FOTOMETRIA
I valori di T sono convertiti in E o assorbanza (A)
Per risalire dai valori di E alla concentrazione della
soluzione in esame :
Noto il coefficiente di estinsione molare
Noto il cammino ottico
Si allestisce una CURVA STANDARD di una soluzione a
concentrazione nota
Assorbanza 280nm
Conoscendo il valore dell’assorbanza del campione si può
Interpolare graficamente il valore della sua concentrazione
1,25
1,00
.
0,75
0,50
0,25
0’5
1,0
1,5
2,0
2,5
Concentrazione albumina mg
Lo studio delle radiazioni assorbite da una sostanza
(SPETTRO DI ASSORBIMENTO) può essere utilizza
A SCOPO ANALITICO
• Il colore delle sostanze è dovuto al fatto che esse
assorbono specifiche radiazioni e ne lasciano
passare o riflettono altre
• SOSTANZA COLORATA: assorbe solo alcune
radiazioni che costituiscono la luce bianca e
lascia passare tutte le altre
• SOSTANZA INCOLORE: non assorbe nessuna
radiazione che costituisce la luce bianca ma
assorbe radiazioni a lunghezza d’onda comprese
nell’ultravioletto o nell’infrarosso
Il massimo dell’assorbimento dipende dai gruppi
funzionali presenti nelle molecole ed identifica
LO SPETTRO DI ASSORBIMENTO
ASSORBIMENTO DELLA
LUCE ULTRAVIOLETTA
DA PARTE DEGLI Aa
AROMATICI
Il triptofano e la tirosina
Assorbono la luce
ultravioletta, ciò spiega
perché la maggior parte
delle proteine hanno un
caratteristico
assorbimento della luce
ad una lunghezza d’onda
di 280nm
Spettri di di assorbimento della luce da parte dei
comuni nucleotidi, gli spettri sono quasi identici,
per effettuare misure di assorbimento viene usata
la luce a 260 nm
I citocromi possono
essere distinti in base agli
spettri diassorbimento della
luce
LUNGHEZZA D’ONDA
Applicazioni
• METODI DIRETTI
• Sfruttano le proprietà ottiche delle molecole
analizzate
PROTEINE = 280 nm
•
•
•
•
•
ACIDI NUCLEICI = 260 nm
METODI INDIRETTI
Amminoacidi = ninidrina (570nm)
Proteine = biureto (540)
Zuccheri = proprietà riducenti
Enzimi = substrati o prodotti
Metodi enzimatici indiretti
• Reazioni enzimatiche accoppiate in cui il prodotto viene
utilizzato come substrato in un’altra reazione nella quale è
coinvolta una sostanza cromofora
Glucosio ossidasi
• Glucosio + O2 + H2 O
=
ac. Gluconico + H2 O2
perossidasi
•
H2 O2 + sost. Ridotta (incolore)
• Glucosio + ATP =
•
=
sost. colorata
Glucosio-6-fosfato + ADP
Glucosio-6-fosfato + NADP = 6-fosfogluconato + NADPH
La riduzione dell’anello nicotinamidico produce una
nuova banda di assorbimento della luce con un
massimo a 340 nm
ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI
Isolamento di DNA o RNA da tessuto o da cellule
Eucariotiche o procariotiche
E’ possibile estrarre acidi nucleici partendo dai
Compartimenti cellulari in cui essi sono presenti
Varie fonti:
Tessuti animali
Tessuti vegetali
Eucarioti o procarioti
Virus
Mitocondri o cloroplasti
Liquidi biologici
ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI
• è il primo passo nelle applicazioni di biologia molecolare.
• Esiste una serie di metodi, tra i quali la scelta si effettua
sulla base del:
 Materiale di partenza (organo intero, tessuto, coltura
cellulare, sangue, liquido biologico)
 Tipo di acido nucleico desiderato (ssDNA, dsDNA,
RNA)
 Applicazione post-estrazione prevista (PCR, sequencing,
cloning, restrizione enzimatica).
 La qualità dell’acido nucleico estratto (quantità,
purezza)
ROTTURA DELLE CELLULE
 Rompere la parete o la membrana cellulare
 Separare gli acidi nucleici da altri componenti cellulari
Metodi meccanici: omogeneizzatore
Vibrazioni ultrasoniche
Metodi non meccanici:
Congelamento/scongelamento
Shock osmotico
Agenti litici
OMOGENIZZAZIONE/FRANTUMAZIONE
Per ottenere un “omogenato”
Molto usati sono i METODI MECCANICI
MEZZO PER L’OMOGENIZZAZIONE
• Soluzione ISOTONICA
• A composizione salina bilanciata
• Soluzione TAMPONATA
• DEVE ASSICURARE L’INTEGRITA’ FISICA E
METABOLICA DEGLI ORGANULI
• Mg2+ aiuta a conservare l’integrità di nuclei e ribosomi
• EDTA agente chelante inattivatori di proteasi
• DTT – b-ME agenti riducenti
METODI NON MECCANICI
Digestione enzimatica (es. lisozima per la parete batterica)
Detergenti o solventi organici
(SDS, Triton, acetone, toluene)
Shock osmotico (soluzioni ipotoniche)
Congelamento/scongelamento
Metodi non meccanici
• 1- Lisi blanda (batteri) permette la
•
•
•
•
•
formazione di piccoli pori nella membrana
utilizando Triton e lisozima, in questo modo è
possibile isolare solo DNA plasmidico
mentre il DNA cromosomiale rimane attaccato
alla membrana interna;
2- Lisi spinta in cui le membrane vengono
completamente frantumate utilizzando
detergenti anionici quali SDS.
Con la lisi spinta si isolano acidi nucleici totali
(DNA cromosomiale, mRNA, rRNA,tRNA ecc) .
ESTRAZIONE DI ACIDI NUCLEICI
• Tutte le metodiche per l’estrazione di acidi
nucleici
• utilizzano 3 fasi:
• 1. Una lisi cellulare (spesso combinata con
• l’inattivazione delle nucleasi cellulari)
• 2. La deproteinizzazione del campione
lisato
• 3. La precipitazione dell’acido nucleico
CENTRIFUGAZIONE
• Principio della separazione mediante centrifugazione
Particelle in sospensione con massa e/o densità diverse
Sedimentano sul fondo di una provetta a velocità diverse
Deproteinizzazione
Dopo la rottura della membrana plasmatica si otterà
una miscela complessa costituita da varie
componenti cellulari come:
DNA, RNA, lipidi, mono e polisaccaridi, proteine e
sali
• Rimozione delle proteine dal lisato cellulare è una
tappa importante perché:
• tra le proteine sono presenti enzimi capaci di
degradare gli acidi nucleici,
• presenza di proteine capaci di legarsi agli acidi
nucleici impedendone la funzione e/o la
purificazione.
ALLONTANAMENTO PROTEINE
• Sistemi di deproteinizzazione
• Cloroformio-alcool isoamilico
Le proteine formano un gel all’interfase cloroformioacqua, mentre gli acidi nucleici rimangono in soluzione
• Sodio dodecil Solfato SDS
• Detergente anionico che si lega alle proteine alterandone
la struttura secondaria
• Enzimi proteolitici
• PROTEINASI K: una endopeptidasi aspecifica molto
attiva
Allontanamento proteine
TRATTAMENTO con FENOLO
Una o piu’ estrazioni fenoliche elimina residui proteici
e lipidici (il fenolo si lega al core delle proteine denaturandole ed
è un solvente dei lipidi)
Fenolo a pH basico (inibisce la DNAsi) per estrazione
di DNA
Fenolo a pH acido (inibisce le ribonucleasi) per RNA
Uguale volume di fenolo al sopranatante che diventa
lattescente dopo agitazione, quindi si centrifuga
cloruro
ASSORBIMENTO DELLA
LUCE ULTRAVIOLETTA
DA PARTE DEGLI Aa
AROMATICI
Il triptofano e la tirosina
Assorbono la luce
ultravioletta, ciò spiega
perché la maggior parte
delle proteine hanno un
caratteristico
assorbimento della luce
ad una lunghezza d’onda
di 280nm
Spettri di di assorbimento della luce da parte dei
comuni nucleotidi, gli spettri sono quasi identici,
per effettuare misure di assorbimento viene usata
la luce a 260 nm
COME DETERMINARE LA
CONCENTRAZIONE
DEL ACIDO NUCLEICO ESTRATTO
• la purezza e la concentrazione del acido nucleico
estratto mediante letture spettrofotometriche a
260nm
• 1 OD = 50 mg/ml di DNA
• 1 OD = 40 mg/ml di RNA
• Il rapporto tra le OD misurate a 260 nm e 280 nm
fornisce una indicazione della purezza dell’acido
nucleico esaminato
• Una soluzione di DNA o RNA puro dovrebbe avere un
• rapporto A260/A280 di 1,8 e 2,0 rispettivamente.
Separazione di DNA plasmidico da quello del cromosoma batterico
Mediante centrifugazione all’equilibrio in gradiente di Cloruro di Cesio
DOSAGGIO ACIDI NUCLEICI