Diss. ETH No. 15381 Binding Properties and Diels‐Alder Activity of an Efficient Antibody Catalyst A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH for the degree of Doctor of Natural Sciences presented by Andrea Piatesi Dipl. Natw. ETH born April 21, 1975 citizen of Lugano (TI) accepted on the recommendation of Prof. Dr. Donald Hilvert, examiner Prof. Dr. Dario Neri, co‐examiner Zurich, 2003
Summary This thesis describes the binding and catalytic properties of one of the most efficient Diels‐Alderase antibodies known. Catalytic antibody 1E9 is indeed able to accelerate the inverse electron‐demand [4+2] cycloaddition between tetrachlorothiophene dioxide and N‐ethylmaleimide with very high efficiency (EM of 1000 M) compared to other reported Diels‐Alder catalysts. This antibody was raised against a hexachloronorbornene hapten, which is an excellent mimic of the transition state of the catalyzed cycloaddition. Moreover, the recently solved crystal structure of 1E9 in complex with its hapten reveals almost perfect shape complementarity between protein and ligand. Therefore, 1E9 represents an ideal model system for the elucidation of the relationship between binding energy and catalysis of this important pericyclic process, for which Nature seems to provide only a limited number of catalysts. Detailed mechanistic characterization of 1E9 requires access to a considerable amount of protein. Chapter 2 is therefore focused on the generation of recombinant chimeric Fab versions of this antibody. Using the Canonical Sequence Approximation Approach it has been possible to identify 1E9 variants with increased stability and up to 25‐fold improved yield compared to the parent antibody. The MetH87Thr/GlyL63Ser mutant can be obtained in useful amounts (≈4 mg/l fermentation culture) and exhibits binding and kinetic properties identical to those of the original IgG representing an excellent starting point for the investigation of this catalyst by site‐
directed mutagenesis (Chapter 2). Antibody 1E9 shares its basic scaffold with a class of antibodies that recognizes small hydrophobic ligands such as anti‐progesterone antibody DB3, which was shown to cross‐react with structurally distinct steroids, and Diels‐
Alderase antibody 39‐A11, which was raised against a bicyclo[2.2.2]octene derivative. It has been suggested that the germ line precursor of these antibodies (VGAM3.8 and VK5.1 gene families) encode a promiscuous hydrophobic binding iii
pocket containing a conserved hydrogen bond donor for the ligand (AsnH35) and that its diversification during affinity maturation affords high affinity receptors for a large array of structurally diverse molecules. Comparison of the crystal structures of these affinity matured antibodies suggested that the SerL89Phe and TrpH47Leu somatic mutations in 1E9 were largely responsible for the major changes in the shape of the binding pocket, while the CDR H3 residues at position H97, H100 and H100b seemed to modulate the complementarity more subtly. To explore the relationship between hapten complementarity and catalytic efficiency in 1E9, the residues that line the binding pocket have been mutagenized, introducing amino acids characteristic of the germ line sequence or of the structurally related antibodies DB3 and 39‐A11. These results confirm the importance of somatic mutations at positions L89 and H47 for binding and catalysis by 1E9, as well as the role of highly conserved AsnH35 as an essential proton donor. They also show that, despite nearly perfect shape complementarity in the starting antibody, significant improvements in catalytic efficacy can still be achieved by mutation within the CDR H3 loop lining the active site (Chapter 3). The close relationship between 1E9 and the steroid‐binder antibody DB3 raises the provocative question whether it is possible to interconvert two affinity matured antibodies and, if so, how much sequence information is required to effect the conversion. The heavy and light chain sequences of both antibodies are, respectively, 80% and 89% identical, differing in total by 36 mutations. Despite the high degree of sequence identity, the shapes of their active sites differ substantially and the only two common residues that line both active sites are the highly conserved AsnH35 and TrpH50. Furthermore, DB3 does not accelerate the reaction catalyzed by 1E9, but both antibodies, besides binding their respective haptens with nanomolar affinities, cross‐
react with each other’s ligand, although with much lower affinities. In an attempt to define the minimal set of changes required to interconvert 1E9 into DB3, the active site residues of the former have been sequentially replaced with the ones present in the latter. This study allowed the identification of two active site mutations iv
(LeuH47Trp and ArgH100Trp) which, when combined, turn Diels‐Alderase antibody 1E9 into a high affinity steroid binder with exactly the same recognition properties as DB3 (Chapter 4). Although 1E9 is one of the most efficient Diels‐Alderase antibodies known, it is unlikely to be fully evolved due to the intrinsic limitations of the immune system in generating highly diverse binding pockets for a specific ligand (Chapter 4). Given the already excellent fit between the hapten and the protein scaffold in this system, mutations that would improve the binding affinity for the hexachloronorbornene hapten, and therefore the catalytic efficiency (Chapter 3), are likely to be distant from the active site and difficult to predict in a rational manner. In Chapter 5, the feasibility of using yeast cell surface display and fluorescence activated cell sorting as a strategy to optimize the binding properties of catalytic antibody 1E9 has been established. After just two affinity mutagenesis steps and six kinetic screens by fluorescence activated cell sorting, it has been possible to evolve scFv 1E9 variants with up to 10‐fold increased hapten affinity compared to the parent antibody. v
Sommario Questa tesi descrive le proprietà riconoscitive e catalitiche di uno fra i più efficienti anticorpi capaci di catalizzare la reazione di Diels‐Alder. L’anticorpo catalitico 1E9 é infatti in grado di accelerare la cicloaddizione [4+2] a domanda elettronica inversa fra il diossido di tetraclorotiofene e l’N‐etilmaleimmide molto più efficacemente (EM pari a 1000 M) rispetto ad altri biocatalizzatori conosciuti. Questo anticorpo è stato generato contro l’aptene esacloronorbornene che è un eccellente analogo dello stato di transizione della suddetta reazione di cicloaddizione. La struttura a raggi X del complesso 1E9‐aptene rivela, inoltre, un alto grado di complementarità fra il sito attivo dell’anticorpo ed il legante. Considerando tutto ciò, 1E9 rappresenta un modello ideale per elucidare il rapporto fra l’energia di legame e la catalisi di questo processo periciclico, del quale in Natura esistono solo pochi esempi. Studi meccanicistici su 1E9 richiedono una quantità considerevole di proteina. Il capitolo 2 è perciò centrato sulla produzione in E. coli di frammenti Fab di questo anticorpo. L’uso del Canonical Sequence Approximation Approach ha permesso di individuare varianti di 1E9 significativamente più stabili e la cui produzione ha portato a rese fino a 25 volte maggiori rispetto all’anticorpo originario. Il mutante MetH87Thr/GlyL63Ser può essere ottenuto in quantità rilevanti (≈4 mg/l di cultura fermentativa) ed esibisce le stesse proprietà riconoscitive e catalitiche dell’immunoglobulina originale, rappresentando così un eccellente punto di partenza per lo studio di questo anticorpo attraverso mutagenesi. 1E9 condivide la propria struttura con una classe di anticorpi che legano piccole molecole idrofobe come ad esempio l’anticorpo anti‐progesterone DB3, che è in grado di riconoscere steroidi strutturalmente distinti, e l’anticorpo Diels‐Alderasi 39‐A11, che è stato ottenuto contro un derivato del biciclo[2.2.2]ottene. È stato proposto che i geni precursori di questi anticorpi (VGAM3.8 e Vκ5.1) codifichino un sito attivo promiscuo ed idrofobo provvisto di un donatore di legame ad idrogeno vii
per l’aptene (AsnH35) e che la sua diversificazione attraverso la maturazione somatica generi recettori ad alta affinità per un vasto numero di molecole strutturalmente diverse. Un confronto tra le strutture a raggi X di questi anticorpi maturi indica che le due mutazioni somatiche SerL89Phe e TrpH47Leu presenti in 1E9 sono largamente responsabili delle marcate differenze di forma dei loro siti attivi. Nel sito attivo di 1E9, i residui H97, H100 e H100b appartenenti al loop CDR H3, sembrano tuttavia svolgere un ruolo più marginale nel riconoscimento dell’aptene. Al fine di esplorare la relazione fra complementarità di forma ed efficienza catalitica, i residui presenti nel sito attivo di 1E9 sono stati mutati introducendo aminoacidi caratteristici del suo precursore, di DB3 e 39‐A11 (Capitolo 3). I risultati ottenuti confermano l’importanza delle mutazioni somatiche alle posizioni L89 e H47 per le peculiari proprietà di 1E9, così come il ruolo essenziale di AsnH35 nel donare un legame ad idrogeno strategico. Questi studi mostrano inoltre che, malgrado l’alta complementarità di forma fra sito attivo e aptene, sono possibili miglioramenti significativi dell’affinità di legame e dell’efficienza catalitica introducendo mutazioni nel loop CDR H3. La forte somiglianza fra 1E9 e l’anticorpo anti‐steroidale DB3 fa sorgere l’interrogativo se sia possibile interconvertire questi due anticorpi maturi e, se sì, quanta informazione sia necessaria per effettuare la trasformazione. Le sequenze delle catene pesanti e leggere di entrambi gli anticorpi sono identiche, rispettivamente, per l’80% e l’89% e si differenziano per un totale di 36 mutazioni. La forma dei loro siti attivi, nonostante l’alto grado di identicità delle sequenze, differisce sostanzialmente ed i soli due residui comuni sono l’onnipresente AsnH35 e il TrpH50. Un’ulteriore differenza è rappresentata dal fatto che, nonostante i due anticorpi siano in grado di riconoscere l’aptene della controparte, sia pur con minor affinità, DB3 non accelera la cicloaddizione catalizzata da 1E9. Nel tentativo di definire un set minimo di mutazioni sufficiente a interconvertire 1E9 in DB3, i residui appartenenti al sito attivo del primo sono stati sequenzilamente sostituiti con quelli del secondo. Questa analisi sistematica ha permesso di individuare due mutazioni (LeuH47Trp e ArgH100Trp) che, se combinate, sono sufficienti a generare una variante viii
di 1E9 con le stesse proprietà riconoscitive dell’anticorpo anti‐steroidale DB3 (Capitolo 4). 1E9 é fra i più efficienti anticorpi in grado di catalizzare la reazione di Diels‐
Alder, tuttavia è improbabile che possa essere perfettamente evoluto a causa delle difficoltà intrinseche del sistema immunitario nel generare siti attivi altamente diversificati per uno specifico aptene (Capitolo 4). Dato l’eccellente grado di complementarità fra aptene e proteina nel caso di 1E9, è probabile che mutazioni distanti dal sito attivo possano contribuire ad un miglioramento del legame con il legante e, in ultima analisi, portare ad un incremento dell’efficienza catalitica. Tuttavia, prevedere razionalmente questo tipo di sostituzioni non è possibile. Il capitolo 5 dimostra la validità del yeast cell surface display unito a uno screening tramite fluorescence activated cell sorting (FACS) come strategia per ottimizzare le proprietà riconoscitive di 1E9 verso il proprio aptene. Dopo solo due cicli di error‐
prone PCR e sei screens cinetici usando FACS è stato possibile evolvere frammenti scFv di 1E9 con affinità di legame fino a 10 volte superiore rispetto all’anticorpo originario. ix