Kit per test APPY1™ - Italiano
Uso previsto
Il test APPY1 è un test diagnostico in vitro a indice multivariato (IVDMIA) utilizzato come ausilio nell’identificazione
dei pazienti a basso rischio di appendicite acuta. Il test APPY1 misura le concentrazioni dell’eterocomplesso di
proteine mieloide-correlate MRP 8/14 (calprotectina) e della proteina C reattiva (CRP) nel plasma EDTA mediante
saggio immunologico a flusso laterale. Le concentrazioni quantitative di MRP 8/14 e CRP, in aggiunta a un conteggio
determinato indipendente dei globuli bianchi (WBC), vengono quindi calcolate mediante un algoritmo proprietario
pre-programmato per generare un risultato del test APPY1.
Indicazioni per l’uso
Il test APPY1 è indicato per l’uso in pazienti pediatrici, adolescenti e giovani, di età compresa tra 2 e 20 anni, con dolori
addominali e altri segni e sintomi fisici e clinici indicativi di appendicite acuta.
Esclusivamente per uso professionale
Sommario e spiegazione
La diagnosi di pazienti che presentano dolore addominale rimane una delle problematiche più comuni e difficili nella
medicina di emergenza. Oltre 22,2 milioni di pazienti si sono recati presso i reparti di pronto soccorso degli ospedali
di Europa e Stati Uniti nel 2010 per dolore addominale come problema principale.1,2
L’appendicite registra la massima incidenza nei pazienti pediatrici, adolescenti e giovani di età compresa tra 10 e
19 anni,3 ma la diagnosi di appendicite in questi pazienti rimane difficile poiché essi presentano un’ampia varietà di
caratteristiche cliniche atipiche.4 Fino al 50% di neonati e bambini con appendicite acuta (AA) possono presentare
segni e sintomi atipici5 in grado di ritardare la diagnosi e portare a complicazioni potenzialmente fatali quali appendice
perforata, ascesso addominale, peritonite, sepsi e shock. Quindi è importante identificare strumenti diagnostici che
facilitino una diagnosi obiettiva, tempestiva e accurata e la stratificazione del rischio di pazienti con sospetta AA.
Attualmente, la capacità di diagnosticare con precisione l’appendicite è limitata all’acquisizione di segni e sintomi
fisici e clinici e a varie modalità diagnostiche. Sono stati sviluppati numerosi strumenti di previsione clinica che
fanno uso di sintomi classici quali data point come ausilio nella diagnosi dell’appendicite. Le prestazioni di questi
sistemi di punteggio non sono coerenti e sono altamente variabili.5,6 Inoltre, tali sistemi non vengono utilizzati di
routine dai reparti di pronto soccorso.7 Viene eseguito di routine il conteggio dei globuli bianchi, che si è tuttavia
dimostrato di limitata utilità quale singolo marker, anche quando combinato con segni e sintomi clinici di AA.8 In
funzione della valutazione del rischio iniziale del paziente del svolta dal medico, possono essere ordinati imaging
diagnostico, incluse l’ecografia addominale (US) o la tomografia computerizzata (TC) con o senza contrasto, nei casi
in cui la presentazione clinica è equivoca e sono necessarie più informazioni. Mentre la TC è accurata nella diagnosi
dell’appendicite acuta quando l’appendice possa essere visualizzata con chiarezza, essa comporta un rischio
significativo dovuto all’aumentata esposizione alle radiazioni ionizzanti, accrescendo pertanto la dipendenza da test
meno dannosi.9-12 Report recenti hanno mostrato che l’uso della TC nei pazienti in età pediatrica ha raggiunto una
stabilizzazione; tuttavia, la preoccupazione correlata all’esposizione alla TC, specialmente nei pazienti giovani, non è
diminuita.12,13
La combinazione di tre biomarker nel test APPY1, anziché di un singolo marker, aumenta la capacità di identificare
pazienti a basso rischio.7 Il test APPY1, impiegato in associazione con risultati fisici e clinici, fornisce ulteriori informazioni
obiettive che consentono di guidare le decisioni nella stratificazione del rischio di pazienti che presentano dolore
addominale indicativo di AA. I pazienti identificati come a basso rischio dal test APPY1 possono essere gestiti in modo
maggiormente conservativo, ad es. con test o imaging minimi oppure in assenza di essi, con la sola osservazione o
dimissione precoce.
Principi del test
Il sistema APPY1 comprende lo strumento APPYReader™ (il lettore), un vassoio di test APPY1 monouso, una fiala
monouso di buffer di diluizione e una fiala monouso di anticorpi liofilizzati coniugati con microparticelle marcate
con un colorante fluorescente. La procedura di test richiede l’aggiunta del plasma del paziente al buffer di
diluizione, seguita dalla ricostituzione del coniugato liofilizzato con il plasma/buffer diluito. I complessi MRP 8/14
e CRP disponibili nel campione diluito del paziente sono legati dal coniugato dell’anticorpo ricostituito. Un’aliquota
della miscela viene quindi applicata al vassoio di test, dove i complessi MRP 8/14 e CRP ora marcati con colorante
fluorescente si legano agli anticorpi corrispondenti della zona di acquisizione sulla membrana di nitrocellulosa. Il
vassoio di test viene inserito immediatamente nel lettore che misura la concentrazione di ciascun analita presente nel
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campione in base all’intensità della fluorescenza di ciascuna zona di acquisizione della linea di test. La concentrazione
di MRP 8/14 e CRP presente nel campione viene calcolata in base alle curve di calibrazione pre-programmate sui tag
RFID incorporati in ogni singolo vassoio di test. Le concentrazioni dei due marker, in combinazione con i valori del
conteggio dei globuli bianchi ottenuti da un analizzatore ematologico dell’ospedale e inseriti in un lettore dedicato,
vengono utilizzate per generare i risultati del test APPY1 del paziente mediante l’uso di un algoritmo proprietario
pre-programmato. Il sistema APPY1 comprende inoltre i controlli di qualità elettronici (a secco) e procedurali (liquido)
per garantire l’integrità dei risultati. Il tempo totale necessario per l’elaborazione del campione e per l’esecuzione del
test è di circa 20 minuti.
La MRP 8/14 (nota anche come S100A8/A9 o calprotectina), un complesso di proteine che si legano al calcio, è
presente nel citoplasma dei neutrofili ed è associata a condizioni infiammatorie acute aspecifiche. È stato rilevato
che la MRP 8/14 è elevata in modo differenziale nel tessuto dell’appendice e nel sangue periferico in pazienti con
appendicite acuta.15-18
La proteina C reattiva (CRP), prodotta dal fegato, è associata a infiammazione. La CRP è una proteina di fase acuta
che risulta elevata in varie malattie e condizioni associate a infiammazione acuta aspecifica. Concentrazioni elevate
di CRP nel sangue periferico sono state correlate ad appendicite acuta.19-21 Le caratteristiche prestazionali analitiche
del dosaggio della CRP con il test APPY1 sono coerenti con quelle del dosaggio della CRP a elevata sensibilità (hsCRP),
come descritto in basso.
Valori totali elevati della formula leucocitaria sono associati ad appendicite acuta quando i sintomi sono presenti
per 24 ore o più.22 La leucocitosi non è specifica dell’AA poiché è osservata anche in varie altre condizioni infettive e
disturbi infiammatori. Gli studi suggeriscono che una normale formula leucocitaria, in combinazione con bassi livelli
di MRP 8/14 e CRP e altri biomarker, riduce la probabilità che sia presente appendicite acuta.18
Reagenti e materiali
F10000
• Kit per test APPY1, 25 test
»» Vassoio di test APPY1, sacchetto, 25
• Membrana in nitrocellulosa con striscio di anticorpi monoclonali specifici per CRP e MRP 8/14 e
una IgY policlonale di capra non correlata anti-pollo come controllo interno.
»» Tampone di test APPY1, 990 µl, 25
»» Coniugato di test APPY1, liofilizzato, 25
»» Istruzioni per l’uso, 1
Materiali necessari, ma non forniti
• Kit APPYReader
• Vassoio APPYReader QC, sacchetto, 1 F10008
F10004
• Kit di controllo APPY1, 10 fiale
F10005
»» Livello di controllo 1 APPY1, 40 µl, 5
»» Livello di controllo 2 APPY1, 40 µl, 5
• Centrifuga per trattamento del plasma, rotore ad angolo fisso ≥ 45 gradi o rotore oscillante, in grado di
raggiungere 1.300 x g ± 100 (RCF, forza centrifuga relativa)
• Micropipette calibrate e punte monouso per micropipette in grado di dispensare 10 µl, 70 µl e 150 µl
• Miscelatore vortex
• Minicentrifuga (per centrifugare i controlli se necessario)
• Dispositivi di protezione personale e contenitori per smaltimento di rifiuti pericolosi sotto il profilo biologico
Conservazione e stabilità
• Subito dopo il ricevimento, il kit per test APPY1 deve essere conservato a 2-8 ºC (35,6-46,4 ºF) lontano
dalla luce diretta. I componenti del kit devono essere conservati nella confezione originale, intatta, fino al
momento dell’utilizzo. Il kit per test APPY1 è stabile fino alla data di scadenza stampata sulla scatola del kit e
sui componenti del test, se conservato come raccomandato.
• Il vassoio APPYReader Quality Control (QC) deve essere conservato a –15-30 °C (–59-86 °F) nella confezione
originaria, non aperta, fino al primo utilizzo. Il vassoio QC è riutilizzabile e deve essere richiuso nel sacchetto
originale subito dopo ogni utilizzo. Non gettare. Proteggere dall’esposizione alla luce diretta.
• Il kit di controllo APPY1 deve essere conservato nella confezione originale a una temperatura ≤ -20 °C (-4 °F).
Non conservare in un congelatore no-frost. Scongelare prima dell’uso solo il numero di fiale di controllo
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necessarie e gettarle dopo l’analisi. Le fiale di Controllo 1 e Controllo 2 APPY1 non devono essere ricongelate
dopo lo scongelamento.
Precauzioni
Precauzioni generali
• Esclusivamente per uso professionale
• Ciascun vassoio di test è destinato esclusivamente a un singolo utilizzo su un solo campione di un paziente. I
vassoi di test non possono essere riutilizzati.
• Non miscelare i componenti di diversi lotti di kit di test, poiché i componenti sono abbinati all’interno di
ciascun lotto di kit per garantire prestazioni ottimali.
• Non rimuovere i vassoi di test dal sacchetto fino al momento dell’uso. Non rimuovere dalla confezione il
coniugato di test fino al momento dell’uso.
• Tra un utilizzo e il successivo, conservare il vassoio APPYReader QC nel sacchetto originale richiudibile che
protegge dalla luce. Dopo ogni utilizzo, riporre il vassoio QC nel sacchetto originale richiudibile. Non gettare.
• Non usare fiale di controllo APPY1 scongelate e ricongelate.
• Non forare o danneggiare il vassoio di test durante la manipolazione prima dell’uso. Qualora venga forato o
danneggiato, gettare il vassoio e usarne uno nuovo.
• Non usare i componenti del kit oltre la data di scadenza indicata sulla scatola del kit e sulle etichette dei
componenti stessi.
• Dopo aver caricato il campione da analizzare nell’apposito pozzetto del vassoio di test, chiudere
immediatamente il cassetto del vassoio per avviare il ciclo di test. Un ritardo può determinare un risultato
non valido.
• Per ottenere un risultato valido occorre inserire un valore confermato della formula leucocitaria del paziente
entro 90 minuti dall’avvio del ciclo di test.
• Tutti i materiali che sono stati a contatto con sangue o emoderivati di origine umana devono essere smaltiti
come rifiuti pericolosi sotto il profilo biologico.
• Il kit di controllo APPY1 contiene derivati di pool di plasma di origine umana. Ciascuna unità di donatore è
stata analizzata mediante metodi approvati dalla FDA ed è risultata negativa per HBsAg, HCV, HIV-1, HIV-2,
HIV-1Ag, HIV-1-NAT, ALT e sifilide. Poiché nessuno degli attuali metodi di analisi è in grado di offrire la totale
garanzia relativamente all’assenza di agenti infettivi, i reagenti devono essere maneggiati come plasma
umano potenzialmente infetto. Si raccomanda di attenersi alle precauzioni universali e alle norme di sicurezza
relative agli agenti patogeni a trasmissione ematica. Ogni laboratorio deve seguire le linee guida stabilite
internamente in relazione alle prassi di sicurezza del laboratorio stesso.
• Il tampone di test contiene azoturo di sodio allo 0,095% come conservante. In caso di contatto cutaneo,
sciacquare con acqua abbondante. L’azoturo di sodio può reagire con tubazioni in piombo e/o in rame,
formando azidi metalliche esplosive; far scorrere abbondante acqua durante lo smaltimento.
• Tutti i campioni dei pazienti devono essere manipolati come materiali in grado di trasmettere malattie. Si
raccomanda di attenersi alle precauzioni universali e alle norme di sicurezza relative agli agenti patogeni a
trasmissione ematica. Ogni laboratorio deve seguire le linee guida stabilite internamente in relazione alle
prassi di sicurezza del laboratorio stesso.
Prelievo e conservazione dei campioni
Il sangue del paziente deve essere prelevato tramite normale venipuntura o linea endovenosa (con flush) in una
provetta K2 EDTA (tappo color lavanda) contenente 1,8 mg di EDTA/cc di sangue. Dopo il prelievo ematico, centrifugare
la provetta per 10 minuti a 1300 x g ± 100 (RCF) a temperatura ambiente. La centrifugazione deve iniziare entro
una (1) ora dal prelievo del campione. La centrifuga deve essere a rotore fisso con un angolo maggiore di 45° o a
rotore oscillante. Per calcolare la conversione di RPM in RCF, consultare il manuale d’uso per il modello di centrifuga o
contattare l’assistenza tecnica di Venaxis®.
Procedura di test
Impostazione del Lettore
• Eseguire l’impostazione del lettore come descritto nel manuale d’uso dell’APPYReader e/o nella guida all’avvio.
• Accedere al lettore con l’ID operatore assegnato.
• Attendere che il lettore si riscaldi per almeno 10 minuti prima di eseguire l’analisi di un controllo o di campioni
dei pazienti.
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Preparazione dei reagenti per il QC e il test
• Se si utilizza il controllo di qualità (QC) liquido, rimuovere il necessario numero di fiale di Controllo 1 e
Controllo 2 dal kit di controllo APPY1 conservato a ≤ -20° C. Scongelare a temperatura ambiente mentre il
lettore si riscalda. Per ulteriori informazioni, consultare le istruzioni per l’uso del kit di controllo APPY1.
• Rimuovere una quantità sufficiente di vassoi, fiale di tampone e fiale di coniugato da un kit per test APPY1
conservato a 2-8 °C necessaria per completare tutti i test (QC e campioni dei pazienti). Attendere che i
componenti raggiungano la temperatura ambiente mentre il lettore si riscalda.
Utilizzo del vassoio QC
• Utilizzarlo ogni giorno in cui si eseguono test dei pazienti e/o prima di eseguire i Controlli 1 e 2. I campioni dei
pazienti non possono essere analizzati a meno che il vassoio QC non abbia riportato un risultato valido (PASS
(RIUSCITO)) entro le ultime 24 ore.
• IMPORTANTE: per mantenere la durata utile prevista del vassoio QC, evitare l’esposizione alla luce.
Conservare e richiudere il vassoio QC nel sacchetto originale in alluminio subito dopo ogni utilizzo. Non
gettare il vassoio QC fino alla data di scadenza.
• Per ulteriori informazioni, consultare le istruzioni per l’uso del vassoio APPYReader QC.
1. Accedere come operatore o passare alla modalità operatore.
2. Premere
per visualizzare la schermata Main Menu (Menu principale).
3. Usare
e
per evidenziare Maintenance (Manutenzione) e premere Select (Seleziona).
4. Usare
e
per evidenziare Check APPYReader (Controlla APPYReader) e premere Select (Seleziona).
5. Usare
e
per evidenziare APPYReader QC Cassette (Vassoio APPYReader QC) e premere Select
(Seleziona).
Il cassetto del lettore si apre e viene visualizzata la schermata Insert Cassette (Inserisci vassoio).
Al termine del test viene visualizzata la schermata APPYReader QC Cassette (Vassoio APPYReader QC).
6. Per stampare il risultato del vassoio QC:
a. Premere Options (Opzioni).
e
per evidenziare Print Result (Stampa risultato) e premere Select (Seleziona).
b. Usare
7. Per inviare il risultato a un sistema informatico di laboratorio, consultare il manuale d’uso dell’APPYReader.
8. Premere Back (Indietro) per ritornare alla schermata Check APPYReader (Controlla APPYReader) o
per ritornare alla schermata Main Menu (Menu principale).
premere
• Valori attesi
a. Se i risultati dell’unità di fluorescenza relativa (RFU) rilevati sul vassoio QC rientrano negli intervalli
accettabili programmati sul chip RFID del vassoio QC, il risultato del test viene refertato come PASS
(RIUSCITO).
b. Se i risultati RFU rilevati sul vassoio QC non rientrano negli intervalli accettabili programmati
sul chip RFID del vassoio QC, il risultato del test viene refertato come FAIL (NON RIUSCITO)
e all’operatore non è consentito analizzare i campioni dei pazienti. Ripetere il test con un altro
vassoio QC.
c. Se il risultato del secondo vassoio QC è PASS (RIUSCITO), procedere con l’analisi dei campioni dei
pazienti.
d. Se non è disponibile un altro vassoio QC diverso o se il risultato del secondo vassoio QC è FAIL (NON
RIUSCITO), il lettore resterà bloccato. Contattare l’assistenza tecnica Venaxis al numero +1-303-7942000 o il distributore di zona per assistenza.
Test dei campioni dei pazienti
• Preparazione del vassoio di test APPY1
1. Accedere come operatore o passare alla modalità operatore.
2. Premere
per visualizzare la schermata Main Menu (Menu principale).
e
per evidenziare Run Test (Esegui test) e premere Select (Seleziona).
3. Usare
4. Inserire l’ID paziente utilizzando uno dei metodi riportati di seguito.
• Manualmente, usare il tastierino numerico per inserire l’ID paziente.
a. Premere Keypad (Tastierino) per inserire lettere, spazi e punteggiatura.
,
,
e
b. Quando sullo schermo del lettore appare il tastierino, usare
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per evidenziare il
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carattere desiderato.
Premere Confirm & Next (Conferma e avanti) per aggiungere il carattere evidenziato all’ID
paziente.
d. Ripetere i punti a, b e c secondo necessità.
e. Una volta completato l’ID paziente, premere Back (Indietro) o selezionare Done (Fatto)
per uscire dalla funzionalità del tastierino.
• Utilizzando il lettore di codice a barre esterno opzionale, leggere il codice a barre del paziente
5. Nella schermata Enter Patient ID (Inserisci ID paziente), premere Confirm (Conferma).
6. Se è disponibile il risultato della formula leucocitaria del paziente, inserirlo e premere Confirm (Conferma).
In caso contrario, premere Skip (Ignora). Se si preme Skip (Ignora), viene chiesto di inserire la formula
leucocitaria del paziente dopo il test.
7. Estrarre il vassoio di test dal sacchetto e collocarlo nel cassetto.
c.
• Preparazione del campione di plasma del paziente per il test
1. Predisporre il tampone e le fiale di coniugato.
2. Usare una nuova punta monouso per pipetta per ciascun trasferimento.
3. Rimuovere 10 µl di campione di plasma del paziente dalla provetta K2 EDTA centrifugata, prestando
attenzione a non disturbare lo strato di leucociti e piastrine (buffy coat). Trasferire nella fiala con il
tampone. Tappare e agitare nel vortex o miscelare bene manualmente.
4. Trasferire 150 µl del campione di plasma diluito del paziente nella fiala di coniugato. Miscelare bene
pipettando in alto e in basso per 8-10 volte, assicurarsi che tutto il coniugato venga risospeso. Non
introdurre aria nella miscela per evitare che si formi schiuma.
• Avvio del test
1. Aggiungere immediatamente 70 µl della miscela costituita dal campione diluito del paziente/coniugato
anticorpale nel pozzetto del campione del vassoio di test.
2. Chiudere con delicatezza il cassetto. Il test si avvia automaticamente.
3. Il lettore visualizza lo stato del test nella schermata Run Test (Esegui test).
4. Al termine del test, viene chiesto di inserire la formula leucocitaria del paziente o di confermarne
l’inserimento prima del test. Nel frattempo il vassoio di test deve rimanere nel lettore.
5. Reinserire la formula leucocitaria del paziente e premere Confirm (Conferma). Viene visualizzata la
schermata Test Result (Risultato del test).
6. Premere Next (Avanti) per visualizzare la schermata Confirm Patient ID (Conferma ID paziente).
7. Confermare che l’ID paziente visualizzato in questa schermata è corretto.
• Visualizzazione e stampa dei risultati
1. Se l’ID paziente è corretto: premere Confirm (Conferma) per visualizzare il risultato del test nella
schermata Result List (Risultato del test). Se nel lettore è attivata la funzione di stampa automatica, il
risultato viene stampato automaticamente.
2. Se l’ID paziente è errato:
3. Inserire l’ID paziente corretto e premere Confirm (Conferma) per visualizzare la schermata di mancata
corrispondenza dell’ID paziente.
4. Reinserire l’ID paziente e premere Confirm (Conferma) per visualizzare il risultato del test nella schermata
Result List (Risultato del test).
5. Se nel lettore è attivata la funzione di stampa automatica, il risultato viene stampato automaticamente.
6. Premere
per aprire il cassetto. Estrarre il vassoio di test e smaltirlo in un contenitore per rifiuti pericolosi
sotto il profilo biologico.
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Interpretazione dei risultati
RISULTATO DEL TEST APPY1
INTERPRETAZIONE
NEGATIVO/Basso rischio di appendicite
Al di sotto del punto di decisione clinica per il test.
Il paziente è a basso rischio di appendicite acuta.
NON CONCLUSIVO per appendicite
Al di sopra del punto di decisione clinica per il test. Rischio
non conclusivo per appendicite acuta. Vedere le restrizioni
qui di seguito.
RISULTATO NON VALIDO O MESSAGGIO DI ERRORE
Ripetere il test. Se il secondo test genera nuovamente un
Risultato non valido o un Messaggio di errore, consultare
il manuale d'uso dell'APPYReader per le istruzioni sulla
risoluzione dei problemi o contattare l'assistenza tecnica.
Controllo di qualità
Funzioni di controllo integrate
• Il software del lettore include un’autoverifica al momento dell’inizializzazione che calibra i motori ottici,
controlla il sistema di trasporto del vassoio, controlla il sistema del ricevitore ottico ed esegue un controllo
di integrità delle impostazioni del lettore. In caso di discrepanza con le specifiche preprogrammate, sarà
generato un Risultato non valido o un Messaggio di errore.
Controlli esterni
• Vassoio APPYReader QC
Il vassoio APPYReader QC consente il controllo ottico e dell’idoneità del sistema volto a confermare il corretto
funzionamento del lettore e deve essere eseguito giornalmente prima di utilizzare reagenti liquidi di controllo
della qualità o campioni dei pazienti. Per poter procedere con l’analisi dei campioni dei pazienti, il vassoio QC
deve fornire risultati positivi.
• Kit di controllo APPY1
Sono disponibili controlli di qualità liquidi come controllo procedurale per il test APPY1. Gli intervalli stabiliti
per ciascun controllo sono forniti con ciascun lotto di kit. Seguire le istruzioni per l’uso in dotazione a ciascun
kit per eseguire i controlli secondo necessità. I controlli devono essere eseguiti:
»» almeno una volta al mese
»» con ogni nuovo lotto e ogni nuova spedizione di kit per test APPY1
»» in caso di dubbi sull’integrità del sistema, sulle condizioni di conservazione dei reagenti o sull’affidabilità
di qualche risultato del test
»» in conformità con le linee guida nazionali o locali
»» in conformità con le procedure QC del laboratorio
Limitazioni
1. Un risultato del test APPY1 Negativo/Basso rischio di appendicite non preclude una diagnosi di
appendicite acuta. Nelle fasi iniziali della risposta alla fase acuta (<24 ore dalla comparsa dei sintomi)
o nell’appendicite focale, i livelli di MRP 8/14 e CRP nel plasma potrebbero non aver raggiunto livelli
significativi dal punto di vista clinico, determinando un falso risultato negativo del test.
2. Un risultato del test APPY1 Non conclusivo per appendicite non deve essere usato per formulare una
diagnosi di appendicite acuta oppure interpretato come “positivo”, poiché altri disturbi infiammatori o
malattie infettive possono evidenziare la presenza nel plasma di maggiori livelli di MRP 8/14 e CRP e un
conteggio elevato dei globuli bianchi.
3. Il risultato del test APPY1 si basa su un punteggio calcolato da un algoritmo proprietario che utilizza input
multivariati. Per arrivare al risultato del test APPY1 Test, il punteggio viene quindi messo a confronto con
un punto di decisione clinica predeterminato.
4. MRP 8/14, CRP e formula leucocitaria sono regolati verso l’alto aspecificamente in condizioni infiammatorie
quali infezioni acute, lesioni tissutali acute e altri disturbi infiammatori. Una diagnosi di appendicite acuta
deve essere quindi formulata nel contesto dell’anamnesi del paziente e dei risultati fisici e clinici.
5. Le variazioni intra-individuali dei livelli di CRP possono essere comprese tra il 30 e il 60%. Anche la
variabilità dei livelli di MRP 8/14 è ben caratterizzata.
6. Errori nel trattamento dei campioni possono determinare risultati negativi o falsi positivi.
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Risultati attesi
L’algoritmo e il valore limite/punto di decisione clinica sono stati ottenuti da uno studio clinico pilota condotto su
503 pazienti. In base all’analisi relativa alla Curva caratteristica operativa del ricevitore (ROC) e all’accordo clinico con
diagnosi di dimissione, è stato determinato il punto di decisione clinica per il test APPY1. I risultati dei test relativi ai
pazienti al di sotto del valore limite vengono considerati NEGATIVI/Basso rischio di appendicite acuta, mentre i risultati
al di sopra del valore limite vengono considerati NON CONCLUSIVI per appendicite.
Prestazioni cliniche
Lo studio clinico di convalida dell sistema APPY1 System è stato condotto su campioni di plasma congelati archiviati. I
campioni sono stati prelevati durante un precedente studio osservazionale, prospettico, multicentrico, in aperto volto
alla valutazione, all’analisi, al triage e alle dimissioni di pazienti di età compresa tra 2 e 20 anni che si sono presentati
in reparti di pronto soccorso con sintomi indicativi di appendicite acuta. I pazienti arruolati nello studio sono stati
sottoposti a prelievi ematici dai quali sono stati ottenuti campioni di plasma, congelati entro 2 ore. I campioni sono
stati conservati nei centri a ≤ -70 ºC fino alla spedizione a Venaxis, dove sono stati archiviati e conservati a ≤ -70 ºC fino
al momento del test. Nel laboratorio di Venaxis sono stati condotti test dei campioni in cieco con con il sistema APPY. I
risultati del test APPY1 sono stati confrontati con la diagnosi originale alle dimissioni (Negativo per appendicite acuta,
AA-) o all’istopatologia (Positivo per appendicite acuta, AA+).
Nello studio di convalida sono stati usati complessivamente 465 campioni di pazienti prelevati durante precedenti
studi clinici pilota, contenenti un volume sufficiente per l’analisi completa. I soggetti erano di età compresa tra 2 e 20
anni, età media 12,0 ± 4,3 anni. All’incirca il 49% erano di sesso maschile e il 52% di sesso femminile. La razza caucasica
era quella predominante corrispondente al 70%, quella ispanica/latina al 19% e altre all’11%. Non vi era una differenza
significativa nell’età media tra la coorte AA+ (12,5±3,8) e la coorte AA- (11,9±4,5).
Risultati del test APPY1 confrontati alla diagnosi clinica
Risultato del test APPY1 N=465
Sotto il valore limite:
NEGATIVO/Basso rischio di AA
Sopra il valore limite:
NON CONCLUSIVO per AA
AA-
AA+
154
6
160
179
126
305
333
132
465
Dati delle prestazioni cliniche
Misura
Stima (IC al 95%)
Prevalenza AA
28,4% (24,5 – 32,6)
Sensibilità
95,5% (90,4 – 97,9)
Specificità
46,2% (41,0 – 51,6)
NPV
96,3% (92,1 – 98,3)
PPV
41,3% (35,9 – 46,9)
Rapporto di verosimiglianza positivo
Rapporto di verosimiglianza negativo
1,78 (1,60 – 1,99)
0,098 (0,045 - 0,217)
Prestazioni analitiche
Limite di rilevazione
Il limite del bianco (LOB), il limite di rilevazione (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) sono stati determinati da 2
operatori che hanno analizzato 3 lotti di kit per test APPY1 contro 6 campioni di plasma e campioni bianchi di tampone
del test APPY1 nell’arco di 3 giorni, con i campioni randomizzati ogni giorno.
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LOD, LOB e LOQ
Limite
CRP, µg/ml
MRP, µg/ml
Bianco
0,201
0,030
Rilevazione
0,254
0,045
Quantificazione
0,341
0,064
Linearità
Per ciascun analita è stata dimostrata la linearità per un intervallo compreso all’incirca tra il LOD/LOQ fino a oltre il
valore di troncamento superiore del dosaggio. Il dosaggio è lineare per entrambi gli analiti nell’intervallo del valore
limite clinico. Il dosaggio della MRP è lineare da 0,052 a 0,933 µg/ml; il dosaggio della CRP è lineare da 0,187 a 51,4
µg/ml. Utilizzando il LOD della CRP come valore basso, il dosaggio della CRP è lineare da 0,254 µg/ml a 51,4 µg/ml.
MRP 8/14 misurata in μg/ml
Linearità di MRP 8/14
1,2
y = 0,9998x - 0,0062
R² = 0,9959
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Stimata in µg/ml
CRP misurata in μg/ml
Linearità di CRP
70
60
50
40
30
20
10
0
0
-10
y = 1,0545x - 0,451
R² = 0,9915
10
20
30
40
50
60
Stimata in µg/ml
Precisione
Le prestazioni di precisione del test APPY1 sono state valutate in conformità con le linee guida CLSI EP-5A2, “Evaluation
of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods; Approved Guideline” (Valutazione delle prestazioni
di precisione dei metodi di misurazione quantitativi; Linee guida approvate). Cinque campioni di plasma tra LOQ e
il valore limite (punteggio del test APPY1 pari a 4,0), in corrispondenza o in prossimità del valore limite, e a intervalli
superiori al valore limite sono stati analizzati nell’arco di 20 giorni, 2 cicli di test al giorno, 2 replicati per ciclo, 1 operatore.
I campioni sono stati randomizzati su 5 lettori in ciascun giorno di test. Per completare il calcolo del punteggio del
test APPY1, a ciascun campione è stata assegnata una formula leucocitaria fissa. Il coefficiente percentuale totale di
variazione (CV%) era compreso tra 0,0 e 2,8% per il punteggio del test APPY1, tra 6,5 e 12,0% per MRP 8/14 e tra 4,8 e
15,1% per CRP. Prossimi al valore limite stabilito, i CV% per MRP 8/14 e CRP sono stati ≤ 10,6%.
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Test di precisione: punteggio del test APPY1 con formula leucocitaria fissa
Campione
1
2
3
4
5
N
80
80
80
80
80
Punteggio del
test APPY1
(medio)
3,2
3,9
4,0
4,1
5,2
Intra-analisi
DS
0,000
0,000
0,050
0,037
0,143
Inter-analisi
CV %
0,0
0,0
1,2
0,9
2,8
DS
0,000
0,000
0,000
0,027
0,000
Totale
CV %
0,0
0,0
0,0
0,7
0,0
DS
0,000
0,000
0,050
0,046
0,148
CV %
0,0
0,0
1,2
1,1
2,8
Test di precisione: concentrazione di MRP 8/14
Parametri
MRP 8/14 µg/mL
Media
Ripetibilità (intra-analisi)
Inter-analisi
Totale
DS
CV %
DS
CV %
DS
CV %
1
2
Campione
3
4
5
0,10
0,006
6,3
0,000
0,0
0,006
6,5
0,15
0,009
6,1
0,007
4,5
0,011
7,1
0,24
0,024
10,0
0,002
0,7
0,025
10,6
0,31
0,016
5,1
0,012
3,8
0,021
6,9
0,52
0,058
11,2
0,000
0,0
0,062
12,0
1
2
Campione
3
4
5
0,58
0,027
4,6
0,013
2,3
0,028
4,8
2,31
0,126
5,5
0,097
4,2
0,149
6,5
5,06
0,341
6,7
0,280
5,5
0,453
8,6
5,25
0,364
6,9
0,262
5,0
0,453
8,6
18,88
2,953
15,6
0,000
0,0
2,851
15,1
Test di precisione: concentrazione di CRP
Parametri
CRP µg/ml
Media
Ripetibilità (intra-analisi)
Inter-analisi
Totale
DS
CV %
DS
CV %
DS
CV %
Riproducibilità
La riproducibilità è stata valutata nel laboratorio Venaxis da 3 operatori, ciascuno con un lettore dedicato,
completamente all’oscuro dei risultati ottenuti dagli altri operatori. Una combinazione operatore + lettore è stata
designata quale “sito” separato per un totale di 3 siti. Ogni operatore ha testato 5 campioni di plasma più 2 controlli
per 3 giorni, 2 cicli di test al giorno, 2 replicati per ciclo. L’ordine dei campioni è stato variato in ciascun ciclo di test.
Per completare il calcolo del punteggio del test APPY1, a ciascun campione è stata assegnata una formula leucocitaria
fissa. Per i punteggi dei test APPY1, il CV% all’interno del ciclo (ripetibilità) era ≤ 3,4%, il CV% tra un ciclo e l’altro
era ≤ 0,9%, il CV% tra un giorno e l’altro era ≤ 0,7% e il CV% tra gli operatori/siti era ≤ 0,5%. L’imprecisione totale
(riproducibilità) era ≤ 3,4%. I risultati relativi al punteggio del test APPY1, MRP 8/14 e CRP sono mostrati di seguito:
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Test di riproducibilità: punteggio del test APPY1 con formula leucocitaria fissa
1
2
Campione
3
4
5
DS
CV %
3,2
0,014
0,4
3,9
0,019
0,5
4,0
0,048
1,2
4,2
0,049
1,2
5,4
0,168
3,1
DS
0,004
0,010
0,019
0,017
0,049
CV %
DS
CV %
DS
CV %
DS
CV %
0,1
0,005
0,1
0,003
0,1
0,015
0,5
0,3
0,014
0,4
0,005
0,1
0,026
0,7
0,5
0,010
0,2
0,011
0,3
0,054
1,3
0,4
0,012
0,3
0,010
0,3
0,054
1,3
0,9
0,036
0,7
0,030
0,5
0,182
3,4
1
2
Campione
3
4
5
DS
CV %
0,10
0,003
2,9
0,15
0,010
6,6
0,25
0,029
11,5
0,34
0,026
7,7
0,59
0,656
11,1
DS
0,002
0,005
0,009
0,008
0,013
CV %
DS
CV %
DS
CV %
DS
CV %
1,9
0,003
2,6
0,010
9,6
0,009
8,6
3,1
0,007
4,7
0,002
1,6
0,013
8,8
3,5
0,006
2,4
0,006
2,5
0,031
12,6
2,3
0,007
2,0
0,006
1,7
0,029
8,4
2,3
0,017
3,0
0,015
2,5
0,071
12,0
1
2
Campione
3
4
5
DS
CV %
0,63
0,039
6,1
2,52
0,166
6,6
5,55
0,309
5,6
5,94
0,568
9,6
24,34
3,375
13,9
DS
0,016
0,13
0,281
0,228
1,226
CV %
DS
CV %
DS
CV %
DS
CV %
2,5
0,012
1,9
0,009
1,4
0,044
7,0
5,2
0,116
4,6
0,048
1,9
0,245
9,7
5,1
0,065
1,2
0,099
1,8
0,434
7,8
3,8
0,132
2,2
0,121
2,0
0,638
10,7
5,0
0,743
3,1
0,902
3,7
3,776
15,5
Parametri
Punteggio del test APPY1
Media
Ripetibilità (intra-analisi)
Inter-analisi
Inter-die
Inter-operatore
Riproducibilità (totale)
Test di riproducibilità: concentrazione di MRP 8/14
Parametri
MRP 8/14 µg/ml
Media
Ripetibilità (intra-analisi)
Inter-analisi
Inter-die
Inter-operatore
Riproducibilità (totale)
Test di riproducibilità: concentrazione di CRP
Parametri
CRP 8/14 µg/ml
Media
Ripetibilità (intra-analisi)
Inter-analisi
Inter-die
Inter-operatore
Riproducibilità (totale)
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Interferenza
Sono stati analizzati campioni di pool plasmatico contenenti concentrazioni basse (L), medie (M) e alte (H) di MRP 8/14
e CRP per valutare l’interferenza da parte di emoglobina, bilirubina (coniugata e non coniugata), lecitina, anticorpi
umani anti-murini (HAMA), fattore reumatoide (FR) e immunoglobulina G (IgG). I valori di controllo per ciascun pool
plasmatico (L, M, H) sono stati stabiliti utilizzando la media di 3 misurazioni replicate. L’effetto di ciascuna sostanza
interferente è stato valutato usando la media di 3 misurazioni replicate su ciascun pool plasmatico. A ciascun pool
plasmatico è stato assegnato un valore fisso della formula leucocitaria per calcolare il punteggio del test APPY1. Al
pool plasmatico basso è stato assegnato un valore della formula leucocitaria di 4, al pool plasmatico medio è stato
assegnato un valore della formula leucocitaria di 7 e al pool plasmatico alto è stato assegnato un valore della formula
leucocitaria di 10, assegnando rispettivamente punteggi del test APPY1 di 3,1, 3,6 e 4,6. Non è stata osservata alcuna
interferenza significativa sul punteggio del test APPY1 per nessuna delle sostanze interferenti, tutte le differenze sono
risultate inferiori al 10%. Tuttavia, è stata rilevata una potenziale interferenza a livelli bassi di MRP 8/14 quando è stata
utilizzata la bilirubina non coniugata a questi livelli di test. Come dimostrato nel grafico in basso, questa interferenza
ha un effetto molto limitato sul punteggio del test APPY1. Inoltre, è stata rilevata interferenza a bassi livelli di CRP nel
confronto tra il campione di plasma positivo al FR e il rispettivo controllo. Tuttavia, in questo campione sono stati
rilevati bassi livelli di CRP con l’immunoblot, indipendentemente dai pool di test. Se si analizza una fonte più pulita di
FR, la differenza percentuale indicata in basso risulterà ridotta. Un risultato simile è stato ottenuto con tutti i livelli di
MRP 8/14 quando è stato eseguito il test dell’interferente IgG. È stato dimostrato che l’IgG purificata è contaminata
con MRP 8/14 e che se si ottiene un materiale di origine più pulito anche gli effetti dell’interferenza indicati in basso
dovrebbero ridursi.
Test dell’interferenza: test APPY1
Pool basso
Pool medio
Punteggio
Punteggio
test APPY1 = 3,1 test APPY1 = 3,6
Pool alto
Punteggio
test APPY1 = 4,6
Potenziale interferente
Concentrazione
Emoglobina
2 g/l
0,69
-0,79
Bilirubina, non coniugata
342 µmol/l
1,37
0,56
1,78
Bilirubina, coniugata
342 µmol/l
-0,28
-1,52
-1,80
Lecitina
11,1 mmol/l
0,38
-0,09
0,17
HAMA
153,3 ng/ml
0,24
-0,93
-2,18
Differenza % rispetto al campione di controllo o NSD
-0,08
Fattore reumatoide
60 IU/ml
0,06
0,42
-1,99
IgG
52,8 mg/ml
5,55
7,06
4,30
Il kit per test APPY1 è destinato esclusivamente all’esportazione in USA.
Venaxis è un marchio registrato di Venaxis, Inc. APPY1 e APPYReader sono marchi di Venaxis, Inc.
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Symbol Key: Symbolschlüssel: Leyenda de los símbolos: Légende des symboles: Descrizione dei simboli:
Verklaring van symbolen:
Symbol
Symbol
Símbolo
Symbole
Simbolo
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EN
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ES
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