ANTICORPI MONOCLONALI Adapted from Milstein (1980) Scientific American, Oct. p.58 Antigen 31 2 4 1 2 BA LB / c Immunization 3 m 4 m B cell 1 2 3 31 2 4 Antiseum A mixture of all Ab m 2 3 4 1 2 Spleen cells + Myeloma 1 4 x m 3 Cell fusion 4 Monoclonal antibodies Pure single Ab If a single Each B cellB produces cell was picked only one up kind and of cultured, antibody, then which it willbinds produce to itsonly specific one kind antigen. of antibody. After Myeloma IfEach B cell immunization, hybridoma is cell fused canwith line bethe can myeloma, cultured mouse produce inspleen the thepure fused testcontains single tube, cell might antibody, but B cells can benot producing cultured called produce monoclonal and specific useful produce antibody. antibodies. antibody. antibody. Conventional But B cell canantiserum not surviveiswell the mixture in the culture. of all antibodies produced by B cells from spleen. Antibodies Polyclonal Antibodies that are collected from sera of exposed animal recognize multiple antigenic sites of injected biochemical. Monoclonal Individual B lymphocyte hybridoma is cloned and cultured. Secreted antibodies are collected from culture media recognize ONE antigenic site of injected biochemical Hybridoma 1975 Kohler and Milstein Multiple myeloma (human disease) Fusions generated by Sendai virus or PEG Bence Jones proteins in urine http://www.immunecentral.com/images/immune_series/immune29.gif Creation of monoclonal antibodies (mAb’s) 1. Hyperimmunize mouse with Ag 2. Fuse B cells with tumor fusion partner (+ PEG) 3. Limiting dilution (96 wells) to fractionate fused cells in HAT media selection HAT media (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). B cells die (mortal, HGPRT-positive) Tumor cells die (HGPRT deficient and cannot utilise salvage pathway) Fusions live (HAT Resistant and immortal) Hybridoma selection (HAT media) The de novo pathway can be inhibited using aminopterin, which inhibits the transfer of methyl groups from activated dihydrofolic acid. cells need Hypoxanthine and Thymine as sources of purines and pyrimidines for the salvage pathway. Myeloma cells are HGPRT- and cannot create nucleotides in the salvage pathway. Plasma cells are HGPRT+ and can utilize hypoxanthine in the salvage pathway. Expand in mice or expand in vitro in vitro material is less concentrated and contains bovine serum ascites fluid contain high [mAb] and minor contamination with mouse Ig How to purify your MAb Affinity Purification • Or use Ag or epitope to make affinity column Monospecific antibodies http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/pwpt/17_mab.pdf IMPIEGHI DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI • Protein purification • Identification and isolation of cell subpopulations using fluorescence cell sorting. • Tumor detection and imaging • Tumor killing • Diagnostic reagents. • Drug Detoxification • Catalytic antibodies IMMUNODIFFUSIONE Immunoprecipitation • At appropriate ratio of antigen:antibody, complex forms an insoluble aggregate. • Technique can be used to purify specific protein from a mixture • Co-immunoprecipitation – interacting proteins also found in the immunoprecipitate Impieghi dell’immunoprecipitazione • Determinazione delle concentrazioni relative di anticorpi o di antigeni • Confrontare diversi antigeni tra loro • Stabilire la purezza di un preparato antigenico Immunodiffusione • Quando l'immunoprecipitazione avviene all'interno di un gel si parla più propriamente di immunodiffusione. • Immunodiffusione radiale • Immunodiffusione doppia • immunoelettroforesi Diagrammi di possibili Modelli di precipitazione con la doppia immunodiffusione eseguita su un antisiero e 2 diversi preparati antigenici A: epitopi identici B:nessun epitopo in comune C:identità parziale IMMUNOELETTROFORESI Separazione elettroforetica degli Ag Archi di precipitazione • Determinare se un paziente produce quantità troppo basse di Ab isotipi, come si verifica in alcune immunodeficienze • Si può vedere se produce se produce un eccesso di alcune proteine, quali albumina, immunoglobuline Immunoelettroforesi quantitativa Ponendo in grafico l’altezza degli archi contro la concentrazione Si otterrà una retta di taratura che può servire per determinare la concentrazione di Ag in un campione incognito TEST DI GRAVIDANZA: ES. DI INIBIZIONE DI AGGLUTINAZIONE (Presenza o assenza di gonadotropina) IMMUNOFLUORESCENZA Gli Ab sono marcati con molecole fluorescenti • Le molecole fluorescenti assorbono luce a una determinata lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione). • Se gli Ab sono marcati con i fluorocromi, possono essere rilevati attraverso la valutazione della luce colorata emessa in seguito all’eccitazione a una determinata lunghezza d’onda • La luce emessa può essere rivelata con un microscopio a fluorescenza • I coloranti possono essere coniugati alla regione Fc di una molecola senza modificarne la specificità • Coloranti: fluoresceina, rodamina, ficoeritrina Immunofluorescense IFA of Ehrlichia chaffeensis in DH82 cells, 400X Bullous pemphgoid with linear deposits of IgG at dermal-epidermal junction Very good rapid diagnostics Citofluorimetria e fluorescenza • Queste tecniche si basano sull’impiego di Ab fluorescenti a hanno carattere qualitativo • FACS (fluorescence-activated cell sorter) • Quando una cellula passa davanti al raggio laser, la luce viene deviata dal rilevatore e questa interruzione del segnale laser viene registrata. Le cellule che possiedono l’Ab fluorescente legato ai loro Ag di membrana vengono eccitate dal laser ed emettono luce, che viene registrato da un secondo sistema, localizzato ad angolo retto rispetto al raggio laser. • Lo strumento conta ogni cellule quando passa davanti al raggio laser e registra i livelli di fluorescenza emessa dalla cellula • Un computer collegato crea i diagrammi con il numero delle cellule in ordinata e la loro intensità di fluorescenza in ascissa SEPARAZIONE DI CELLULE MARCATE CON Ab DIAGNOSTICA ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Test antigen Test antiserum Visualization of reaction ELISA to test MAb production itself The dark blue spot represents a positive clone. The light blue spots are positive controls, the next two wells to the right are negative controls www.ch.tum.de/wasser/weller/ formerprojects_im... SAGGIO ELISPOT Saggio radio-immunologico • Il metodo è basato sulla competizione tra un antigene non marcato e una quantità fissa dello stesso antigene marcato, per il legame con un numero limitante e costante di siti anticorpali. – Ab + Ag* – Ab/Ag* + Ag • Ab/Ag* Ab/Ag Ab/Ag* E' necessario costruire prima di tutto una curva di taratura, % conc. Ag Marcato legato a Ab Tratto lineare Conc. Ag non marcato FRAZIONI DI Ab The Fab fragment contains the antigen binding site Could be cleaved out by papain digest; pepsin digestion even better, as it produces F(ab’)2 Often it is enough for diagnostic purposes – and it is easier to produce Anti Botulinum toxin Hinge region Equine FAB fragment product made by DoD at time of Gulf War, anti-ABCDEFG www-structure.llnl.gov/ fab/fab_tutl.htm Single chain Fv fragments The size and specificity of the ScFv fragment may allow for attachment to cryptic sites http://www.gene-therapeutics.com/Service/custom%20scFv%20antibodies/Abb-scFv.gif IMPIEGHI COME FARMACI About 25-30% of women who have metastatic breast cancer overexpress HER-2 (EGF) receptor Determination of HER2-protein overexpression (semiquantitative DAKO Hercep Test™) Fluorescence in situ hybridisation (FISH) of HER2 amplification www.roche.com/pages/ facets/9/herc.htm Herceptin (TrastuzuMAb) anti-HER MAbs Approved! http://www.roche.com/pages/facets/9/herc1.jpg Problemi con la terapia basata su mAb • Gli Ab di topo sono visti come estranei dal sistema immunitario umano • Innesco della risposta immunitaria contro gli HAMA (human anti-mouse antibody) • Danni nell’ospite • mAb causerebbero meno problemi • (volontari cercasi??!!) • Soluzione: anticorpi ibridi uomo-topo • Anticorpi chimerici: Combinazione della regione variabile di topo con la regione costante di uomo • Anticorpi umanizzati: Ab combina solo gli aa della regione ipervariabile di topo con il resto di Ab umano Anticorpi umanizzati Clone those genes and express them as a recombinant protein in the protein expression system Sales of Rituxan/ MabThera by Year http://www.sh.lsuhsc.edu/ intragrad/micro/micro297/4 Topi transgenici con segmenti genici di anticorpi umani Xenomouse (topo con IgH e Igk umani) Abgenix http://www.sh.lsuhsc.edu/ intragrad/micro/micro297/4 Immunotoxin: Antibody-Toxin Conjugate Antibody is tumor-specific ricin from the castor bean (Ricinus communis). waynesword.palomar.edu/ images/antibod2.gif Only the targeted tumor cells are killed by the toxin Common side effect – Vascular leak syndrome. Could be relieved by usage of mutated toxin Bunch of other toxins could be used Saponin (from soapwort) potent single chain ribosome inactivating protein Goal: treatment of leukemias and lymphomas For T-cell leukemia could be targeted via CD7 : www.som.soton.ac.uk/.../members/ DFlavell/djf2.htm Monoclonal antibodies, which are specific for a certain antigen, i.e. prostate carcinoma cells, can be tagged with a radioactive tracer, which when injected into the body will localize in areas of these recurrent carcinoma cells www.stjosephs-marshfield.org/ OctreoScan in a patient with metastatic small cell carcinoma of the prostate