma tiroideo Numerose alterazioni genetiche sono coinvolte nello sviluppo del tumore tiroideo derivante dall’epitelio follicolare. Tali alterazioni sono rappresentate prevalentemente da mutazioni puntiformi e traslocazioni che portano all’attivazione oncogenica di importanti vie di trasduzione del segnale, in particolare la via delle MAPK (Mitogen‐Activated Protein Kinase) che regola processi chiave della proliferazione, differenziamento e apoptosi cellulare, tramite l’attivazione costitutiva di oncogeni come RET, NTRK‐1, MET, BRAF e KRAS o il silenziamento di oncosoppressori come p53, PPARγ e PTEN. Alcune di queste alterazioni genetiche sono specifiche di alcuni tipi di carcinoma tiroideo (Tabella 1) e possono essere utilizzate come importante strumento per migliorare la diagnosi delle neoplasie tiroidee (Hunt et al, 2002). Quattro tipi di alterazioni genetiche costituiscono la maggioranza delle mutazioni che incorrono nei tumori papillari e follicolari e costituiscono importanti marcatori diagnostici e prognostici. Le più frequenti alterazioni nei PTC sono rappresentate da mutazioni puntiformi nei geni BRAF e RAS (riscontrate nel 40% e nel 10% dei casi rispettivamente) e riarrangiamenti RET/PTC (riscontrati nel 10‐20% dei casi), e quelli che contengono il gene TRK (meno del 5% dei casi). Nel complesso, queste 9
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 alterazioni identificano il 70% dei PTC e sono generalmente mutuamente esclusive. Le più frequenti alterazioni che incorrono negli FTC sono rappresentate invece da mutazioni di RAS (nel 45% dei casi) e da riarrangiamenti PAX/PPAγ (nel 35% dei casi) che sono anch’esse mutuamente esclusive. Mutazioni di RAS e in un minor misura traslocazioni PAX8/PPARγ sono riscontrate anche negli adenomi follicolari con frequenze del 20‐40% e del 2‐13%, rispettivamente. Diversi studi hanno mostrato che la valutazione preoperatoria di questi marcatori può migliorare l’accuratezza della diagnosi citologica fatta su FNA per pazienti con diagnosi di significato indeterminato o con sospetto di malignità per identificare le lesioni maligne e aiutare quindi nella scelta terapeutica (Nikiforov, 2011). Tabella 1: alterazioni molecolari del carcinoma tiroideo (tratta da Nikiforov, 2011) Carcinoma papillare della tiroide Prevalenza (%) Mutazione BRAF 40‐45 Traslocazione RET/PTC 10‐20 Mutazione RAS 10‐20 Traslocazione TRK <5 Carcinoma follicolare della tiroide Prevalenza (%) Mutazione RAS 40‐50 Traslocazione PAX8/PPARy 30‐35 3.3 Alterazioni molecolari del carcinoma papillare 3.3.1 La mutazione del gene BRAF L’alterazione più comune dei PTC è la mutazione del gene BRAF (presente nel 40‐45% dei casi). BRAF è una proteina serin treonina chinasi che appartiene alla famiglia delle proteine RAF, effettori intracellulari della cascata delle MAPK. Le mutazioni principali di BRAF nel PTC sono mutazioni puntiformi che coinvolgono il nucleotide 1799 e che portano alla sostituzione di una valina con un acido glutammico al codone 600 (V600E). Tale mutazione comporta la costitutiva attivazione della chinasi BRAF con conseguente attivazione cronica della via metabolica delle MAPK e successiva deregolazione della crescita e della proliferazione cellulare. La mutazione V600E di BRAF è tipica del PTC con istologia classica e della variante a cellule alte, mentre è rara nella variante follicolare. Le mutazioni di BRAF non sono state trovate nei FTC e nei noduli tiroidei benigni e, rappresentano pertanto un marcatore specifico del PTC e, quindi, un utile supporto per 10
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 migliorare l’accuratezza della diagnosi citologica dei noduli tiroidei (Nikiforov, 2011). Diversi studi indicano che le mutazioni di BRAF si associano ad una maggiore aggressività del tumore in termini di invasione, stadio clinico e rischio di ripresa dalla malattia (Xing et al, 2005). Inoltre tali mutazioni sono associate alla perdita della capacità di captare lo iodio 131 e quindi ad una scarsa risposta terapeutica. Per questi motivi la valutazione preoperatoria dello stato mutazionale di BRAF rappresenterebbe un utile parametro per la scelta di un miglior approccio chirurgico e terapeutico. 3.3.2 La traslocazione RET/PTC Il proto‐oncogene RET codifica per un recettore tirosin chinasico (RTK) di membrana coinvolto nel controllo della differenziazione cellulare e della proliferazione. Normalmente il gene RET è espresso nelle cellule parafollicolari o cellule C, ma non nelle cellule follicolari dove, invece, può essere attivato solo in caso di presenza di un riarrangiamento del gene RET. Il recettore RET è una proteina transmembrana che presenta una porzione extracellulare formata da quattro domini simili alle caderine (cadherin‐like) e una parte intracellulare che presenta dei domini ricchi in tirosina (Figura 1). In presenza di specifici ligandi quali neururina, artimina, persepina e i fattori di derivazione dalle cellule gliali, il recettore RET, presente nella membrana cellulare sotto forma di monomero, dimerizza con un altro recettore. Tale dimerizzazione porta all’attivazione del recettore tramite un processo di autofosforilazione dei domini tirosinchinasici (TK) e quindi all’attivazione delle cascate metaboliche a valle (MAPK e via di PI3K‐AKT). Tali cascate intracellulari sevono a propagare i segnali del recettore RET di membrana all’interno del nucleo attraverso una serie di proteine adattatore e chinasi intracitoplasmatiche (tra le quali RAS e BRAF) che portano alla regolazione della trascrizione di geni coinvolti nella differenziazione, nella proliferazione e nella sopravvienza cellulare (Figura 2). Nel PTC l’attivazione di questa via metabolica è causata principalmente da mutazioni puntiformi di RAS e BRAF o da riarrangiamenti RET/PTC e tale attivazione costitutiva risulta essere responsabile dell’insorgenza e della progressione tumorale (Nikiforov, 2011). 11
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Figura 1: struttura del recettore RET formato da un dominio extracellulare N‐terminale, di legame con il ligando, da un dominio trans‐membrana, e da un dominio intracellulare C‐terminale dove sono presenti residui di tirosina (domini tirosin chinasici). Figura 2: cascate metaboliche intracellulari attivate dal recettore RET. 12
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 I riarrangiamenti a carico del gene RET (RET/PTC), rappresentano la seconda alterazione più comune nei PTC. Tali riarrangiamenti sono presenti in circa il 35% dei casi di PTC sebbene la percentuale sia variabile tra il 3 e l’85% a seconda degli studi, in funzione dell’area geografica di provenienza dei tumori, delle differenti metodologie di analisi utilizzate e dell’eterogeneità tumorale. La distribuzione del riarrangiamento RET/PTC all’interno di un tumore può essere infatti eterogenea e può essere presente o nella maggior parte delle cellule neoplastiche (riarrangiamento RET/PTC di tipo clonale), oppure in una piccola frazione di cellule tumorali (riarrangiamento RET/PTC di tipo non clonale) (Santoro et al, 2006). Questo aspetto è da tenere in considerazione per le scelte delle differenti metodologie di analisi utilizzate: l’analisi di questa traslocazione può infatti essere effettuata sia con RT‐PCR (Reverse Transcription Polimerase Chain Reaction), tecnica migliore per tessuti freschi o congelati con una sensibilità che non dovrebbe essere maggiore all’1% per evitare di rilevare mutazioni non clonali e quindi senza rilevanza clinica, oppure mediante FISH, tecnica più performante in caso di tessuti FFPE ma la cui valutazione richiede la determinazione di livelli di cut‐off corretti affinché non si incorra in risultati falsi positivi (Nikiforov, 2011). I riarrangiamenti clonali sono descritti in circa il 20% dei PTC mentre i riarrangiamenti non clonali sono stati identificati non solo nei PTC, ma anche nel 10‐45% degli adenomi tiroidei e altre lesioni non neoplastiche (Santoro et al, 2006). I riarrangiamenti RET/PTC risultano essere più frequenti nei pazienti esposti a radiazioni (50‐80%) e nei carcinomi papillari dei bambini o adolescenti (40%‐70%) (Nikiforov, 2011). Tali riarrangiamenti sono specifici delle lesioni papillari maligne e generalmente non sono riscontrati (se non con metodologie di analisi molto sensibili) negli adenomi e nelle lesioni benigne. I riarrangiamenti RET/PTC portano alla formazione di oncogeni chimerici che risultano dalla fusione tra la porzione 3’ del gene RET e la porzione 5’ di geni eterologhi ubiquitariamente espressi e caratterizzati dalla presenza di sequenze nucleotidiche codificanti per proteine che formeranno domini coiled coil che permettono la dimerizzazione costitutiva del dominio tirosin chinasico di RET. Le proteine di fusione contengono il dominio tirosin chinasico del recettore RET intatto e risultano costitutivamente attivate portando quindi all’attivazione costitutiva della cascata delle MAPK. Tale processo determina una proliferazione incontrollata delle cellule follicolari caratterizzate dalla presenza del riarrangiamento RET/PTC e quindi allo sviluppo successivo del tumore. Sono state descritte più di 11 varianti, ma i due tipi di riarrangiamento più frequenti sono RET/PTC1 (nel 60‐70% dei casi) e RET/PTC3 (nel 20‐30% dei casi). RET/PTC1 è formato dalla fusione del gene RET con il gene CCDC6 (H4) e RET/PTC3 dalla fusione del gene RET con il gene NCOA4 (ELE1). Entrambe le traslocazioni 13
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 sono inversioni paracentriche poiché sia il gene RET che i geni CCDC6 ed NCOA4 si trovano sul braccio lungo del cromosoma 10 (Nikiforov, 2003). RET/PTC1 si trova con maggiore frequenza nei tumori sporadici e nelle varianti classiche del PTC, ma può essere anche trovato nei microcarcinomi papillari, mentre RET/PTC3 è maggiormente presente nei carcinomi papillari indotti da radiazioni e nelle varianti solide dei PTC (Santoro et al, 2006). La correlazione tra la presenza delle traslocazioni RET/PTC e la prognosi non sono attualmente chiarite; vi sono evidenze che indicano un’associazione tra la presenza di un riarrangiamento RET/PTC1 a un decorso più favorevole della malattia, rispetto ai pazienti con presenza di traslocazione RET/PTC3, associata ad un comportamento clinico più aggressivo. Altri studi hanno suggerito che i casi positivi per la presenza di un riarrangiamento RET/PTC sembrano mostrare un’estensione più ampia della malattia e un tasso di coinvolgimento linfonodale maggiore rispetto ai casi negativi per le traslocazioni. Tuttavia altri studi hanno confutato tali considerazioni (Romei et al, 2012). Dal punto di vista diagnostico lo studio della traslocazione RET/PTC ha poco significato nel caso in cui vi sia un prelievo istologico, perché i tumori caratterizzati dalla traslocazione RET/PTC normalmente hanno un’architettura di tipo papillare, che non crea grosse difficoltà diagnostiche. Al contrario tale analisi potrebbe risultare particolarmente utile nelle diagnosi preoperatorie effettuate mediante FNA dove sovente si hanno difficoltà a livello diagnostico soprattutto nei casi che hanno una citologia di significato indeterminato (TIR3) (Nikiforov, 2011). 14
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 4. Scopo del lavoro Negli ultimi anni l’acquisizione di conoscenze sempre più approfondite e specifiche riguardanti le alterazioni genetiche proprie delle neoplasie tiroidee ha aperto la possibilità di applicare metodiche molecolari per l’analisi di tali deregolazioni alla diagnostica citologica delle patologie tiroidee. Le principali alterazioni molecolari specifiche dei carcinomi tiroidei sono i riarrangiamenti PAX8/PPARγ e mutazioni RAS per i carcinomi follicolari, e riarrangiamenti RET e mutazioni BRAF per i carcinomi papillari. Nel Laboratorio di Patologia Molecolare dell’ICP di Locarno sono già in uso diagnostico le analisi di PAX8/PPARG, RAS e di BRAF per coadiuvare l’analisi citologica dei tumori tiroidei. L’obiettivo del mio lavoro sarà quello di mettere a punto l’analisi delle traslocazioni RET/PTC con lo scopo di completare il pannello delle principali analisi molecolari per la diagnostica del tumore tiroideo. 15
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 5. Pazienti, materiali e metodi 5.1 Pazienti Per la validazione dell’analisi di traslocazione RET/PTC sono stati analizzati 17 pazienti affetti da PTC con diagnosi istologica effettuata presso l’ICP di Locarno tra il 2010 e il 2012. I tessuti di ogni paziente, fissati in formalina ed inclusi in paraffina (FFPE) sono disponibili presso gli archivi dell’ICP. Per ogni paziente l’analisi della traslocazione RET/PTC è stata effettuata sia su tessuto tumorale sia sul tessuto normale della tiroide. Sul tessuto tumorale è stata effettuata inoltre l’analisi dello stato mutazionale del gene BRAF, per ottenere un quadro completo delle alterazioni molecolari più frequenti nel PTC. 5.2 Materiali e metodi Per eseguire le metodiche descritte nel presente lavoro di diploma, è stato necessario lavorare in sterilità e nelle migliori condizioni che evitassero il più possibile le contaminazioni: i banconi di lavoro, le pipette e gli strumenti utilizzati sono stati puliti con ipoclorito di sodio per le lavorazioni con acidi nucleici (DNA e RNA) e con RNAsi Zap (Invitrogen) per le lavorazioni con RNA, i guanti sono stati cambiati ad ogni passaggio e la fase di estrazione degli acidi nucleici è stata effettuata sotto cappa chimica precedentemente irradiata con raggi UV. 5.2.1 Estrazione degli acidi nucleici Il DNA e l’RNA sono stati estratti da tessuti FFPE dopo la valutazione delle sezioni istologiche, colorate mediante ematossilina‐eosina, da un medico patologo. Per l’analisi RET/PTC l’RNA è stato estratto sia da tessuto tumorale sia da tessuto sano. L’analisi dello stato mutazionale di BRAF è stata effettuata solo su DNA genomico estratto da tessuto tumorale. Per l’estrazione di DNA e RNA da tessuto tumorale, nei casi in cui l’area di tumore selezionato fosse composta da più del 70% di cellule tumorali, sono state poste 6‐7 sezioni istologiche da 7 µm (per il DNA) o 2‐4 sezioni da 10 µm (per l’RNA) in provette Eppendorf da 2ml. Per i tessuti in cui la quantità di cellule tumorali era inferiore al 70% è stata effettuata una macrodissezione: l’area selezionata dal patologo è stata prelevata con bisturi monouso da sezioni in bianco su vetrino (dello stesso spessore delle sezioni poste in provetta) e posta in provette Eppendorf da 2 ml. Per l’analisi del tessuto sano sono stati scelti reperi comprendenti il 100% di cellule sane. Per l’estrazione del DNA e dell’RNA da FFPE 16
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 sono stati usati kit commerciali: il QIAmp DNA MiniKIT e l’RNAeasi MiniKit (Qiagen, Chatsworth, CA, USA) in cui sono presenti reagenti e materiali necessari per l’estrazione. I protocolli prevedono una fase di lisi cellulare che permetta il rilascio degli acidi nucleici e una purificazione degli acidi nucleici tramite l’assorbimento su una membrana di silice della colonnina presente nei kit. In seguito è prevista una fase di eluizione in cui gli acidi nucleici vengono rilasciati dalla membrana nel tampone di eluizione o in acqua DNAasi e RNAasi free. I procedimenti sono descritti dettagliatamente negli allegati 11.1 e 11.2. 5.2.2 Quantificazione degli acidi nucleici estratti dai tessuti La quantificazione degli acidi nucleici è stata effettuata tramite uno spettrometro UV‐visibile Nanodrop 1000 (Witec, Littau, CH) che stabilisce la concentrazione di acidi nucleici misurando l’assorbanza dei campioni in volumi di 2 µl. Il procedimento è descritto in dettaglio nell’allegato 11.3. 5.2.3 Amplificazione del DNA genomico tramite PCR Il DNA genomico estratto è stato amplificato tramite reazione di PCR (Polymerase Chain Reaction), reazione che permette l’amplificazione in vitro degli acidi nucleici. La reazione di PCR inizia con una denaturazione di 10 minuti a 95°C, in seguito alla quale vengono ripetuti tre passaggi per 35‐
45 volte con tempi e temperature definite. Questi passaggi sono la denaturazione (92‐98°C) che permette di separare le due catene complementari di DNA, l’Ibridazione (40‐60°C), passaggio in cui i primers si legano a specifiche sequenze complementari del DNA stampo e la cui temperatura è determinata sperimentalmente, e l’estensione (70‐72°C), passaggio in cui la DNA polimerasi sintetizza il nuovo filamento di DNA. La reazione avviene all’interno di termociclatori, strumenti che mantengono i campioni in incubazione, variando le temperature a seconda dell’impostazione del protocollo. 50 ng di DNA (2 µl di una diluizione a 25 ng/µl) vengono aliquotati in provette da 0,2 ml, aggiungendo un controllo positivo, che consiste in un campione di DNA già amplificato precedentemente con successo, e un controllo bianco, cioè acqua sterile, privo di DNA, per valutare la presenza di contaminazioni. A questi verranno aggiunti 23 µl di una miscela di reazione, la cui costituzione è descritta nell’allegato 11.4. 17
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 5.2.4 Analisi dello stato mutazionale del gene BRAF L’analisi dello stato genico dell’esone 15 di BRAF è stata eseguita mediante PCR e sequenziamento diretto seguendo i protocolli già in uso presso l’ICP per l’attività diagnostica. Per l’analisi dello stato mutazionale del gene BRAF è stata amplificata, tramite primers specifici, una regione dell’esone 15 comprendente il codone 600, codone in cui avvengono la quasi totalità delle mutazioni oncogeniche del gene BRAF. Per l’analisi dell’esone 15 del gene BRAF è stato utilizzato il seguente protocollo (tabelle 2 e 3) con la seguente coppia di primers, con la relativa temperatura di ibridazione e lunghezza dell’amplificato: ‐
Primer BRAF esone 15 Forward: 5’‐TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA‐3’ ‐
Primer BRAF esone 15 Reverse: 5’‐ GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA‐3’ ‐
Temperatura di annealing: 52°C ‐
Dimensione dell’amplificato: 250 bp Tabella 2: composizione della miscela di reazione per la reazione di PCR dell’esone 15 del gene BRAF Concentrazione iniziale Conc./quantità finale Volume/campione DNA 25,0 ng/µl 50 ng 2,0 µl PCR Buffer 10X 1X 2,5 µl MgCl2 25 mM 3 mM 3,0 µl dNTPs 10 mM 0,2 mM 0,5 µl dUTP 10 mM 0,04 mM 0,1 µl Primer BRAF Fw 10 µM 0,5 µM 1,25 µl Primer BRAF Rw 10 µM 0,5 µM 1,25 µl Taq Gold 5 U/µM 2, U/campione 0,4 µl Acqua sterile 14 µl 18
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Tabella 3: protocollo di amplificazione dell’esone 15 del gene BRAF Temperature Tempo di reazione Stabilizzazione reazione 50°C 2’ Denaturazione iniziale 95°C 10’ Denaturazione 95°C 15’’ Ibridazione 52°C 30’ Estensione 72°C 30’’ Estensione finale 72°C 3’ Fine PCR 10°C ∞ 45 cicli
5.2.5 Elettroforesi su gel di agarosio Al fine di verificare l’ottenimento di un buon prodotto di amplificazione per tutti i campioni analizzati si è ricorso alla corsa su gel di agarosio. Si tratta di un metodo che permette di separare le molecole di DNA in base alle loro dimensioni: molecole piccole infatti migrano più velocemente rispetto a quelle grandi. La tecnica sfrutta la carica elettrica negativa del DNA per permettere la sua migrazione in un campo elettrico, verso il polo positivo. La migrazione avviene attraverso un gel di agarosio che funge da setaccio molecolare, rallentando la corsa delle molecole. La concentrazione del gel può variare a seconda delle necessità: se le molecole da separare hanno dimensioni poco diverse l’una dall’altra, occorrerà avere maglie più strette e perciò la concentrazione del gel dovrà essere maggiore. Se, come nel nostro caso, i prodotti di amplificazione sono di dimensioni di circa 100‐300 bp, è sufficiente utilizzare un gel all’1,8%. La dimensione degli amplificati ottenuti è stata poi valutata grazie ad un marker, una miscela di frammenti di DNA a lunghezza nota che viene fatta correre nello stesso gel. I procedimenti di preparazione del gel di agarosio, della corsa elettroforetica e di visualizzazione dei risultati sono descritti in dettaglio nell’allegato 11.5. 5.2.6 Purificazione del DNA amplificato Prima di procedere alla PCR di sequenza è necessario purificare il DNA amplificato, per eliminare i reagenti in esubero della PCR rimasti in soluzione (primers, nucleotidi non incorporati e la Taq Polimerasi), che potrebbero compromettere il corretto sequenziamento del DNA. Per questo scopo è stato usato il kit MSB®SPIN PCRapace (STRATEC Molecular, Gmbh, Berlino, Germania), che 19
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 contiene colonne con un filtro che trattiene il DNA, mentre i contaminanti vengono eliminati tramite un lavaggio. In seguito il DNA viene eluito con un buffer in una provetta Eppendorf da 1,5 ml. Il procedimento di purificazione è descritto in dettaglio nell’allegato 11.6. 5.2.7 PCR di sequenza (cyclesequencing) I filamenti del prodotto amplificato, a seguito della purificazione, vengono marcati e amplificati nella reazione di sequenziamento (cyclesequencing). Si tratta di una particolare PCR effettuata in presenza di un solo primer (forward o reverse), dei quattro dNTPs e di quattro dideossinucleotidi trifosfati (ddNTPs) marcati con quattro fluorocromi differenti che fungono da terminatori della reazione. La reazione avviene normalmente, ma in alcune catene vengono introdotti casualmente i ddNTPs che bloccano la reazione siccome sono privi del gruppo ossidrile (‐OH) all’estremità 3’ che permetterebbe l’incorporamento di ulteriori nucleotidi. Ciò permette la formazione di frammenti di lunghezze diverse, marcate a seconda del nucleotide che blocca la reazione. Questi frammenti verranno rilevati grazie ad un raggio laser di un sequenziatore automatico e interpretati da un programma apposito. Il dettaglio è descritto nell’allegato 11.7. 5.2.8 Purificazione del DNA dopo PCR di sequenza Prima di poter sequenziare i frammenti ottenuti mediante la PCR di sequenza è necessario eliminare i dNTPs, i ddNTPs e i primers che non sono stati incorporati nella reazione. Per tale scopo viene usato il kit G50 Dye Terminator Removal kit (RBC Bioscience) che fornisce delle colonne contenenti sfere di gel pre‐idratate. Il principio è quello della cromatografia per gel‐
filtrazione, dove i contaminanti vengono separati dal DNA sfruttando il differente peso molecolare e le differenti dimensioni. Il DNA attraversa velocemente il gel e viene recuperato all’interno di una eppendorf di 1,5 ml. Il procedimento è scritto in dettaglio nell’allegato 11.8. 5.2.9 Il sequenziamento Il sequenziamento avviene in uno strumento in grado di effettuare l’elettroforesi capillare, dotato da un raggio laser (3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Esso è in grado di separare due frammenti di DNA che differiscono solo di 1 bp distinguendoli grazie ai fluorocromi marcati. Per ottenere le sequenze dell’amplificato del gene d’interesse, i pellet ottenuti a seguito della seconda purificazione sono stati risospesi in 15 µl di formammide (Hi‐Di Formammide, Applied Biosystems) 20
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 e messi in un termoblocco a 95°C per 5 minuti, al fine di denaturare il DNA. I filamenti, di cui uno marcato, vengono separati in base alle loro dimensioni tramite migrazione capillare in un polimero (3130 POP‐7 Performancy Optimized Polymer, Applied Biosystems) immerso in un campo elettrico. Un raggio laser posto al termine del capillare eccita i fluorocromi coniugati all’ultimo didessossiribonucleotide incorporato. Lo strumento rileva e analizza la fluorescenza riemessa dalle molecole e il programma apposito (Sequencing Analysis Software v5.2, Applied Biosystems) rielabora le fluorescenze rilevate in un elettroferogramma, cioé un grafico che rappresenta la sequenza di basi visualizzata tramite una successione di picchi i cui colori corrispondono ai diversi fluorocromi e quindi alle diverse basi. 5.2.10 Retrotrascrizione dell’RNA a cDNA La retrotrascizione è una metodica che serve a sintetizzare una molecola di DNA a partire da RNA ad opera dell’enzima trascrittasi inversa. Il DNA ottenuto, complementare al filamento stampo di RNA messaggero, prende il nome di cDNA. L’enzima trascrittasi inversa per poter iniziare la reazione di retrotrascrizione dell’RNA necessita di brevi sequenze nucleotidiche d’innesco che possono essere rappresentate o da un oligonucleotide costituito da una serie di timine (oligo dT) complementari alle adenine presenti nelle code di 150‐200 bp di adenine (catene poli‐A) presenti all’estremità 3’ dell’RNA messaggero, oppure da primers a sequenza casuale (random hexamers) che si appaiano casualmente alle sequenze di RNA. Nel nostro caso dato che l’RNA estratto da tessuti FFPE può essere degradato ad opera della formalina, utilizzeremo sia gli oligo dT che i random hexamers, per rendere più efficiente la reazione di retrotrascrzione,. La retrotrascrizione è stata eseguita utilizzando protocolli e reagenti forniti da Invitrogen (Carlsbad, California, USA). 500 ng di RNA estratto da tessuto FFPE (diluito in un volume finale di 7,5 µl con acqua RNAasi free) vengono aliquotati in provette da 0,2 µl, aggiungendo un controllo positivo che consiste in una miscela di RNA totale umano (Applied Biosystems) per verificare che la reazione di retrotrascrizione avvenga correttamente, e un controllo bianco, cioé acqua sterile, per valutare la presenza di eventuale contaminazione. A questi viene aggiunta una prima miscela di reazione (Tabella 4) costituita da: ‐
Random hexamers (Invitrogen): corti oligonucleotidi che si legano casualmente all’RNA, ‐
Oligo dT (Invitrogen): oligonucleotidi che si appaiano alla coda poli‐A dell’RNA messaggero 21
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 I campioni vengono poi posti nel termociclatore a 70°C per 5 minuti (protocollo di retrotrascrizione fase I, tabella 5). In seguito ai campioni viene aggiunta una seconda miscela di reazione (Tabella 6) composta da: ‐
Miscela equimolare di dNTPs (Amersham, Buckinghamshire, UK) 10 mM ‐
DTT (ditiotreitolo)(Invitrogen), forte agente riducente che ottimizza il lavoro della trascrittasi inversa prevenendone l’ossidazione ‐
Buffer FS (Invitrogen), buffer di retrotrascrizione ‐
Rnase Inhibitor (Invitrogen), enzima che inibisce l’attività della RNAasi ‐
Acqua sterile RNAasi free ‐
SuperScript (Invitrogen), enzima stabile ad alte temperature proveniente da un gene modificato di un retrovirus (Moloney Murine Leukemia Virus) che è in grado di sintetizzare cDNA a partire da un mRNA stampo. Si procede quindi con l’incubazione a 37°C per un’ora affinché l’enzima retrotrascriva l’RNA a cDNA, in seguito la temperatura viene portata a 95°C per 5 minuti per disattivare l’enzima (protocollo di retrotrascrizione fase II, tabella 7). Il cDNA così ottenuto può essere conservato a ‐
20°C e utilizzato per le successive reazioni di PCR per l’analisi delle traslocazioni RET/PTC. Tabella 4: composizione della miscela di reazione di retrotrascrizione fase I Conc. iniziale Quantità/Conc. finale Volume/campione Campione RNA ‐ 500 ng 7,5 µl R. hexamers 50 µM 5 µM 2,0 µl Oligo dT 50 µM 5 µM 2,0 µl Tabella 5: protocollo di retrotrascrizione fase I temperatura tempo Ibridazione 70°C 5’ Fine programma 25°C ∞ Tabella 6: composizione della miscela di reazione di retrotrascrizione fase II Conc. iniziale Conc. finale Volume/campione dNTPs 10 mM 5 mM 1 µl DTT 0,1 M 0,01 M 2 µl 22
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Buffer FS 5X 1X 4 µl Rnase Inibitor 20 U/µl 0,5 U/µl 0,5 µl Superscript 200 U/µl 10 U/µl 1 µl Tabella 7: protocollo di retrotrascrizione fase II temperatura tempo Ibridazione 60°C 60’ Disattivazione enzima 95°C 5’ Fine programma 4°C ∞ 5.2.11 Messa a punto dell’analisi delle traslocazioni RET/PTC tramite metodica di RT‐
PCR L’analisi della traslocazione RET/PTC prevede, a seguito dell’estrazione di RNA e successiva retrotrascrizione a cDNA, l’amplificazione del gene di fusione determinato dalla traslocazione del dominio tirosin chinasico del gene RET a regioni 5’ terminali di geni eterologhi che portano all’attivazione costitutiva dell’oncogene RET/PTC. In particolare sono state allestite due reazioni di PCR per l’amplificazione delle due forme principali di traslocazione: RET/PTC1 (determinato dalla fusione del gene RET con il gene CCDC6) e RET/PTC3 (determinato dalla fusione del gene RET con il gene NCOA4), utilizzando due coppie di primers fiancheggianti i punti di fusione dei geni di fusione RET/PTC1 e RET/PTC3. I primers forward di ogni coppia sono stati marcati con due fluorocromi diversi in modo tale da permettere la visualizzazione dei prodotti di PCR tramite l’analisi dei frammenti amplificati, eseguita mediante elettroforesi capillare in un sequenziatore automatico (3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). 5.2.12 Scelta dei primers e PCR a gradiente di temperatura Per mettere a punto la metodica di PCR per l’analisi dei geni di fusione RET/PTC1 e RET/PTC3 è stato necessario cercare le sequenze dei geni di interesse (RET, CCDC6 e NCOA4), tramite l’uso di siti internet specializzati nel settore quali National Center for Biotecnology Information (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov/). La scelta dei primers adatti all’amplificazione genica dei due geni di fusione, è avvenuta tramite la consultazione della letteratura scientifica proposta da PubMed inerente l’analisi tramite RT‐PCR delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3. Per ogni gene di fusione analizzato è stata scelta una coppia di primers di cui è stata verificata la posizione di appaiamento 23
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 sulle sequenze geniche di interesse, verificando in particolare che fossero disegnati sulle regioni fiancheggianti il punto di fusione tra due geni coinvolti nella traslocazione (esone 12 di RET, esone 1 di CCDC6 ed esone 10 di NCOA4). Sono stati scelti i primers i cui prodotti di amplificazione non superassero le 250 bp per ridurre il rischio che i frammenti traslocati non venissero amplificati, in quanto gli acidi nucleici provenienti da tessuto FFPE sono molto frammentati. Per ogni coppia di primers è stata calcolata la temperatura di melting (Tm) teorica tramite l’utilizzo di un software reperibile in rete che si basa su un algoritmo matematico (Oligo Calculator (http://mcb.berkeley.edu/labs/krantz/tools/oligocalc.html). In seguito sono state stabilite le temperature di ibridazione ottimali mediante una PCR a gradiente di temperatura, scegliendo, per le reazioni di amplificazione, cinque temperature di ibridazione che ricadevano nel range calcolato dalla Tm media, tra i primers forward e reverse, ±5°C. Lo scopo era quello di definire la temperatura migliore di ibridazione, alla quale la reazione di PCR risultasse maggiormente efficiente e alla quale l’analisi dei frammenti fosse di buona qualità. Dato che non avevamo a disposizione campioni di pazienti o linee cellulari recanti la traslocazione RET/PTC1 e RET/PTC3, per mettere a punto la metodica sono stati utilizzati dei costrutti plasmidici comprendenti le regioni genomiche coinvolte nei riarrangiamenti RET/PTC1 e RET/PTC3 (Figura 3) . Figura 3: a) sequenza di parte del gene di fusione RET/PTC1 inserita nel costrutto plasmidico; in rosso l’esone 12 del gene RET, in nero parte dell’esone 1 del gene CCDC6. b) Sequenza del gene di fusione RET/PTC3 inserita nel costrutto plasmidico; in rosso l’esone 12 del gene RET, in nero l’esone 10 del gene NCOA4. 24
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 I costrutti sono stati diluiti a 10 ng/µl e a 1 ng/µl, e utilizzati 5 µl di DNA per le PCR a gradiente. È stato aggiunto per ogni temperatura del gradiente un controllo negativo (acqua distillata) allo scopo di mostrare l’assenza di contaminazioni. Per l’amplificazione delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3 sono state eseguite le reazioni di PCR a gradiente con il seguente protocollo (tabelle 8 e 9), utilizzando le seguenti coppie di primers, con le relative temperature di annealing e lunghezza attesa dell’amplificato: ‐
Primers RET/PTC1 Forward: 5’‐6FAM‐GGAGACCTACAAACTGAAGTGCAA‐3’ ‐
Tm= 56°C Primers RET/PTC1 Reverse: 5’‐CCCTTCTCCTAGAGTTTTTCCAAGA‐3’ Tm=56°C Dimensioni dell’amplificato: 136 bp ‐
Primers RET/PTC3 Forward: 5’‐NED‐CCAGTGGTTATCAAGCTCCTTACA‐3’ ‐
Tm=57°C Primers RET/PTC3 Reverse: 5’‐ GGGAATTCCCACTTTGGATCCTC‐3’ Tm=56°C Dimensioni dell’amplificato: 106 bp I primers forward sono fluorocromati (RET/PTC1 con 6‐FAM di colore blu e RET/PTC3 con NED di colore giallo), allo scopo di evidenziare i prodotti amplificati nell’analisi dei frammenti mediante elettroforesi capillare su un sequenziatore automatico (3130 Genetic Analyser, Applied Biosystems). Tabella 8: composizione della miscela di reazione usata per la messa a punto dell'analisi delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3 Conc. iniziale Costrutti RET/PTC1 e RET/PTC3 10 ng/ µl; 1 ng/ µl 10 ng/ µl; 1 ng/ µl 5 µl PCR Buffer II 10X 1X 2,5 µl MgCl2 25 mM 2 mM 2 µl dNTPs 10 mM 0,2 mM 0,5 µl dUTP 10 mM 0,04 mM 0,1 µl 0,2 µM 0,5 µl Primer Forward (RET/PTC1 o 10 µM Quantità/Conc. finale Volume/campione RET/PTC3) 25
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno Primer Reverse (RET/PTC1 o 10 µM 2012/2013 0,2 µM 0,5 µl RET/PTC3) Taq Gold 5 U/µM 2 U/campione 0,4 µl Acqua sterile 13,5 µl Tabella 9: protocollo di amplificazione a gradiente di temperatura usato per la messa a punto dell'analisi delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3 Temperature Tempo di reazione Stabilizzazione reazione 50°C 2’ Denaturazione iniziale 95°C 10’ Denaturazione 95°C 30’’ Ibridazione (annealing) 56°C (Tm)±5°C 30’’ Estensione 72°C 30’’ Estensione finale 72°C 7’ Fine PCR 4°C ∞ 40 cicli
5.2.13 Validazione della metodica di analisi di traslocazione RET/PTC Per la validazione della metodica di analisi delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3 è stato estratto l’RNA di 17 pazienti e retrotrascritto a cDNA. In seguito è stata e seguita la reazione di PCR per le traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3 secondo i protocolli messi a punto. Per verificare la qualità e l’integrità dell’RNA estratto, l’adeguatezza del campione analizzato e l’efficienza della reazione di retrotrascrizione, per ogni campione di cDNA (compresi i controlli bianchi e positivi di retrotrascrizione) sono stati amplificati due geni di controllo, PGK1 e PAX8, secondo protocolli già in uso diagnostico presso l’ICP (paragrafo 5.2.14). Per ogni reazione di PCR sono stati aggiunti un controllo negativo (acqua sterile) e come controlli positivi i costrutti plasmidici diluiti a 1 ng/µl. L’analisi RET/PTC1 e RET/PTC3 è stata eseguita per ogni paziente sia su tessuto sano che su tessuto tumorale, al fine di mostrare che l’eventuale presenza di una traslocazione fosse presente solamente nel tessuto tumorale. Con lo scopo di avere un quadro maggiormente completo delle alterazioni genetiche dei pazienti presi in esame, è stata effettuata l’analisi dell’esone 15 del gene BRAF (paragrafo 5.2.4). 26
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 5.2.14 Amplificazione dei geni di controllo PGK1 e PAX8 Il gene PGK1 è espresso ubiquitariamente in tutti i tessuti umani e per la sua amplificazione tramite PCR sono stati utilizzati primers costruiti sull’esone 9 e sull’esone 11, che permettono quindi di amplificare soltanto il cDNA e non il DNA genomico. La lunghezza dell’amplificato ottenuto è di 225 bp circa e quindi l’avvenuta amplificazione di questo gene nei campioni di RNA estratto è indice di buona qualità e di integrità dell’RNA stesso. Il gene PAX8 è invece espresso soltanto dalle cellule epiteliali follicolari tiroidee e quindi la sua amplificazione tramite PCR nei campioni in analisi indica non solo l’integrità dell’RNA, ma anche la presenza di cellule tiroidee nel materiale analizzato. I primers utilizzati per la reazione di PCR sono costruiti sugli esoni 5 e 6 del gene PAX8. Entrambi i primers forward dei due geni di controllo sono marcati con il fluorocromo VIC. Le reazioni di PCR dei geni di controllo sono allestite in una singola miscela di reazione eseguendo una PCR duplex. Per l’analisi dei geni di controllo è stato utilizzato il seguente protocollo allestito sulla base della pubblicazione di Algeciras‐Schimnich (Algeciras‐Schimnich et al, 2010) (Tabelle 10 e 11) con le seguenti coppie di primers, con le relative temperature di ibridazione e lunghezza degli amplificati: Sequenza dei primers: ‐
Primer PAX8 Forward: 5’‐VIC ‐TCAACCTCCCTATGGACAGC‐3’ ‐
Primer PAX8 Reverse: 5’‐GGAGTAGGTGGAGCCCAGG‐3’ ‐
Primer PGK1 Forward: 5’‐VIC ‐CAGTTTGGAGCTCCTGGAAG‐3’ ‐
Primer PGK1 Reverse: 5’‐GAGCTGAGATGCTGTGCAAC‐3’ ‐
Temperatura di annealing: 65°C ‐
Dimensione dell’amplificato: PAX 8: 122 bp PGK1: 224 bp Tabella 10: composizione della miscela di reazione per la reazione di PCR dei geni di controllo PAX8 e PGK1 Concentrazione iniziale Quantità/Conc. finale Volume/campione
cDNA 25 ng/µl 10 ng 5 µl PCR Buffer 10X 1X 2,5 µl MgCl2 25 mM 2 mM 2 µl dNTPs 10 mM 0,2 mM 0,5 µl dUTPs 10 mM 0,04 mM 0,1 µl Primer PAX8 Fw 10 µM 0,2 µM 0,5 µl 27
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Primer PAX8 Rw 10 µM 0,2 µM 0,5 µl Primer PGK1 Fw 10 µM 0,2 µM 0,5 µl Primer PGK1 Rw 10 µM 0,2 µM 0,5 µl Taq Gold 5 U/µM 2 U/campione 1 µl Acqua sterile 11.9 µl Tabella 11: protocollo di amplificazione per i geni di controllo PAX8 e PGK1 Temperature Tempo di reazione Stabilizzazione reazione 50°C 2’ Denaturazione iniziale 95°C 10’ Denaturazione 95°C 30’’ Ibridazione 65°C 30’’ Estensione 72°C 30’’ Estensione finale 72°C 7’ Fine PCR 4°C ∞ 40 cicli
5.2.15 Analisi dei prodotti di amplificazione tramite elettroforesi capillare L’elettroforesi capillare è una metodica che sfrutta un campo elettrico per separare i frammenti di DNA in base alle loro dimensioni. Tramite la migrazione attraverso un polimero (3130 POP‐7 Performancy Optimized Polymer, Applied Biosystems), i frammenti di DNA vengono analizzati alla fine della migrazione da un raggio laser che rileva i fluorocromi legati ai primers utilizzati per l’amplificazione dei geni di interesse. I prodotti ottenuti dall’amplificazione di RET/PTC1 e RET/PTC3 e dei geni di controllo PGK1 e PAX8 sono stati diluiti in acqua sterile e caricati al sequenziatore per l’elettroforesi capillare. Dato che i prodotti RET/PTC1 e RET/PTC3 sono marcati con fluorocromi diversi e i prodotti PGK1 e PAX8, che pur essendo marcati con lo stesso fluorocromo hanno dimensioni diverse, essi possono essere miscelati e diluiti nella stessa provetta ed essere analizzati simultaneamente nello stesso capillare. È quindi stato stabilito il seguente schema per la combinazione e la diluizione dei diversi prodotti prima della corsa elettroforetica (tabella 12): 28
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Tabella 12: composizione della miscela dei prodotti di PCR per l'analisi dei frammenti Prodotti di amplificazione volume RET/PTC1 4 µl RET/PTC1 4 µl PAX8‐PGK1 2 µl H2O 20 µl 1 µl di questa miscela è stato posto in provette da 0,2 ml e dopo aver aggiunto 0.25 µl di marcatore Genescan™‐500 Liz Size Standard (Applied Biosystems) e 10 µl di formammide (Hi‐Di Formamide, Applied Biosystems), i campioni sono stati posti in un termociclatore a 95°C per 2 minuti: in questo modo è avvenuta la denaturazione dei frammenti di DNA (processo che determina la formazione di due filamenti separati, di cui uno marcato con il fluorocromo). A questo punto i campioni sono pronti per essere aliquotati nella piastra e analizzati con il sequenziatore automatizzato. Mediante l’uso dell’apposito programma Gene Mapper Software version 3 (Applied Biosystems), viene visualizzato l’elettroferogramma dei campioni analizzati. La migrazione contemporanea, nello stesso capillare, dei prodotti di PCR e del marker, consente di valutare precisamente le dimensioni dei prodotti di PCR e di visualizzarli contemporaneamente nello stesso elettroferogramma. La valutazione della presenza di un riarrangiamento di RET/PTC1 e RET/PTC3 può essere effettuata solo nel caso in cui, nel campione analizzato, siano presenti i prodotti di amplificazione dei geni di controllo PAX8 e PGK1, identificati da picchi verdi delle dimensioni di 122 bp e 224 bp rispettivamente. Se presente solo PAX8 la valutazione può essere effettuata perché i prodotti RET/PTC1 e RET/PTC3 hanno dimensioni molto vicine a quelle di PAX8 (136 bp e 106 bp rispettivamente), ma è importante considerare che l’assenza di PGK1 significa che l’RNA è degradato e questo potrebbe comportare dei risultati falsi negativi. Se presente solo PGK1, il campione non è valutabile in quanto la presenza di PAX8 è necessaria per indicare la presenza di tireociti. Se entrambi i geni di controllo sono assenti, il campione non è valutabile. In presenza di controlli positivi rilevati correttamente, le presenza di un riarrangiamento RET/PTC1 è rilevata con un picco blu a 130 bp circa, mentre la presenza di un riarrangiamento RET/PTC3 è rilevata con un picco nero a 100 bp circa. Al fine di confermare la presenza di riarrangiamenti RET/PTC1 e RET/PTC3, l’analisi è stata ripetuta riamplificando il cDNA per i campioni in cui è stata rilevata la presenza di un riarrangiamento. Le sequenze nucleotidiche dei costrutti plasmidici positivi e i campioni positivi per la presenza di un riarrangiamento sono state analizzate tramite 29
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 sequenziamento diretto secondo i protocolli descritti precedentemente utilizzando come primer di sequenza il primer reverse sia per RET/PTC1 che per RET/PTC3. 30
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 6. Risultati 6.1 Messa a punto delle reazioni di PCR per l’analisi delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3 Uno dei passaggi fondamentali per la messa a punto dell’analisi delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3 è stato quello di ricercare nella letteratura scientifica inerente tali analisi e specifica in particolar modo per le metodologie e le tecniche utilizzate, le sequenze e le porzioni dei geni RET, CCDC6 e NCOA4 coinvolte nel riarrangiamento e nella formazione dei geni di fusione RET/PTC1 e RET/PTC3. In particolare gli articoli scientifici sui quali ci siamo basati per la messa a punto della metodologia sono stati la pubblicazione di Nikiforov e colleghi del 2009 (Nikiforov et al, 2009), per la scelta dei primers, e quella di Ferraz e colleghi del 2011 (Ferraz et al, 2011) per la scelta della metodica d’analisi dei prodotti di PCR (analisi di frammenti tramite elettroforesi capillare). Dallo studio della letteratura scientifica è emerso che il gene di fusione RET/PTC1 è determinato dalla fusione dell’esone 1 del gene CCDC6 con la porzione TK del gene RET comprendente l’esone 12, mentre il gene di fusione RET/PTC3 è determinato dal riarrangiamento tra la porzione del gene NCOA4 compresa tra l’esone 1 e l’esone 10 e il dominio TK del gene RET. Sono state quindi valutate le posizioni di appaiamento dei primers scelti (vedi materiali e metodi, paragrafo 5.2.12), verificando che si legassero alle regioni fiancheggianti il punto di fusione del gene traslocato (Figure 4 e 5). Il passaggio successivo è stato quello di valutare i primers mettendo a punto una reazione di PCR. A questo scopo uno dei parametri principali da ottimizzare è la scelta della temperatura di ibridazione dei primers, la quale viene stabilita sperimentalmente mediante una PCR a gradiente di temperatura (vedi materiali e metodi, paragrafo 5.2.12). 31
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Figura 4: sequenza del gene di fusione RET/PTC1. In nero l’esone 1 di CCDC6; in rosso l’esone 12 del gene RET; evidenziate in giallo le posizioni delle sequenze in cui si appaiano i primers RET/PTC1 forward (Fw) e reverse (Rw). Figura 5: sequenza del gene di fusione RET/PTC3. In nero l’esone 10 di NCOA4; in rosso l’esone 12 del gene RET; evidenziate in azzurro le posizioni delle sequenze in cui si appaiano i primers RET/PTC3 forward (Fw) e reverse (Rw). Per mettere a punto le due reazioni di PCR per l’analisi delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3 sono stati utilizzati due costrutti plasmidici contenenti i due geni di fusione (vedi materiali e metodi, paragrafo 5.2.12). La temperatura di melting media per entrambe le coppie di primers 32
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 RET/PTC1 e RET/PTC3 è stata calcolata pari a 56°C e le 5 temperature di ibridazione scelte per eseguire le PCR a gradiente per testare le due coppie di primers sono elencate nella tabella 13: Tabella 13: temperature di ibridazione per le PCR a gradiente di temperatura (T1‐T2‐T3‐T4‐T5) per la messa a punto dell’analisi delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3 T1 T2 T3 T4 T5 51,9°C 54,2°C 56,6°C 59,0°C 61,0°C A seguito della PCR, i prodotti amplificati sono stati valutati tramite elettroforesi su gel di agarosio, per verificare a quali temperature ci fosse una buona qualità di prodotto PCR e l’assenza di bande aspecifiche. A tutte le temperature scelte per il gradiente (da 52°C a 61°C) e per entrambe le concentrazioni di partenza dei costrutti, la reazione di amplificazione dei costrutti RET/PTC1 e RET/PTC3 è risultata efficiente e specifica (Figure 6 e 7) e la lunghezza dei prodotti di amplificazione ottenuti è risultata uguale a quella attesa (circa 130 bp per RET/PTC1 e 100 bp per RET/PTC3). Figura 6: Elettroforesi su gel di agarosio del prodotto di PCR a gradiente di temperatura per l’analisi della traslocazione RET/PTC1. M: Marker, 1: costrutto plasmidico RET/PTC1 diluito a 10 ng/µl, 2: costrutto plasmidico RET/PTC1 diluito a 1 ng/µl, 3: controllo negativo. T1‐T5: temperature di ibriazione scelte (vedi Tabella 13). 33
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Figura 7: Elettroforesi su gel di agarosio del prodotto di PCR a gradiente di temperatura per l’analisi della traslocazione RET/PTC3. M: Marker, 1: costrutto plasmidico RET/PTC3 diluito a 10 ng/µl, 2: costrutto plasmidico RET/PTC3 diluito a 1 ng/µl, 3: controllo negativo. T1‐T5: le temperature di ibridazione scelte (vedi tabella 13). Tutti i campioni amplificati sono stati in seguito analizzati tramite elettroforesi capillare in un sequenziatore automatico per valutare il rilevamento dei prodotti amplificati tramite l’acquisizione del segnale di fluorescenza ottenuto dal fluorocromo coniugato ai primers forward di entrambe le coppie di primers. A tutte le temperature scelte per il gradiente e per entrambe le concentrazioni di partenza dei costrutti si sono ottenuti segnali ottimi e delle dimensioni attese per entrambi i costrutti RET/PTC1 e RET/PTC3 (Figure 8 e 9). 34
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Dimensione dell’amplificato (bp) Figura 8: esempio di elettroferogramma del prodotto di amplificazione del costrutto RET/PTC1 (picco blu a 130 bp) rilevabile grazie al fluorocromo 6‐FAM coniugato al primer forward di RET/PTC1. Dimensione dell’amplificato (bp) Figura 9: esempio di elettroferogramma del prodotto di amplificazione del costrutto RET/PTC3 (picco nero a 100 bp) rilevabile grazie al fluorocromo NED coniugato al primer forward di RET/PTC3. 35
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Dato che i risultati ottenuti per entrambe le PCR sono ottimi a tutte le temperature di ibridazione analizzate, è stata stabilita come temperatura di ibridazione sia per RET/PTC1 che per RET/PTC3 la temperatura intermedia del gradiente pari a 57°C. I prodotti di amplificazione dei costrutti RET/PTC1 e RET/PTC3 ottenuti a 57°C sono stati amplificati in una PCR di sequenza con i primers reverse (non fluorocromato) per visualizzare la sequenza del gene di fusione che si è mostrata uguale a quella attesa. 6.2 Validazione della metodica per l’analisi dei frammenti delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3, tramite RT‐PCR ed analisi dei frammenti La validazione dei protocolli per l’analisi delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3 è stata eseguita mediante l’analisi di campioni di RNA estratti da tessuti FFPE (sia tumorali che sani) di 17 pazienti con PTC, diagnosticato tra il 2010 e il 2012 presso l’ICP di Locarno. La casistica comprende 14 donne e 3 uomini, di età compresa tra i 20 e i 70 anni. In due casi (PC12 e PC18) l’RNA è stato estratto solo da tessuto tumorale perché il corrispondente tessuto sano non era disponibile. L’RNA estratto è stato retrotrascritto a cDNA secondo i protocolli già in uso presso l’ICP di Locarno. I cDNA ottenuti sono stati analizzati per RET/PTC1 e RET/PTC3 con i protocolli di PCR messi a punto sui costrutti plasmidici. Inoltre si sono effettuate, su ogni campione di cDNA, delle amplificazioni per i geni di controllo PAX8 e PGK1 per verificare la buona qualità dell’RNA di partenza e accertare che il corrispondente cDNA fosse amplificabile. In tutti i campioni analizzati il gene di controllo PAX8 si è amplificato, indicando quindi l’adeguatezza del materiale di partenza (presenza di tireociti) e assenza di degradazione dell’RNA in frammenti inferiori alle dimensioni dell’amplificato PAX8 (122 bp). In un solo caso (PC4) il gene di controllo PGK1 non si è amplificato, indicando quindi una parziale degradazione dell’RNA (Figura 11). Tuttavia, dal momento che i prodotti di PCR per le forme traslocate hanno dimensioni di 100‐130 bp, paragonabili quindi alle dimensioni del prodotto di amplificazione del gene PAX8, tutti i campioni analizzati possono essere valutati in maniera certa e attendibile per la presenza o meno della traslocazione. In tutti i campioni di tessuto normale analizzati, non si è rilevata la presenza di un riarrangiamento (Figura 10). L’analisi dei campioni tumorali ha rilevato la presenza di un riarrangiamento in due casi su 17 (11,8%). In particolare un caso è caratterizzato dalla presenza della traslocazione RET/PTC1 (PC6, Figura 12) e un caso è caratterizzato dalla presenza del riarrangiamento RET/PTC3 (PC16, Figura 13). 36
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Dimensione dell’amplificato (bp) Figura 10: esempio di elettroferogramma di un campione negativo per la presenza delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3. In verde i due picchi corrispondenti ai geni di controllo PAX8 (a 122 bp) e PGK1 (a 224 bp). Dimensione dell’amplificato (bp) Figura 11: esempio di elettroferogramma di un campione (PC4) negativo per la presenza della traslocazione RET/PTC in cui è avvenuta l’amplificazione del gene PAX8 ma non del gene PGK1, indice di una degradazione parziale dell’RNA. 37
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Dimensione dell’amplificato (bp) Figura 12: Esempio di un elettroferogramma di un campione (PC6) positivo per la traslocazione RET/PTC1 (picco blu a 130 bp). In verde i due picchi corrispondenti ai geni di controllo PAX8 (122 bp) e PGK1(224 bp). Dimensione dell’amplificato (bp) Figura 13: Esempio di un elettroferogramma di un campione (PC16) positivo per la traslocazione RET/PTC3 (picco nero a 100 bp). In verde i due picchi corrispondenti ai geni di controllo PAX8 (122 bp) e PGK1(224 bp). 38
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 6.3 Analisi dello stato mutazionale del gene BRAF Oltre all’analisi delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3 è stata eseguita l’analisi dello stato mutazionale dell’esone 15 del gene BRAF tramite sequenziamento diretto. Dei 17 pazienti analizzati, 10 casi su 17 (58,8%) hanno mostrato la mutazione V600E determinata dalla sostituzione di una timina con un’adenina (GTGGaG) nella seconda base del codone 600 che porta al cambiamento amminoacidico di una valina con acido glutammico (Figura 14b). Figura 14: a) elettroferogramma della sequenza WT del codone 600 del gene BRAF (esone 15) b) elettroferogramma della sequenza dell’esone 15 del gene BRAF recante la mutazione puntiforme TA che comporta il cambiamento nel codone GTGGaG e seguente generazione della mutazione V600E In un paziente (PC16) è stata rilevata la presenza sia della traslocazione RET/PTC3 sia della mutazione puntiforme del gene BRAF. Nello specifico, in questo caso, le presenze delle traslocazioni è stata confermata in 2 analisi effettuate su 4, mentre dalla valutazione dell’elettroferogramma il picco corrispondente alla mutazione di BRAF risultava particolarmente basso e riconfermato in due analisi distinte. 39
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Tabella 14: risultati delle analisi delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3 e dello stato mutazionale di BRAF per i pazienti con PTC. Legenda: T: tumore, N: sano, WT: wild‐type, NV: non valutabile caso PC1 N sesso Età/diagnosi RET/PTC1 e RET/PTC3 F 66 F 41 F 64 F 81 F 40 F 45 F 61 M 43 M 47 F 74 F 48 F 47 F 22 M 50 F 29 PC 20 N F 42 PC1 T PC2 N PC2 T PC3 N PC3 T PC4 N PC4 T PC5 N PC5 T PC6 N PC6 T PC9 N PC9 T PC10 N PC10 T PC12 N PC12 T PC13 N PC13 T PC14 N PC14 T PC16 N PC16 T PC17 N PC17 T PC18 N PC18 T PC19 N PC19 T BRAF assenza di traslocazione assenza di traslocazione WT assenza di traslocazione assenza di traslocazione WT assenza di traslocazione assenza di traslocazione V600E assenza di traslocazione assenza di traslocazione V600E assenza di traslocazione assenza di traslocazione V600E assenza di traslocazione presenza della traslocazione RET/PTC1 WT assenza di traslocazione assenza di traslocazione WT assenza di traslocazione assenza di traslocazione WT NV assenza di traslocazione V600E assenza di traslocazione assenza di traslocazione V600E assenza di traslocazione assenza di traslocazione V600E assenza di traslocazione presenza della traslocazione RET/PTC3 V600E assenza di traslocazione assenza di traslocazione V600E NV assenza di traslocazione V600E assenza di traslocazione assenza di traslocazione WT assenza di traslocazione 40
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno PC 20 T PC21 N PC21 T F 31 2012/2013 assenza di traslocazione WT assenza di traslocazione assenza di traslocazione V600E 41
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 7. Discussione I noduli della tiroide rappresentano la patologia endocrina più frequente la cui prevalenza può arrivare fino al 70% nella popolazione generale. Sebbene la maggior parte dei noduli tiroidei siano benigni è sempre necessario escluderne la malignità. Molto importante risulta quindi essere la diagnosi preoperatoria del nodulo tiorideo affinché il paziente possa ricevere tempestivamente la terapia corretta in caso di malignità o possa evitare di subire un intervento chirurgico non necessario nel caso in cui la lesione fosse benigna. Attualmente il metodo di esame preoperatorio d’elezione per la diagnosi di un nodulo tiroideo è l’aspirazione con ago sottile e la seguente valutazione citologica del campione, la quale, tuttavia, in circa il 30‐35% dei casi può dare un risultato non diagnostico (in caso di inadeguatezza del materiale) o un risultato di significato indeterminato di malignità (TIR3). Per cercare di risolvere tali problemi e migliorare quindi l’accuratezza della diagnosi citologica fatta su FNA si sono sviluppate nuove analisi di diagnostica molecolare che si basano sulla valutazione dello stato mutazionale di alcuni geni, le cui alterazioni sono caratteristiche e specifiche per un particolare tipo di tumore tiroideo. Il tumore tiroideo più diffuso è il carcinoma papillare (80% dei casi) caratterizzato, a livello molecolare, da due principali alterazioni genetiche: le mutazioni puntiformi del gene BRAF e i riarrangiamenti RET/PTC. Il secondo tipo di tumore tiroideo più frequente è il carcinoma follicolare (15% dei casi) caratterizzato, a livello molecolare, dalla traslocazione PAX8/PPARy e da mutazioni dei geni RAS. La valutazione dei marcatori molecolari sopra citati è raccomandata dalle linee guida dell’associazione americana sulla tiroide (2009 Revised ATA management Guidelines) per migliorare l’accuratezza diagnostica dei campioni citologici indeterminati. Ad eccezione dell’analisi della traslocazione RET/PTC, tutte le altre (mutazioni di BRAF, RAS e la traslocazione PAX8/PPARy) sono disponibili presso l’ICP di Locarno. Lo scopo del presente lavoro di diploma è stato quindi quello di mettere a punto una metodica per l’analisi delle traslocazioni RET/PTC, avvalendosi di dati pubblicati da lavori scientifici e protocolli standard presenti all’ICP. La ricerca dei riarrangiamenti RET/PTC prevede una prima fase di estrazione dell’RNA da materiale istologico o citologico adeguato, la retrotrascrizione dell’RNA a cDNA, un secondo passaggio di amplificazione del cDNA e una seguente analisi dei frammenti in un sequenziatore automatico. I protocolli di estrazione dell’RNA e retrotrascizione ed analisi dei frammenti erano già disponibili presso l’ICP, quindi la messa a punto ha riguardato principalmente la preparazione di due protocolli di PCR per la valutazione delle due forme più comuni di riarrangiamento RET/PTC1 e RET/PTC3. La sequenza 42
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 dei primers utilizzata è stata prelevata da articoli scientifici (Ferraz et al, 2011) presenti su PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) e le temperature di annealing sono state determinate sperimentalmente tramite PCR a gradiente di temperatura. Ciò è stato fatto poiché la temperatura di ibridazione dei primers è uno degli aspetti fondamentali di una reazione di PCR e, in alcuni casi, una temperatura non ottimale potrebbe inficiare l’analisi. La messa a punto dei protocolli di PCR è stata effettuata su dei costrutti plasmidici sintetici comprendenti le regioni genomiche coinvolte nei riarrangiamenti RET/PTC1 e RET/PTC3 poiché non erano a disposizione campioni di pazienti o linee cellulari recanti tali traslocazioni. L’amplificazione dei costrutti e la successiva analisi dei frammenti amplificati ha dato dei risultati ottimi a tutte le temperature testate e per entrambi i costrutti. Un passaggio fondamentale per analizzare i protocolli messi a punto è stato quello della loro validazione tramite l’analisi dell’RNA estratto da tessuti FFPE di pazienti affetti da PTC, valutando sia la componente tumorale che quella normale. Dal punto di vista tecnico i risultati ottenuti dalla valutazione dei geni di controllo PAX8 e PGK1 hanno evidenziato l’adeguatezza del materiale di partenza (ossia RNA estratto da tessuti FFPE) all’analisi di geni espressi dalla ghiandola tiroidea. Nello specifico, l’amplificazione in tutti i campioni del gene PAX8, gene espresso soltanto dalle cellule tiroidee, indica non solo la presenza di tireociti in tutti i campioni analizzati, ma anche la possibilità di amplificare geni specifici e costitutivi della ghiandola tiroidea e l’integrità dell’RNA estratto. La conferma della presenza di tireociti tramite l’analisi di PAX8 è un aspetto molto importante, non tanto per la valutazione dei campioni istologici (resezioni chirurgiche della tiroide), quanto per i campioni citologici ottenuti da FNA, in cui spesso le cellule tiroidee sono poche e frammiste a sangue e ad altri tipi di cellule. Per quanto riguarda PGK1, l’amplificazione è avvenuta con successo in 16 casi su 17 analizzati (sia campione sano che tumorale), indicando pertanto l’integrità dell’RNA analizzato e quindi la possibilità di applicare correttamente metodiche di valutazione dell’RNA anche partendo da tessuti FFPE in cui, data la fissazione in formalina, gli acidi nucleici, in particolare l’RNA, potrebbero essere fortemente degradati. Due casi su 17 (11,8%) analizzati sono risultati traslocati per RET/PTC (uno per RET/PTC1 e uno per RET/PTC3), risultato in linea con quanto riportato in letteratura (Nikiforov et al, 2011). In entrambi i campioni è stato rilevato il riarrangiamento solamente nel tessuto tumorale e non nel corrispondente tessuto sano, evidenziando e confermando quindi che tale traslocazione è tumore specifica. Per avere un quadro più completo delle alterazioni presenti nella casistica PTC utilizzata per la validazione, è stata effettuata l’analisi di BRAF sui tessuti tumorali di tutti i pazienti. La 43
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 mutazione di BRAF è stata trovata in 10 casi su 17 (58,8%), mostrando come tale mutazione sia l’anomalia genetica dominante nei PTC, la percentuale risulta piuttosto alta rispetto a quanto riportato mediamente dalla letteratura, ma la review di Xing (Xing, 2005) riporta vari studi che mostrano la possibilità di avere un range più alto. Un caso è risultato positivo sia per la presenza della mutazione BRAF sia per la presenza della traslocazione RET/PTC. Tale risultato non si accorda con la maggior parte dei testi presenti in letteratura che vorrebbe tali anomalie mutuamente esclusive. Tuttavia, uno studio condotto da Xiulong e colleghi (Xiulong et al, 2003) studia una possibile cooperazione tra la mutazione BRAF e le traslocazioni RET/PTC nella tumoreogenesi del PTC e anche un abstract presentato al National Cancer Research Institute‐Cancer Conference nel 2012 (Guerra et al, 2012), mostra la possibilità di una coesistenza della traslocazione RET/PTC e della mutazione di BRAF, soprattutto in presenza di metastasi. Tale considerazione può risultare rilevante in associazione al fatto che il campione analizzato è una metastasi linfonodale di un PTC. È bene inoltre tenere in considerazione che in tale campione, per quanto riguarda l’analisi di BRAF, il picco corrispondente alla mutazione, sebbene confermato in due analisi distinte, è risultato molto basso rispetto al picco WT, suggerendo quindi che non tutte le cellule tumorali analizzate erano caratterizzate dalla presenza di tale mutazione. Per quanto riguarda l’analisi RET/PTC, la traslocazione RET/PTC3 è stata identificata in due esperimenti condotti su 4. Questi risultati potrebbero far pensare ad una possibile eterogeneità tumorale , quindi alla presenza di diverse popolazioni cellulari, alcune recanti la mutazione di BRAF e altre la traslocazione RET/PTC3. Per confermare l’ipotesi e la possibilità di una coesistenza delle mutazioni di BRAF e delle traslocazioni di RET, sarebbe necessario analizzare una casistica più ampia di pazienti. Per quanto concerne la metodologia, la metodica per l’analisi della traslocazione RET/PTC è stata messa a punto e valutata con successo. È necessario tenere presente che l’analisi messa a punto identifica solo le due traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3 (presenti nel 60‐70% e nel 20‐30% dei casi traslocati rispettivamente, Zhu et al, 2006), ma in letteratura sono descritte più di 15 varianti diverse la cui identificazione richiederebbe la messa a punto di altrettante reazioni di PCR. Nel futuro sarà necessario indagare la sensibilità analitica della metodica tramite l’analisi di RNA positivi per la traslocazione diluiti a varie concentrazioni con campioni di RNA negativi per il riarrangiamento. Inoltre, dato che la metodica è stata validata su campioni istologici, ma sarà maggiormente utilizzata per la valutazione degli FNA citologici, sarà necessario nel futuro analizzare anche campioni citologici disponibili dei pazienti indagati per confermare la presenza, anche in questo tipo di materiale, delle alterazioni riscontrate a livello istologico. 44
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 8. Conclusione La messa a punto della metodica per l’analisi dei frammenti delle traslocazioni RET/PTC1 e RET/PTC3 è stata conclusa con successo e quindi i protocolli per la reazione di PCR sono ottimizzati e disponibili per l’utilizzo diagnostico. Non si sono verificati problemi né nel testare i primers, né nell’utilizzo di tutti i protocolli durante la validazione. Inoltre i risultati delle validazioni, dimostrano la specificità della metodica utilizzata. Previa validazione citologica, prevista in un prossimo futuro, la metodica va a completare il pannello di diagnosi molecolare del tumore tiroideo, disponibile presso l’ICP di Locarno. 45
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 9. Bibliografia Reviews 1) Nikiforov, Molecular Diagnostics of thyroid Tumors, 569‐577, Archives of Pathology and Laboratory Medicine, vol 135, 2011 2) Romei et al, RET/PTC translocations and clinic‐pathological features in human papillary thyroid carcinoma, art. 54, Frontiers in Endocrinology, 2012. 3) Chien et al, Molecular Biology of Thyroid Cancer, Endocrine Updates 30, Springer Science+Buisiness Media, 2012 4) Kondo et al, Pathogenic mechanism in thyroid follicular‐cell neoplasia, 292‐306, Nature Reviews Cancer, 2006 5) Nelva, Linee di indirizzo interne per la patologia nodulare tiroidea presso l’ASL BI, Gruppo Interdisciplinare Tiroide‐Epidemiologia della patologia nodulare tiroidea nel Biellese, 2011 6) Hunt, Molecular Mutations in Thyroid Carcinogenesis, 116‐127, Journal of Clinical Pathology, 2002 7) Santoro et al, RET/PTC activation in papillary thyroid carcinoma, 645‐653, European Journal of Endocrinolgy Prize Lecture, 2006 8) Xing, BRAF mutation in thyroid cancer, 245‐262, Endocrine‐Related Cancer, 2005 Articoli 9) Nikiforov et al, Molecular Testing for Mutations in Improving the Fine‐Needle Aspiration Diagnosis of Thyroid Nodules, 2092‐2098, The Journal of Clinical Endocrinology, 2009 10) Xing et al, BRAF mutation predicts a poorer clinical prognosis for papillary thyroid cancer, 6373‐6379, The Journal of Clinical Endocrinology, 2006 11) Algeciras‐Schimnich et al, Evaluation of the PAX8/PPARG Translocation in Follicular Thyroid Cancer with a 4‐Color Reverse‐Transcription PCR Assay and Automated High‐Resolution Fragment Analysis, 391‐398, Clinical Chemistry, 2010 12) Ferraz et al, Detection of PAX8/PPARG and RET/PTC Rearrangements are Feasible in Routine Air Dried Fine Needle Aspiration (FNA) Smears, 1‐22, Official Journal of the American Thyroid Association, 2011 13) Xiulong et al, High Prevalence of BRAF Gene Mutation in Papillary Thyroid Carcinomas and Thyroid Tumor Cell Lines, 4561‐4567, Cancer Research, 2003 46
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 14) Zhu et al, Prevalence of RET/PTC rearrangements in thyroid papillary carcinomas: effects of the detection methods and genetic heterogeneity, 3603‐3610, the Journal of Clinical Endocrinology,2006 15) Cooper et al, Revised American Thyroid Association Management Guidelines for Patients with Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer, 1167‐1214, The American Thyroid Association (ATA), 2009 Libri 16) Nikiforov, Recent Developpements in the Molecular biology of the Thyroid, 191‐209, Endocrine Pathology, 2003 Conferenze 17) Guerra et al, Simultaneous occurrence of BRAF mutation and RET/PTC rearrangement is frequent in papillary thyroid carcinoma, 1787,Endocrine Abstracts, 2012 Siti internet 18) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed 19) http://mcb.berkeley.edu/labs/krantz/tools/oligocalc.html 47
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 10.Ringraziamenti
Ringrazio vivamente tutto il personale del laboratorio di Patologia Molecolare dell’ICP di Locarno dove ho avuto l’opportunità di svolgere il mio lavoro di diploma. In particolar modo ringrazio il Dr. Milo Frattini e la Dr.ssa Francesca Molinari che mi hanno insegnato le basi del lavoro di laboratorio di biologia molecolare e mi hanno seguita durante tutte le fasi dello svolgimento del lavoro, dandomi consigli e aiutandomi nei momenti di difficoltà. 48
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 11.Allegati
11.1 Estrazione di DNA genomico da tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina (FFPE) Trattamento con proteinasi k ‐
Aggiungere 180 µl di tampone di lisi tissutale ATL del kit e 20 µl di Proteinasi k (0,02 mg/µl) (Sigma‐Aldrich, St.Louis, MO, USA) ai campioni di tessuto FFPE. ‐
Vortexare e sigillare con parafilm ‐
Incubare alla temperatura di 70°C su termoblocco in agitazione, per tutta la notte. A tale temperatura la paraffina si scioglie e l’enzima è attivo per la lisi cellulare. Trattamento di lisi cellulare ‐
Centrifugare le provette a 13000 g per 10 secondi e aggiungere 200 µl di tampone di lisi cellulare AL del kit, vortexare per 15 secondi e incubare a 70°C per 10 minuti, centrifugare alla velocità massima. ‐
Aggiungere 200 µl di etanolo al 100% (Sigma‐Aldrich), vortexare e centrifugare alla velocità massima. Purificazione del DNA su colonne QIAmp DNA Mini kit (Qiagen) ‐
Applicare la miscela ottenuta su una colonna QIAamp fornita dal kit con membrana costituita da una resina in silice. La resina, a scambio ionico, è carica positivamente e trattiene per interazione elettrostatica il materiale dotato di carica negativa, tra cui il DNA. Centrifugare a 8000 g per 1 minuto. ‐
Trasferire la colonna su una provetta vuota ed eliminare la provetta contenente il filtrato. Aggiungere 500 µl di tampone di lavaggio AW1, un tampone ad elevata concentrazione salina che permette l’eluizione delle molecole rimaste attaccate in modo aspecifico alla resina. Centrifugare a 8000 g per 1 minuto. ‐
Trasferire la colonna su una provetta vuota ed eliminare la provetta contenente il filtrato. Aggiungere 500 µl di tampone di lavaggio AW2, un tampone a concentrazione salina inferiore del precedente che permette la completa rimozione di proteine o altri contaminanti legati in modo aspecifico alla membrana. Centrifugare a 14000 g per 1 minuto. ‐
Trasferire la colonna su una provetta vuota ed eliminare la provetta contenente il filtrato. Centrifugare a 14000 g per 1 minuto. 49
Ambra Cattani ‐
TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Trasferire la colonna QIAmp in una Eppendorf sterile da 1,5 ml e aggiungere 50 µl di tampone di eluizione AE (10 mM Tris‐HCl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0) in modo da recuperare il DNA legato elettrostaticamente al supporto della colonna, nell’eluato. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti, centrifugare a 8000 g per 1 minuto. ‐
Al fine di aumentare la resa dell’estrazione, riprendere l’eluato centrifugato nel punto precedente e caricarlo di nuovo sulla colonna QIAmp. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti, centrifugare a 8000 g per 1 minuto. ‐
Eliminare la colonna QIAmp e tenere la provetta Eppendorf con il DNA estratto, che verrà quantificato con lo spettrofotometro. 11.2 Estrazione RNA da tessuto FFPE Per l’estrazione dell’RNA da tessuto FFPE è stato usato il kit RNAeasy MiniKit (Qiagen, Chatsworth, CA, USA). Prima di ogni operazione pulire le superfici, le pipette e i materiali d’uso, con RNAsi Zap (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ‐
Posizionare le sezioni in una provetta Eppendorf da 1.5 ml. ‐
Aggiungere 160 μl di Deparaffinization Solution, miscelare con il vortex per 10 secondi e centrifugare brevemente. ‐
Incubare per 3 minuti a 56°C. ‐
Aggiungere 150 μl di buffer PKD e miscelare con il vortex. ‐
Centrifugare per 1 minuto a 10000 rpm (11000 g). ‐
Aggiungere 10 μl di proteinasi K alla fase sottostante più chiara. Miscelare delicatamente utilizzando la pipetta. ‐
Incubare per 15 minuti a 56°C, poi per 15 minuti a 80°C. ‐
Trasferire la fase sottostante, più chiara in una nuova eppendorf da 2 ml. ‐
Incubare in ghiaccio per 3 minuti. Centrifugare per 15 minuti a 13500 rpm (20000 g). ‐
Trasferire il surnatante ad una nuova provetta Eppendorf prestando attenzione a non disgregare il pellet. ‐
Aggiungere 16 μl di DNase Booster Buffer e 10 μl di DNase I. Miscelare invertendo la provetta. Centrifugare brevemente. ‐
Incubare per 15 minuti a RT. ‐
Aggiungere 320 μl di Buffer RBC e miscelare il lisato accuratamente. 50
Ambra Cattani ‐
TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Aggiungere 720 μl di etanolo (100%) al campione e miscelare bene con la pipetta. NON centrifugare. ‐
Trasferire 700 μl del campione, inclusi i precipitati che possono essere formatisi, sulla colonna RNeasy MinElute precedentemente posizionata in un collection tube da 2 ml (fornito dal kit). Chiudere il tappo delicatamente e centrifugare per 15 secondi a 10000 rpm (8000g). Eliminare lo scarto. ‐
Ripetere il passaggio precedente in modo da caricare tutto il campione sulla colonna, utilizzando lo stesso collection tube. ‐
Aggiungere 500 μl di Buffer RPE alla colonna. Chiudere il tappo delicatamente e centrifugare per 15 secondi a 10000 rpm (8000g). Eliminare lo scarto. ‐
Aggiungere 500 μl di Buffer RPE alla colonna. Chiudere il tappo delicatamente e centrifugare per 2 minuti a 10000 rpm (8000g) per lavare la membrana della colonna. Eliminare lo scarto. NB: fare attenzione che, rimuovendo la colonna, questa non venga a contatto con lo scarto. ‐
Posizionare la colonna in un nuovo collection tube da 2 ml. Aprire il coperchio della colonna e centrifugare alla max velocità per 5 minuti. Eliminare lo scarto. ‐
Porre la colonna in un nuovo collection tube da 1.5 ml (fornito dal kit). Aggiungere 20 μl di acqua RNase free direttamente sulla membrana all’interno della colonna. Chiudere delicatamente il tappo e centrifugare per 1 minuto alla max velocità per eluire l’RNA. NB: il volume di acqua RNase free può variare tra 14 e 30 μl. Un minor volume corrisponde ad una maggiore concentrazione dell’RNA totale ma ad una minore quantità di prodotto. ‐
Quantificare l’RNA estratto con lo spettrofotometro nanodrop. 11.3 Quantificazione degli acidi nucleici La quantificazione degli acidi nucleici viene effettuata utilizzando un apposito spettrofotometro (Nanodrop 1000) in grado di utilizzare solo 2 µl di soluzione. Il Nanodrop è uno spettrofotometro UV‐sensibile che rileva la tensione superficiale che piccoli volumi di soluzioni esercitano quando sono collocati tra due superfici vicine per misurare la densità ottica del campione. Prima di iniziare a quantificare, lo strumento viene tarato analizzando un bianco che, nel caso di quantificazione del DNA genomico si tratta del tampone di eluizione AE, in cui sono stati eluiti i DNA genomici, mentre nel caso dell’RNA si tratta di acqua RNAase free. A seguito della taratura dell’apparecchio, vengono pipettatati 2 µl di campione sull’apposito sito di lettura in modo da creare una colonna di 51
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 liquido a diretto contatto con le due fibre ottiche, permettendo una rapida analisi del campione. Lo spettrofotometro Nanodrop è in grado di eseguire contemporaneamente letture a diverse lunghezze d’onda, perciò è possibile determinare, oltre che il valore d’estinzione specifico degli acidi nucleici ad una lunghezza d’onda di 260 nm, anche il loro livello di purezza. Una soluzione di acidi nucleici pura alla lunghezza d’onda di 230 nm (che corrisponde al picco di assorbimento degli zuccheri e degli alcoli come xilolo e etanolo) e alla lunghezza d’onda di 280 nm (che corrisponde al picco di assorbimento delle proteine) ha un valore di assorbanza pari alla metà di quello misurato a 260 nm. L’apparecchio, oltre che a fornire la concentrazione degli acidi nucleici, calcola automaticamente i rapporti 260/230 nm e 260/280 nm, quando questi sono inferiori a 1,8‐2 significa che vi è presenza di contaminanti oltre gli acidi nucleici. A seguito della quantificazione degli acidi nucleici si provvede alla conservazione del materiale: la soluzione madre di DNA è stata conservata a ‐20°C, mentre le diluizioni di lavoro effettuate (ottenendo una concentrazione finale di 25 ng/µl), sono state conservate a 4°C. L’RNA è stato retro‐trascritto in giornata, diluendolo in modo da ottenere una concentrazione finale di cDNA pari a 25 ng/µl, conservato a una temperatura di ‐20°C, mentre l’RNA non retro‐trascritto è stato messo a ‐80°C. 11.4 Costituzione della miscela di reazione per la PCR ‐
Tampone di reazione PCR buffer II 10x (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) composto da Tris‐HCl 100 mM, pH 8,3 e da KCl 500 mM, che permette di garantire il pH ottimale per l’attivazione della Taq polimerasi alle varie temperature e di favorire l’ibridazione tra primer e templato. ‐
Cloruro di magnesio (25 mM MgCl2, Applied Biosystems). La cui concentrazione influisce sulla specificità e sull’efficienza di reazione. ‐
Enzima Taq Gold 5 U/µl (Applied Biosystems), enzima DNA polimerasi stabile ad alte temperature. ‐
Miscela equimolare di deossinucleotiditrifosfati (dNTPs; Amersham, Buckinghamshire, UK) 10 mM che vengono incorporati dalla Taq polimerasi per sintetizzare un nuovo filamento, composta da: o Deossiadenintrifosfato (dATP), o Deossitiminatrifosfato (dTTP), o Deossicitosinatrifosfato (dCTP), o Deossiguaninatrifosfato (dGTP) 52
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TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Deossiuridinatrifosfato (dUTP) 10 mM (Amersham), nucleotide che permette di evitare le contaminazioni di templati amplificati in precedenza. Questo nucleotide è infatti incorporato nel prodotto PCR e viene riconosciuto dall’enzima UNG che taglia il DNA amplificato in corrispondenza di tale nucleotide. ‐
Primers 10 µM (Invitrogen), sono corti segmenti di DNA (senso‐forward e antisenso reverse) che ibridano il DNA stampo a fianco delle regioni di interesse e permettono l’avvio della reazione di polimerizzazione del nuovo filamento di DNA da parte della DNA polimerasi, poiché fungono da punto d’innesco della reazione. ‐
Acqua sterile. 11.5 Elettroforesi su gel di agarosio Preparazione del gel di agarosio 1,8% ‐
Pesare 1,8 grammi di agarosio (PeqGOLD Universal Agarose; Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germania) in una beuta. ‐
Portare a volume a 100 ml con tampone TBE 1X, ottenuto per diluizione del Tris‐Borato‐
EDTA 10X (Sigma‐Aldrich) ‐
Sciogliere la polvere di agarosio in modo omogeneo utilizzando un forno a microonde a 200 W per 10‐12 minuti. ‐
Aggiungere al gel 0,2 µl GelRed (Biotium’s GelRed Nucleic Acid Gel Stain; Biotium, Hayward, CA, USA). Il colorante si intercala nelle molecule di DNA durante la corsa elettroforetica. ‐
Quando la soluzione raggiunge circa la temperatura di 60°C versarla nel supporto della cella elettroforetica dopo aver inserito un pettine che permette di ottenere i pozzetti nel gel in cui caricare i campioni. ‐
Lasciare raffreddare il gel a temperatura ambiente, poi estrarre il pettine e posare il gel nella cella elettroforetica, immergendolo nel tampone TBE 1X Preparazione dei campioni e corsa elettroforetica ‐
Preparazione del marker: miscelare 1 µl di DNA marker PeqGOLD 50 bp DNA‐Leiter (0,5 µg totali) (Biotechnologie GmbH) con 9 µl di tampone 1X e 2 µl di una soluzione di Blu di Bromofenolo (BBF), precedentemente preparata sciogliendo 0,25 grammi di BBF polvere (Sigma‐Aldrich) che mantiene sotto controllo la migrazione dei campioni e 40 grammi di saccarosio (Merck, Whitehouse Station, Nj, USA) che addensa i campioni nei pozzetti in 100 ml di acqua sterile. 53
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 ‐
Preparazione dei campioni: miscelare 5 µl del prodotto di PCR con 2 µl della soluzione BBF ‐
Caricare il marker e i campioni nei pozzetti del gel di agarosio e avviare a corsa elettroforetica a 100 V costanti, per circa 35‐40 minuti. Visualizzazione dei risultati ‐
Porre il gel nel transilluminatore (Image Master, Pharmacia, Stoccolma, Svezia). La radiazione UV del transilluminatore eccita il colorante GelRed intercalato nella doppia elica di DNA che riemette luce nella lunghezza d’onda nel visibile, permettendo di riconoscere le bande (composte da DNA amplificato o frammenti di marker) che appaiono fluorescenti su sfondo scuro. Questo permette di vedere se l’amplificazione del gene d’interesse sia riuscita e verificare che il controllo negativo sia relamente negativo e che il controllo positivo si sia amplificato come i campioni. Dopodiché si può procedere con le analisi successive. 11.6 Purificazione del DNA amplificato È stato utilizzato il kit MSB®SPIN PCRapace (STRATEC Molecular, Gmbh, Berlino, Germania), con i seguenti passaggi condotti a temperatura ambiente: ‐
Aggiungere 200 µl di Binding Buffer al campione, miscelando bene con la pipetta. ‐
Trasferire completamente il prodotto PCR con il Binding Buffer sulla colonna provvista di spin filter. ‐
Centrifugare i campioni a 13200 g per 5 minuti. ‐
Eliminare il fltrato e porre il filtro (Spin Filter) in un nuovo Collection Tube da 1,5 ml. ‐
Aggiungere 20 µl di Eluition Buffer nella colonna e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente. ‐
Centrifugare i campioni a 9300 g per 1 minuto ‐
Eliminare la colonna e il DNA eluato è pronto per l’uso nella provetta. 11.7 PCR di sequenza (cyclesequencing) Preparare una miscela costituita da: ‐
Primer forward o reverse. I primers sono gli stessi utilizzati nella reazione di amplificazione del DNA genomico. ‐
Sequencing Buffer: Big Dye Terminator v1.1/3.1 Sequencing buffer 5X (Applied Biosystems) 54
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TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 Miscela di terminatori, deossinucleotidi e Taq Polmerasi: ABI PRISM Big Dye Terminator v1.1 Ready Reaction mix (Applied Biosystems). Questo componente viene aggiunto per ultimo alla miscela di reazione per ridurre il tempo di esposizione dei terminatori alla luce, data la loro fotosensibilità. ‐
Acqua sterile Aliquotare 0,4 µl di DNA purificato in provette da 0,2 ml e aggiungere 9,6 µl della miscela di reazione descritta nella tabella 15. Inserire le provette nel termociclatore e dare avvio al programma. Il protocollo di amplificazione della PCR di sequenza è sempre lo stesso, riportato nella a tabella 11. Tabella 15: composizione della miscela di reazione per la reazione di PCR di sequenza Conc. iniziale Quantità/Conc. finale Volume/campione
DNA purificato 0,4 µl Sequ. Buffer 5X 0,75 X 1,5 µl TRR mix 2,5X 0,25 X 1,0 µl Primer Fw o Rw 10 µM 0,5 µM 0,5 µl Acqua sterile 6,6 µl Tabella 16: protocollo di amplificazione delle PCR di sequenza Temperature Tempo di reazione Denaturazione iniziale 96°C 1’ Denaturazione 96°C 10’ Ibridazione 50°C 5’ Estensione 60°C 4’ Fine PCR 4°C ∞ 25 cicli
11.8 Purificazione del DNA dopo PCR di sequenza Il protocollo di purificazione del DNA dopo la PCR di sequenza prevede l’utilizzo del G50 Dye Terminator Removal kit (RBC Bioscience, New Taipei City, Taiwan), con i seguenti passaggi: ‐
Risopendere la resina con 300 µl di acqua sterile picchiettando sulla parte superiore della colonna fornita dal kit. Staccare il tappo rosso nella parte inferiore della provetta. 55
Ambra Cattani TAB3 SSMT Locarno 2012/2013 ‐
Centrifugare le colonne a 3000 g per 2 minuti. ‐
Eliminare il tubo posto sotto la colonna, contenente l’eccesso di acqua e spostare la colonna su una nuova Eppendorf da 1,5 ml. ‐
Caricare il prodotto della PCR al centro della colonna, senza toccare la resina con il puntale. ‐
Centrifugare i campioni a 3000 g per 3 minuti. Fare attenzione a mantenere la stessa posizione della provetta, in modo che la resina si sposti uniformemente nella stessa direzione. ‐
Eliminare le colonne e porre le provette nella centrifuga Speedvac (Eppendorf, Amburgo, Germania) ad una temperatura di 30°C per un tempo di 23 minuti al buio. ‐
Risospendere i pellet in formamide e caricare il sequenziatore. 56