I metodi alternativi alla sperimentazione animale: stato
dell'arte e sviluppi suggeriti dalla nuova Direttiva
Laura Gribaldo
Institute for Health and Consumer Protection (IHCP)
Ispra (Va), Italy
Bologna 14 Aprile 2011
Breve introduzione di ECVAM
Processo di validazione
Esempio di metodi validati ed accettati a
livello regolatorio
Nuove tecnologie emergenti e loro
applicazione in ambito tossicologico
Il principio delle 3R’s, ispiratore della direttiva
86/609/EEC concernente la protezione degli animali
Refinement procedimenti meno dolorosi
Reduction utilizzo di un minor numero di animali
Replacement sostituzione completa del numero
di animali
Le ragioni di ECVAM: la direttiva 86/609/EEC
Articolo 7.2:
Un esperimento sull’animale non dovrebbe essere condotto se e’
ragionevolmente e praticamente disponibile un’altro metodo
scientificamente valido per raggiungere lo stesso scopo.
Articolo 23:
La Commissione e gli Stati Membri dovrebbero incoraggiare la ricerca
nell’ambito dello sviluppo e validazione di tecniche alternative in grado
di provvedere lo stesso livello di informazione ottenuto con la
sperimentazione animale, ma che riducano il numero di animali
utilizzati o richiedano procedure meno dolorose.
Missione di ECVAM
Direttiva
86/609/CEE
• Studi di
validazione
• Banca dati
• Comunicazione
• Sviluppo di
metodi
ESAC
JRC Structure: 7 Institutes in 5 Member States
IRMM - Geel, Belgium
Institute for Reference Materials and Measurements
ITU - Karlsruhe, Germany
Institute for Transuranium Elements
IE - Petten, The Netherlands – Ispra, Italy
Institute for Energy
IPSC - Ispra, Italy
Institute for the Protection and Security of the Citizen
IES - Ispra, Italy
Institute for Environment and Sustainability
IHCP - Ispra, Italy
Institute for Health and Consumer Protection
IPTS - Seville, Spain
Institute for Prospective Technological Studies
~ 2750 staff
Scenario legislativo in UE
7° Emendamento della Direttiva sui
Cosmetici (2003/15/CE)
REACH (nuova legislazione delle sostanze
chimiche)
Esigenza di metodi alternativi validati in tutti
campi dove sono richiesti studi di tossicità
7° emendamento alla Direttiva dei Cosmetici
Bando dei test animali
Completo bando
dei test animali
Prodotti cosmetici finiti
Prodotti finiti ed
ingredienti cosmetici
Ingredienti cosmetici
a) laddove esistono metodi alternativi validati
b) e accettati al livello regolatorio
2004
2005
2006
Bando di commercializzazione
Prodotti finiti ed ingredienti cosmetici
a) laddove esistono metodi alternativi validati
b) e accettati al livello regolatorio
Irrespettivamente
dall’esitenza
di metodi alternativi
2007
2008
2009
Tutti gli effetti sulla salute
umana ad eccezione di 3 (→ 2013)
a) Tossicità a dose ripetuta
b) Tossicità riproduttiva
c) Tossicocinetica
REACH
Devono essere valutate 30,000 sostanze chimiche
prodotte in quantità > 1 ton per anno
Costi finanziari: 2,4 miliardi €
Numero di animali:
3,9 milioni
Tempo previsto: >11 anni
Miliardi di Euro, milioni di animali,
decenni per i test
Stima di costi e numero di animali ridotto fino al
70%, se vengono utilizzati metodi alternativi
Vantaggi dei tests in vitro
Ambiente chimico-fisico standardizzato
Parametri di esposizione controllati
Piccole quantita’ di composto da testare
Possibilita’ di studiare separatamente diversi tipi
cellulari
– Studio delle interazioni tra diversi tipi cellulari
– Automazione e screening
– Uso di cellule umane
–
–
–
–
Tipi di modelli in vitro (cellule e tessuti)
complessità
Tissue slices
ed espianti
colture aggregate
modelli 3D
cellule primarie colture 2D
linee cellulari umane
Informazione
Perche’ e’ importante considerare le differenze
di specie
• In assenza di dati sull’uomo si utilizzano le dosi che
causano tossicita’ sull’animale per regolare:
– Concentrazioni permesse nell’aria, acqua, suolo, vegetali
– Dosi di farmaco da utilizzare neil trial clinici
– Limiti di esposizione occupazionale
• Stabilire I livelli di potenziale tossicita’ ad una soglia
piu’ bassa di quanto sia giustificato puo’ avere un
impatto economico
– Controlli d’emissione costosi
– Sviluppo di nuovi farmaci piu’ costoso e piu’ lungo
– Interruzione nella produzione di sostanze chimiche utili
– Etc.
• Stabilire I livelli di potenziale tossicita’ ad una soglia
piu’ alta conduce a rischi senza garanzie
ECVAM Aree di attivita’
Cell transformation assay (Balb/3T3)
Nanoparticles
Reconstituted
Throughput Screening
GENES
Normal
1. Tossicita’ sistemica
2. Tossicita’ a livello topico
3. Sensibilizzazione
4. Carcinogenicita’
5. Tossicita’ Riproduttiva
6. Tossicocinetica
7. Ecotossicologia
8. Scientific Information Service (SIS)
9. Vaccini
10. Strategic developments
(GLP, GCCP, HTS, Toxicogenomics,
Nanoparticles toxicology)
Carcinogen-exposed hepatocytes
Confocal microscopy (Balb/3T3)
Unexposed
Balb/3T3 Co-exposed
Rat brain aggregates
GENES
Human skin
CoCl2 30µM
CoCl2100µM
http://ecvam.jrc.it
newsletter
IL PROCESSO DI VALIDAZIONE
1.
2.
3.
4.
definizione del metodo
verifica della affidabilità
verifica della pertinenza
accettazione delle autorità legislative
Principi della validazione
1. Base scientifica e necessità del saggio
2. Relazione tra endpoints ed effetto
3. Protocollo dettagliato
4. Riproducibilità (variabilità intra-laboratorio e interlaboratorio)
5. Trasferibilità inter-laboratorio
6. Affidabilità del saggio (sostanze e dati di riferimento)
7. Campo di applicazione
8. Disponibilità di dati a supporto della validità del metodo
prima della sua valutazione indipendente
Fasi del processo di validazione
0
10 years
Research
e.g.
DG RTD & MS
e.g. EU, OECD,
Pharmacopoeia
EU agencies
Regulatory
Acceptance
Developmen
t
Independent
Review
Prevalidatio
n
Industry
Academia
Regulators
EPAA
Implementation
Validation
e.g. ESAC,
Expert Panels
ECVAM activities &
involvement,
Per endpoint, 2010
el
v
De
t
en
m
p
o
Pr
a
id
l
a
ev
n
tio
Va
n
io
t
a
lid
g. e
e
. ce t- r anc
g
s t
n
Re ta Po ep
ep
cc
c
a
ac
Skin Corrosion
Acute Phototoxicity
Skin Absorption / Penetration
Skin Irritation
Eye Irritation
*
*
Acute Toxicity
*
Genotoxicity / Mutagenicity
*
*
*
Skin Sensitisation
*
*
*
Reproductive & Developmental
*
*
Toxicokinetics / Metabolism
*
Carcinogenicity
*
*
Subacute & Subchronic Toxicity
Biologicals, vaccines
*
* Reduction / refinement alternatives
Un esempio: il percorso riduzione/sostituzione
degli animali nella tossicologia acuta (LD50 test)
• Anni 70
150 (numero di animali per sostanza
valutata)
• Anni 80
revisione dell’OECD:
riduzione a 45 animali
• Anni 90
sviluppo di strategie a “diversi livelli”
riduzione a 15 animali (TG420, TG423 and
TG425)
Tossicità acuta orale in vivo
OECD TG420: “Fixed dose procedure” - esempio
Segni clinici di tossicità - STOP
Osservazione 14 gg.
Segni di tossicità non presenti
Prima dose
Dose minima = 5 mg/kg
Prossime dosi:
- 50 mg/kg
- 300 mg/kg
- 2000 mg/kg
Tossicita’ acuta
Registro di
Citotossicita’
3
2
MEIC
log LD50 [mmol/kg]
&
1
0
-1
-2
-3
-4
ECVAM-ICCVAM
-6
-4
Studio congiunto di validazione di
due saggi di citotossicita’ basale
in vitro -2007
-2
0
log IC50 [mmol/l]
2
4
•Previsione delle prime dosi da utilizzare nei test in vivo
di tossicita’ orale acuta, per ridurre il numero di animali
utilizzati e la morte stessa degli animali ( documento
guida approvato in Marzo 2010)
•Identificazione delle sostanze non tossiche che possono
essere testate con il Limit test (LD50 >2000 or >5000
mg/kg) validazione terminata-ESAC peer review
Studio di validazione: sostanze non-tossiche
Chemicals (%)
0.1
LD50 (mg/Kg)
Validazione del
saggio 3T3 NRU
< 25
3
> 25–200
12
> 200–2000
85
> 2000
85% of all new
industrial chemicals
are in this class
New Chemical Database (TCS-ECB) January 2008
Management Team
ECVAM
Pilar Prieto, Agnieszka Kinsner
Chemicals Selection
Committee
P. Prieto T. Cole
A. Kinsner M.
Liebsch
Independent Data
Analysis ECVAM
Buying & Coding
Chemicals- ECVAM
A. Kinsner
Distribution of
chemicals
SIGMA
56 chemicals
Lab 1
HSL, UK
R.
G
ib
s
o
Validated
n
3T3/NRU
Manual
protocol
Lab 2
ECVAM/NMI JRC
S. Coecke
M. Whelan
Validated
3T3/NRU
Automated
Protocol
Lab 3
IIVS, US
R. Curren
Abbreviated
Protocol of
Validated
3T3/NR
U
Corrosione della pelle
CORROSIONE DERMICA: danni irreversibili a tessuti di pelle
dopo applicazione della sostanza testata
METODO IN VIVO: versione modificata del test di Draize
(OECD TG 404 dal 1981)
ANNEX V DIRETTIVA EUROPEA (classificazione sostanze)
R35
R34
Scottature gravi
Scottature
Studio corrosivitá dermica 19931998
Proposta di prevalidazione: TER, CORROSITEX, Skin2TM
ECVAM finanzia prevalidazione (1993-1994)
Tests
TER
CORROSITEX
SKIN2TM
Valutazione
interna e
prevalidazione
EPISKIN (19941996)
Laboratori
2 labs TER
2 labs CORROSITEX
3 labs Skin2TM
Rapporto con
raccomandazione di
lavoro addizionale
prima di validazione
ECVAM finanzia studio
Validazione (1996-1998)
Sostanze chimiche
50: 25 corrosive, 25
non corrosive
Lavoro addizionale
(1995-1996)
Prevalidazione
1993-1994
Tests
Laboratori
TER assay
Misura resistenza
elettrica transcutanea su
pelle di ratto
•
•
•
Esposizione 24 ore
Valore medi di TER
Perdita integrità strato
corneale e funzione di
barriera (riduzione TER)
1.
CORROSITEX
Matrice di collagene
recostituito con proprietà
simile alla pelle di ratto
• Tempo per attraversare
membrana biologica
• Viraggio colore liquido in
meno di 4 ore – sostanza
corrosiva
1.
Microbiological
Associated,USA
2.
In Vitro
International, USA
Skin2TM assay
• Applicazione topica strato
corneale
• Viability cellulare MTT
• Soglia: 80% viabilita
1. Procter & Gamble, USA
2. ZEBET, Germany
3. Huntingdon Research
Centre, UK
Modello di pelle umana
tridimensionale
2.
Rhone-Poulenc,
Francia
ZENECA CTL, UK
Prevalidazione
1993-1994
Conclusioni generali- i 3 tests hanno:
Comportamento simile
SOPs definiti bene
Trasferibilità buona
TER:
Skin2:
CORROSITEX:
Sensibilità alta,
Funzionamento generale
abbastanza buono,
Alta concordanza e
specificità
In un laboratorio resultati
significativamente diversi
Utilità bassa data
l’alta proporzione di
sostanze incompatibili
Bassa specificità,
Pertinente con in vivo
Richiede tessuto animale Alcuni aspetti tecnici in sospeso
RACCOMANDAZIONI: Lavoro esperimentale addizionale prima della
validazione
Studio corrosivitá dermica 19931998
Proposta di prevalidazione: TER, CORROSITEX, Skin2TM
ECVAM finanzia prevalidazione (1993-1994)
Tests
TER
CORROSITEX
SKIN2TM
Valutazione
interna e
prevalidazione
EPISKIN (19941996)
Laboratori
2 labs TER
2 labs CORROSITEX
3 labs Skin2TM
Rapporto con
raccomandazione di
lavoro addizionale
prima di validazione
ECVAM finanzia studio
Validazione (1996-1998)
Sostanze chimiche
50: 25 corrosive, 25
non corrosive
Lavoro addizionale
(1995-1996)
Validazione
1996-1998
OBIETTIVI
Identificare tests capaci di discriminare corrosivi (C) da non corrosivi (NC)
tra le sostanze chimiche selezionate (acidi organici, fenoli, etc.) e/o tutte le
sostanze chimiche
Stabilire quali tests sono in grado di identificare sostanze già classificate
come R35/gruppo I e R34/gruppi II e III
Validazione – Accettazione Regolatoria
1995 Rapporto ECVAM prevalidazione TER, CORROSITEXTM,
Skin2TM
1998 Rapporto ECVAM validazione – TER, EPISKIN, CORROSITEXTM, Skin2TM)
1999 ESAC statements validità scientifica TER e EPISKINTM
2001 ESAC statement validità scientifica CORROSITEXTM per acidi, basi e
derivati
2000 Accettazione TER e modelli equivalenti di pelle umana nelle linee guida
UE
2002 OECD
Accetta i tests
2003 2004 2006 Nuove TG430, TG431, TG435
Tossicita’ a Livello Topico
Corrosivita’ cutanea
Metodi sostitutivi disponibili
Done (+EU & OECD
TG)
2009
Irritazione cutanea
Irritazione oculare
Metodi sostititutivi disponibili
(EpiSkin™, EpiDerm™ and
SkinEthic™ RHE)
Methods for severe irritation
available (BCOP and ICE)
Cytotoxicity- & cell functionbased assays retrospective
validation under ESAC peer
review (NRR, FL, CM, RBC)
Methods based on reconstituted
human tissue models
(all methods need to be used in
test strategies)
Fototossicita’
Metodi sostitutivi disponibili
Penetrazione Cutanea
Metodi sostitutivi disponibili
Done (+ EU TG)
Done (+OECD TG
ongoing)
2009
2008-2010
Done (+ EU & OECD
TG)
Done (+ EU & OECD
TG)
IRRITAZIONE OCULARE
R&D
Prevalidazione Validazione Revisione
Accettazione
regolatoria
- Tests organotipici
(BCOP & ICE)
- Test cellulari (CM & FL)
- Modelli di cornea umana (SkinEthicTM HCE &
EpiOcularTM)
Human
In vitro
ATTIVITA’ IN CORSO – SUPPORTO ALL’OCSE
Obiettivo
2 tests cellulari per irritazione oculare
Fluorescein Leakage Assay: Permeabilita’ di barriera alla
fluoresceina (linee cellulari animali come MDCK o linee
corneali umane come NHEK)
Cytosensor Microphysiometer Assay: Concentrazioni che
inibiscono il 50% del metabolismo (MRD50) (Fibroblastic
L929 mouse cell line)
LINEE GUIDA SOTTOMESSE ALL’OCSE IN GIUGNO 2010
ACCETTAZIONE REGOLATORIA
LINEE GUIDA – Metodi di sostituzione animale
• TG per tests di irritazione cutanea (Epiderm, Episkin, Skin
Ethic)
Approvato dall’OCSE nel marzo 2010, adottato nel
novembre 2010
Sensitisation
Test ridotto del Linfonodo Locale
Approvato dall’OCSE in Marzo 2010
Nuovi tests in validazione:
Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA, Procter & Gamble).
Protein binding is a key step in the induction of skin sensitisation,
this test uses HPLC to monitor a chemical’s potential to deplete
a nucleophile-containing synthetic peptide.
Human Cell Line Activation Test (h-CLAT, Kao and Shiseido).
This test monitors, using flow cytometry, the induction of two
protein markers on the surface of a human monocytic leukemia
cell line following exposure to the chemical.
Myeloid U939 Skin Sensitisation Test (MUSST, L’Oréal). This
test monitors, using flow cytometry, the induction of a protein
marker on the surface of a human dendritic cell like line following
exposure to the chemical.
Status of Study Progress
Test Method
DPRA
h-CLAT
Training
Transfer
Phase B1
(9 coded chemicals)
Phase B2
(15 coded chemicals)
Completed
Completed
Completed
Ongoing
(all laboratories)
(all laboratories)
in two laboratories
in two laboratories
(P&G, Ricerca)
(P&G, Ricerca)
Completed
Completed
Ongoing
(all laboratories)
(all laboratories)
in three laboratories
(Kao, Shiseido, Bioassay)
MUSST
Completed
(all laboratories)
Ongoing
Carcinogenicita’
Unico test accettato :
18-24 months bioassay su roditori
1 M€/sostanza chimica
600 animali/sostanza chimica
Nessun altro test validato
Cell Transformation Assay (CTA)
• Processo che modella I vari stadi della carcinogenesi in
vivo
•Riconosce carcinogeni genotossici e non-genotossici
nei roditori
carcinogen
Prevalidation CTA
First ECVAM coordinated study involving USA, Japan , EU
BALB/c 3T3
(January 2005)
SHE pH 6.7
(September 2005)
SHE pH 7.0
(January 2008)
• Hatano Research Institute (Japan)
• Harlan RCC (Germany)
• ECVAM (Italy)
• BASF (Germany)
• Harlan RCC
(Germany)
• BioReliance (USA)
• University of Metz (France) from September 2005
• BASF (Germany)
• Harlan RCC (Germany)
• BioReliance (USA)
ECVAM prevalidation of cell transformation assay
(SHE pH 6.7, SHE pH 7.0, and BALB/c 3T3)
Definizione del test
Obiettivi:
Riproducibilita’ intra laboratorio
Trasferibilita’
Riproducibilita’ inter laboratorio
VMT Conclusioni
I tests SHE pH 6.7, pH 7.0 sono trasferibili e riproducibili ed e’ stato sviluppato un
protocollo standardizzato
Per il metodo BALB/c 3T3, e’ stato migliorato il protocollo esistente, che ha portato
alla produzione di risultati riproducibili.
La pubblicazione di queste raccomandazioni e’ in preparazione.
Test del micronucleo in vitro
Normal
mitosis
Clastogeno
Aneugenico
Vantaggi rispetto al test di aberrazione cromosomale:
Necessita di minor formazione specifica professionale
Identifica anche gli aneugenici
Necessita di minor tempo
Riduzione - Threshold approach
Proposal as appendix to OECD TG203
PRIMA FASE: Test di tossicità con alghe e daphnia
Algae inhibition test
e.g. EC50 72h = 5
mg/L
Daphnia toxicity test
e.g. EC50 48h = 50
mg/L
Selezione del
valore più
basso
e.g. 5 mg/L
Upper Threshold Concentration (UTC)
SECONDA FASE: Test di tossicità nei pesci
Limit test nei pesci (OECD 203) alla più alta
concentrazione di soglia (qui: UTC = 5 mg/L)
Mortalità
No
Stop testing
(LC50 > 5 mg/l)
Yes
Intero test di OECD TG 203
Riduzione potenziale di test su animali del
50%
Photo of zebrafish provided by T. Braunbeck, University of Heidelberg
Studi di ecotossicologia in corso
•
Trout S9 in vitro assay per testare la bioconcentrazione nei pesci
(trasferibilita’, riproducibilita’ intra- e inter laboratorio
- in giugno ECVAM terminera’ la propria parte di studio
•
Zebrafish embryo toxicity test (OECD project 2.7; coordinata da
ECVAM transferability, intra- and interlaboratory reproducibility)
– Trasferibilita’ verificata
– Primi risultati (7 chemicals, 3 runs/chemical, 6 laboratories)
indicano una buona riproducibilita’ (intra CV <20%; inter <30%)
– 13 sostanze chimiche verranno testate entro il mese prossimo
Tossicità sistemica
L’avvelenamento per:
- via alimentare
- via respiratoria
- via cutanea
• Sistema nervoso centrale:
neurotossicità
• Cuore:
cardiotossicità
• Fegato:
metabolismo & epatotossicità
Effetto puó essere:
- Acuto
- Cronico
• Reni:
funzione barriera &
nefrotossicità
• Intestino:
funzione barriera
• Sangue/midollo osseo:
ematotossicità
EFFETTI SULLA SALUTE
Corrosivita’ cutanea
Fototossicita’ acuta
Assorbimento cutaneo
Irritazione cutanea
Fotogenotossicita’
Irritazione oculare
Dove dobbiamo
applicare una
strategia
integrata?
Tossicita’ acuta
Genotossicita’/Mutagenicita’
Skin Sensitisation
Carcinogenicity-Toxicokinetics & Metabolism
Tossicita’ sul sistema riproduttivo
La sfida piu’
complessa
Nel futuro: approccio integrato
multidisciplinare
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Tossicita’ di sistema
Comprensione dei meccanismi
Modo d’azione
Identificazione di eventi critici in relazione all’endpoint
finale
Sviluppo di metodi per misurare marcatori precoci di
tossicita’
Estrapolazione in vitro-in vivo in relazione all’esposizione
Uso combinato in vitro/in silico
Categorie chimiche basate sulla struttura e attivita’
Test sugli animali basati su un razionale piu’ strutturato
sugli obiettivi e utilizzando dosi rilevanti
Componenti della Strategia di Testing
•
•
•
•
•
•
•
Uso di dati esistenti
Tests on vitro
Tests in vivo ottimizzati
Livelli di rischio tossicologico
SARs / QSARs e modelling
Read-across e chemical categories
Valutazione dell’esposizione
IVM
Competence Centre 1:
Validation of in vitro alternative Methods
Horizontal Action:
Alternative Methods
/ ECVAM
In-house Support of in vitro Validations:
Trial of submitted protocols in own GLP facility or in
Competence Centre 2:
NRL;
Validation & Training
in vitro Laboratory
Participating as Validation Test-Laboratory
Training in lab techniques for advanced validated
tests
Research on in vitro methods:
- targeted research
-Own research focussed on key issues for validation
Competence Centre 3:
Optimisation of in vitro methods -Following, monitoring a wide range of research
fields.
The interface for alternative Methods and
ECVAM:
- DB-ALM and INVITOX, development and
Competence Centre 4:
Dissemination and databases integration
-Improve user interface
Input
from
other
units of
the IHCP
ECVAM ha pieno accesso a un’ampia gamma di
competenze disponibili nell’Istituto.
• A livello cellulare : diversi metodi in vitro, diversi
sistemi cellulari, e sistemi di automazione
• A livello sub-cellulare : "omica" (metabonomica,
genomica)
• A livello moleculare o chimico : modelli
computazionali (QSAR)
• Competenze di biocinetica
Rinnovo delle strutture di consultazione di ECVAM
• ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC)
• ECVAM Expert Pool (EEP)
• Member State and EU Agency Network- Preliminary
Assessment of Regulatory Relevance (PARERE)
• ECVAM Stakeholder Forum (ESTAF)
TECNOLOGIE EMERGENTI
Modelli di
tossicocinetica
genomica,
proteomica,
metabonomica
Tossicologia
Computazionale
Cellule
staminali
umane
Automazione
Modelli 3D in vitro
Sviluppo e ottimizzazione di tests basati sull’utilizzo di cellule staminali
umane
Attualmente si utilizzano:
• Linee cellulari embrionali umane (hESC)
• Cellule progenitrici neurali derivate da cordone ombelicale (HUCB)
• Linea cellulare pluripotente umana NT2 (teratocarcinoma)
hESC
HUCB
NT2
Elettrofisiologia neuronale
- “in vitro EEG”
MEA chip
firing rate
Acquisizione del
segnale
Analisi
Processamento del
segnale
Ottimizzazione di modelli in vitro per valutare la tossicita’
polmonare
Modelli di Biocinetica su basi
fisiologiche (PBBK)
Predizione della dose in vivo utilizzando modelli di biocinetica
Polmone
dCi Qi 
=  Cart
dt
Vi 
Qi
Cuore
Fegato
G.I.
Met.
Rene
Muscolo
Sangue arterioso
Sangue venoso
Cervello
Ci
Ci  1
Pi
−  −
Pi  Vi K + Ci
m ,i
Pi
Vmax,i
Pelle
Adipose
… associata a modelli di
biocinetica in vitro
Tossicocinetica – estrapolazione in vitro- in vivo
Esposizione– Dose
Prodotto
utilizzato
TTC
target dose
Esposizione esterna
in vitro
testing &
PBPK
modelling
assorbimento,
distribuzione
metabolismo, escrezione
internal
TTC
Dose interna
Dose – Effetto
Composto
parentale e/o
metabolita
attivo
Concnetrazione tissutale
target dose
Risposta molecolare
Effetto cellulare
Relazione dose-risposta
Effetto tossico
patologia
Tecnologie Biomiche:Genomica Funzionale
o Genomica
o Trascrittomica
o Proteomica
o Metabonomica
La tecnologia microarray
si basa sull’abilità di ogni
acido nucleico a singolo
filamento di accoppiarsi
alla sequenza
complementare
Tossicogenomica studia la risposta di un
genoma all’esposizione a sostanze chimiche
Integra informazioni di biomica
con la conoscenza della
tossicologia e patologia per
comprendere il ruolo
dell’interazione gene-ambiente
nello sviluppo delle malattie
La Metabonomica e’ un metodo avanzato di analisi dei
pathways metabolici nella cellula, per evidenziare
perturbazioni dovute all’azione dei tossici.
Genomica
Trascrittomica
Proteomica
Metabonomica
Metabonomica
Advanced MS and NMR
Tossicologia
Computazionale
Biofisica e
Biocinetica
Modelli
Matematici
Gestione dati e
informazione
Categorie
Chimiche
Biostatistica
Reattivita;’
Chimica
Reti
complesse
 t
I i (t ) = A1i ⋅ exp − i
 τ
 1
Relazioni
Struttura-Attivita’


 + A2i ⋅ exp − t

 τi

 2
Read Across
Domini di
Applicazio
ne




ELABORAZIONE DATI
La tossicologia di sistema applicata genera un grande numero di dati che
devono essere stoccati, gestiti, validati e resi disponibili per la loro
analisi ed elaborazione
Solo attraverso tecniche sofisticate di infromatica scoperte
significative possono essere identificate dal flusso dei dati generati
CONDIVISIONE DEI DATI &
INFORMAZIONE
SOTTOMISSIONI DI NUOVI TESTS
• Nel 2010 sono stati valutati 11 nuovi tests relativi a :
Sensibilizzazione cutanea (1), neurotossicita’ (2), tossicita’
del sistema riproduttivo (4), genotossicita’ (1), irritazione
oculare (1); irritazione cutanea (2)
11 STUDI DI VALIDAZIONE SU 18 METODI
Epatociti umaniHepaRG
Androgeni/ estrogeni
receptor binding assays
& saggi di attivazione trascrizionale
Metabolismo
Distruttori
endocrini
Validazione
Sensibilizzazione
cutanea
protein binding and
induction of protein markers
on human cell lines
Irritazione
oculare
Genotossicita’
Modelli di tessuto umano
ricostruito
Metabolismo
•Validazione
Validazione di due metodi:
metodi
• Validazione di due metodi:
Test di induzione enzimatica Human HepaRG CYP
(France)
UCB Pharma SA (Belgium)
Sanofi-Synthelab (France)
(Germany)
In-Vitro Methods Unit/(Italy)
IBET (Portugal)
Test definition
Phenotypic stability
Human Cryohep CYP
Between laboratory reproducibility
Within laboratory reproducibility
Transferability
Predictive capacity
Revisione della Direttiva
86/609/EEC sulla protezione
degli animali nella ricerca
biomedica
ELEMENTI CHIAVE
Autorizzazione di stabilimenti e
progetti
Valutazione sistematica dei progetti dal
punto di vista etico
Attiva promozione e implementazione
del principio delle tre R
Riferimento alle tre R
Menziona esplicitamente il principio delle tre
R (e.g. Recitals 10-13; Articles 4, 13)
Assicura che il Refinement non si limiti alle
procedure scientifiche ma sia rilevante anche
in relazione alla cura, alloggio e allevamento
degli animali
Lo sviluppo, validazione e utilizzo dei metodi
alternativi sono piu’saldamente ancorati
ECVAM come Laboratorio di riferimento
Europeo
La Direttiva 2010/63/EU del Settembre 2010 con l’Articolo 48
crea le basi per un Laboratorio di riferimento dell’Unione europea.
Le sue funzioni sono:
•Coordinare e promuovere lo sviluppo e l’uso di procedure
alternative nell’area della ricerca di base e applicata e nella
tossicologia regolatoria;
•Coordinare e partecipare alla validazione di questi approcci a
livello europeo;
•Favorire lo scambio di informazioni e mantenere una banca dati
pubblica sui metodi alternativi e il loro sviluppo ;
•Promuovere il dialogo tra mondo accademico, regolatori,
industria e tutti gli attori del processo per incoraggiare lo
sviluppo, l’accettazione e l’uso di metodiche alternative
Lavoriamo insieme !
Grazie della vostra attenzione