UNIVERSITY OF ROME “FORO ITALICO”
DOCTORAL PROGRAM IN
“Biomedical and Methodological Aspects
of Preventive and Adaptive Physical Activity”
Cicle XXIII
DOCTORAL THESIS TITLE
“DNA DAMAGE, TELOMERE SHORTENING
AND OXIDATIVE STRESS:
ROLE OF PHYSICAL ACTIVITY “
Settore Scientifico Disciplinare BIOLOGIA APPLICATA-BIO-13
Project Coordinator
Prof. Paolo Parisi
___________________________
(signature)
Tutor
Prof. Daniela Caporossi
___________________________
(signature)
Ph.D. Student
Dr. Fiorenza Magi
______________________________
(signature)
ABSTRACT (English)
DNA DAMAGE, TELOMERE SHORTENING AND OXIDATIVE
STRESS:
ROLE OF PHYSICAL ACTIVITY
It is now widely recognized that a sedentary lifestyle is capable of
promoting detrimental consequences to human health. A sedentary lifestyle
increases the risk to aging-related diseases and premature death. Thus,
engagement in regular physical activity and increased physical fitness is now
recommended on a daily basis to help preserve health and promote longevity.
Studies support the potential beneficial role of moderate and consistent
physical activity regularly performed in preventing and contrasting
physiological age-related oxidative damage in muscle as well as in other
tissues. Similarly, many data document the substantial role of physical
activity in the prevention and treatment of some pathological condition, such
as diabetes. With respect to the molecular mechanisms implied, at present
relatively few studies investigated the hypothesis that physical activity level
could be related to telomere biology.
Oxidative stress accelerates telomere shortening: the rate of telomere
shortening, and therefore telomere length, are highly dependent on
oxidatively induced strand breaks in telomeric DNA sequences and on
cellular oxidant balance and it was shown that lymphocyte DNA from
subjects with type 2 diabetes is characterized by increased susceptibility to
oxidative damage. As telomeres are especially sensitive to oxidative stress,
exercise might also influences telomere shortening through affecting the
balance between oxidative stress and antioxidants. The rational of this
hypothesis implies that regular exercise, trough the increase of Reactive
Oxygen Species (ROS) production at “adaptive concentration”, up-regulates
antioxidant defences as well as the expression of key stress response genes,
thus protecting telomeres and proteins by oxidative damage related to
physiological aging and/or pathological conditions.
The aim of this research was to verify the potential role of physical
activity on improving the intracellular response toward oxidative-stress
sensitivity by reducing DNA damage and maintaining telomere length. This
relationship was evaluated in two different studies, focusing either on skeletal
semitendinosus muscle of healthy male subjects and in lymphocytes of type 2
diabetic patients.
In the first study, the relationship between telomere length, 4hydroxynonenal (4-HNE) adducts, stress protein response and aging was
investigated in human skeletal semitendinosus muscle, considering their
possible modulation by different degree of physical activity. 29
semitendinosus muscle biopsies from healthy male adults (18-60 yrs) were
analyzed for telomere length (TRF analysis), HNE adducts, Heat Shock
Proteins HSPs (HSP27, αB-crystallin and HSP90) and catalase (CAT)
activity content. Physical activity level (Sedentary, Recreational,
Competitive) was classified according to Tegner scale, which mainly refers to
the knee mechanical stress. TRF analysis showed that telomere shortening is
positively associated with aging (p=0.016), but no correlation was identified
with respect to sport activity level. 4-HNE, HSPs levels and CAT activity
showed individual variability not correlated neither with age nor with sport
activity level, even if HNE damage seems to increase slightly with age.
Nevertheless, HNE damage, which results from lipid peroxidation, was
related to telomere shortening (p=0.008), given that subjects with higher
telomere shortening showed a clear tendency to accumulate 4-HNE adducts,
whereas subjects with lower telomere shortening showed an opposite
correlation. This results confirmed that also oxidative stress, as well as
physiological aging, is involved in telomere shortening.
In the second study we analyzed the effect of long-term (from at least
1 year) moderate physical training (three times/week of 30’ moderate aerobic
activity and 30’ callisthenic gym) on spontaneous and H2O2-induced
oxidative damage in lymphocytes from 12 males (61.7±3.7 yrs), 6 trained and
6 sedentary type 2 diabetic patients (T2DM) in comparison with a control
group of 12 non-diabetic males (62.1±4.3 yrs), 6 sedentary and 6 trained. Our
results confirmed the hypothesis that telomeric DNA is particularly prone to
H2O2-induced oxidative damage in lymphocytes, and also suggested that
telomere shortening might represent a target of T2DM-related oxidative
stress. As expected, diabetic patients showed an increased telomere
shortening, both spontaneously (p<0.05-p<0.01) and after H2O2-induced
oxidative damage (p<0,001). This last observation is confirmed also by the
analysis of DNA breaks (COMET assay) and apoptosis. As regard to the role
of physical activity, our data suggest that long-term moderate training can
reduce oxidative DNA damage, particularly that of the high sensitive
telomeric DNA, reducing the rate of telomere shortening both in untreated
and, in some extent, in H2O2-treated lymphocytes from diabetic patients.
Moreover, we demonstrated that long-term moderate training can also
decrease the spontaneous DNA damage (p<0.05) and the H2O2-induction of
apoptosis (p<0.05-p<0.01), in lymphocytes from diabetic patients, and that
would protect against endogenous and possibly exogenous oxidative damage
probably through the modulation of expression of some genes involved in
oxidative stress response.
As a whole, this research project, demonstrated that telomeres are a
sensible target of oxidative DNA damage, since it was found an inverse
relationship between telomere length and oxidative stress ex vivo, through
HNE damage in semitendinosus muscle, as well as in vitro in lymphocytes
from type 2 diabetic patients treated with hydrogen peroxide. However,
further studies are needed to investigate the cellular and molecular
mechanisms implied in oxidative stress dependent telomere shortening.
Again, the first study on semitendinosus muscle demonstratred also the
correlation between telomere length and aging in adult healthy subjects,
while the second study on lymphocytes from T2DM patients provided
evidence that diabetic patients were particularly susceptible to oxidative
damage than healthy subjects. As respect to the role of training, the lack of
correlation between physical activity level evaluated by Tegner scale and the
age-related telomere shortening, the degree of lipid peroxidation as well as
the baseline HSP levels and Catalase enzyme activity on semitendinosus
muscle, may be in part related to the heterogeneity of sport activity
considered by Tegner scale, not always correlated to a modulation of the
redox state. On the other hand, being oxidative stress commonly associated
with type 2 diabetes, our data on lymphocytes suggested that long-term
moderate training may serve to lessen the risk of initiation and progression of
type 2 diabetes reducing the sensitivity to oxidative damage and/or improving
endogenous oxidative stress response. We can conclude that to practice
moderate and consistent physical activity may be the right strategy to prevent,
among others, the negative effect of oxidative stress that occurs in diabetes.
.
ABSTRACT (Italiano)
DANNO AL DNA, LUNGHEZZA DEI TELOMERI E STRESS
OSSIDATIVO:
RUOLO DELL’ATTIVITA’ FISICA
E’ ormai ampiamente riconosciuto che uno stile di vita sedentario è in
grado di promuovere conseguenze dannose per la salute dell’uomo. Condurre
una vita sedentaria aumenta il rischio di contrarre malattie legate
all’invecchiamento e di una morte prematura. Pertanto, la pratica di
un’attività fisica regolare e costante viene attualmente raccomandata
quotidianamente per aiutare a preservare la salute e a promuovere la
longevità. Numerosi studi supportano il ruolo potenzialmente benefico di
un’attività fisica moderata e costante, praticata regolarmente, nel prevenire e
contrastare il danno ossidativo fisiologicamente legato all’invecchiamento
che si manifesta nel muscolo così come in vari altri tessuti. Analogamente,
molti dati presenti in letteratura documentano il ruolo sostanziale dell’attività
fisica nella prevenzione e nel trattamento di alcune malattie, tra le quali il
diabete. Rispetto ai meccanismi molecolari coinvolti, attualmente esistono
solo pochi studi che hanno investigato l’ipotesi che il livello di attività fisica
praticato possa essere correlato alla biologia del telomero.
Numerose evidenze indicano che lo stress ossidativo è in grado di
accelerare l’accorciamento dei telomeri: il tasso di accorciamento dei
telomeri, e dunque la loro lunghezza, dipende in larga misura da rotture nel
DNA telomerico indotte da stress ossidativo e dall’equilibrio redox
intracellulare tra pro-ossidanti e ed anti-ossidanti, ed è stato dimostrato che il
DNA dei linfociti di soggetti affetti da diabete di tipo 2 è caratterizzato da un
aumentata sensibilità al danno ossidativo. Poiché i telomeri rappresentano un
bersaglio sensibile allo stress ossidativo, la pratica dell’esercizio fisico
potrebbe a sua volta influenzare la lunghezza dei telomeri andando ad
incidere sull’equilibrio redox tra stress ossidativo e risposta antiossidante. Il
razionale di questa ipotesi si basa sul fatto che la pratica regolare
dell’esercizio fisico, inducendo la produzione di Specie Reattive
dell’ossigeno (ROS) ad una “concentrazione adattativa”, sia in grado di
migliorare la risposta cellulare dipendente dallo stress ossidativo, upregolando i sistemi antiossidanti così come i meccanismi di riparo del DNA,
proteggendo così i telomeri e le proteine dal danno ossidativo legato
all’invecchiamento fisiologico e/o a condizioni patologiche.
Lo scopo di questo studio è stato verificare il potenziale ruolo
dell’attività fisica nel migliorare la risposta intracellulare allo stress
ossidativo attraverso la riduzione del danno al DNA e il mantenimento della
lunghezza dei telomeri. Questa relazione è stata valutata attraverso due studi
differenti condotti sul muscolo semitendinoso di soggetti maschi sani e nei
linfociti di soggetti affetti da diabete di tipo 2.
Nel primo studio è stata analizzata la relazione tra la lunghezza dei
telomeri, la formazione di addotti di 4-idrossinonenale (4-HNE), la risposta
da proteine da stress e l’invecchiamento nel muscolo semitendinoso umano,
ed è stata valutata la possibile modulazione da parte di differenti livelli di
attività fisica. 29 biopsie di muscolo semitendinoso ottenute da soggetti
maschi sani (di età compresa tra i 18 e i 60 anni) sono state analizzate per la
lunghezza dei telomeri (analisi TRF), la formazione di addotti di 4-HNE, il
contenuto delle Heat Shock Proteins HSPs (HSP27 and αB-crystallin,
HSP90) e l’attività dell’enzima catalasi (CAT). I livelli di attività fisica
(Sedentari, Ricreazionali e Competitivi) sono stati classificati scala
utilizzando la scala Tegner, che suddivide le attività sportive sulla base dello
stress meccanico che esse esercitano sul ginocchio. L’analisi TRF ha
evidenziato che l’accorciamento dei telomeri è positivamente associato con
l’invecchiamento (p=0.016), ma nessuna correlazione è stata individuata tra
lunghezza dei telomeri ed i livelli di attività fisica. Il contenuto di addotti di
4-HNE, di HSPs e l’attività della CAT mostravano una variabilità interindividuale non correlata né con l’età né con i diversi livelli di attività fisica,
nonostante il danno da HNE mostrasse una lieve tendenza a crescere con
l’età. Il danno da HNE, derivante da perossidazione lipidica, risultava essere
correlato all’accorciamento dei telomeri (p=0.008), in quanto i soggetti con il
maggiore accorciamento telomerico mostravano una chiara tendenza ad
accumulare addotti di 4-HNE, mentre i soggetti con minore accorciamento
telomerico mostravano correlazione opposta. Questo risultato ha confermato
che anche lo stress ossidativo, oltre all’invecchiamento fisiologico, è
coinvolto nell’accorciamento dei telomeri.
Nel secondo studio sono stati analizzati gli effetti di un protocollo di
allenamento moderato (3 volte a settimana, 30 minuti di attività aerobica
moderata e 30 minuti di ginnastica calistenica) praticato per lungo termine
(almeno un anno) sul danno spontaneo e indotto da perossido di idrogeno
(H2O2) in linfociti di 12 soggetti maschi (61.7±3.7 anni) affettio da diabete di
tipo 2, 6 sedentari e 6 allenati in confronto con un gruppo di controllo
costituito da 12 soggetti maschi sani (62.1±4.3 anni), 6 sedentari e 6 allenati.
I risultati ottenuti confermavano l’ipotesi che il DNA telomerico è
particolarmente sensibile al danno ossidativo indotto da H2O2 nei linfociti e
suggerivano anche che l’accorciamento dei telomeri potrebbe rappresentare
un bersaglio dello stress ossidativo correlato al diabete di tipo 2. I soggetti
diabetici mostravano un maggiore accorciamento dei telomeri, sia spontaneo
(p<0.05-p<0.01) che dopo danno ossidativo indotto da H2O2 (p<0,001).
Quest’ultima osservazione è stata confermata anche dall’analisi del danno al
DNA tramite COMET assay e dall’analisi dell’apoptosi. Riguardo al ruolo
dell’attività fisica, questo secondo studio ha evidenziato che l’allenamento
moderato praticato per lungo termine era in grado di ridurre il danno
ossidativo al DNA, in particolare quello delle sensibili sequenze di DNA
telomeriche, riducendo il tasso di accorciamento dei telomeri nei linfociti di
soggetti diabetici non trattati e trattati con H2O2. Inoltre, è stato dimostrato
anche che l’allenamento moderato praticato per lungo termine è in grado di
ridurre nei linfociti di soggetti diabetici il danno spontaneo al DNA (p<0.05)
e il tasso di apoptosi indotta da H2O2 (p<0.05-p<0.01), e che potrebbe
proteggere dal danno ossidativo endogeno ed esogeno probabilmente
attraverso la modulazione dell’espressione di alcuni geni coinvolti nella
risposta allo stress ossidativo.
Complessivamente questo progetto di ricerca ha dimostrato che i
telomeri rappresentano un bersaglio sensibile del danno ossidativo, dal
momento che è stata identificata una relazione inversa tra la lunghezza dei
telomeri e lo stress ossidativo ex vivo , attraverso il danno da HNE nel
muscolo semitendinoso, e in vitro, nei linfociti di soggetti affetti da diabete di
tipo 2 trattati con perossido di idrogeno. Ulteriori studi si rendono comunque
necessari per chiarire i meccanismi molecolari e cellulari coinvolti
nell’accorciamento dei telomeri dipendente da stress ossidativo. Inoltre, lo
studio sul muscolo semitendinoso ha dimostrato anc he la correlazione tra la
lunghezza dei telomeri e l’invecchiamento in individui sani, mentre lo studio
sui diabetici ha evidenziato che i soggetti diabetici risultano maggiormente
sensibili al danno ossidativo rispetto ai soggetti sani. Riguardo al ruolo
dell’allenamento, la mancanza di correlazione tra i livelli di attività fisica
valutati tramite scala Tegner e la lunghezza dei telomeri legata all’età, il
grado di perossidazione lipidica, il contenuto di HSPs e l’attività della
catalasi nel muscolo semitendinoso, è in parte dovuta all’eterogeneità delle
attività sportive considerate dalla scala Tegner, non sempre legata ad una
modulazione dello stato redox. D’altra parte invece, considerando che lo
stress ossidativo è un fattore associato al diabete di tipo 2, i dati raccolti sui
linfociti suggeriscono che l’allenamento moderato praticato per lungo termine
può ridurre il rischio dell’insorgenza e della progressione del diabete di tipo 2
attraverso la riduzione della sensibilità e/o migliorando la risposta endogena
allo stress ossidativo. Si può dunque concludere che la pratica di un’attività
fisica moderata e costante potrebbe essere, tra le altre, una corretta strategia
atta a prevenire gli effetti nocivi dello stress ossidativo intracellulare nel
diabete.