Lezione 5-6
martedì 5 aprile 2011
corso Biotec vettori biologici II
Aula 6A ORE 14.00-16.00
scelta di un vettore
come abbiamo detto dipende dall’uso o dall’applicazione che
ne vogliamo fare
I punti salienti dell’uso:
isolare dei brevi segmenti
moltiplicarli
studiarne la sequenza nucleotidica
trasferirli nel genoma di altre cellule controllandone
l'incorporazione e l'espressione
ricapitolazione clonaggio classico
1) estrazione del DNA dalle cellule di un organismo
2) digestione con enzimi di restrizione (adesso amplificazione per PCR)
3) inserimento in un vettore di clonaggio, in grado di replicarsi
autonomamente nella cellula ospite
4) trasferimento del costrutto di DNA nella cellula ospite
5) selezione dei cloni cellulari contenenti il DNA nuovo, capaci quindi di
sintetizzare il prodotto e/o la funzione, codificati dal nuovo gene trasferito.
6) Se si vuole far esprimere la proteina codificata dal costrutto si impiegano
vettori di espressione
concetto di vettore
già sviscerato:
per vettore si considera la struttura che
veicola un frammento di DNA per la serie di
usi che è molto ampia.
solo da rammentare che un plasmide può
fungere da vettore, ma un vettore non è
necessariamente un plasmide
considerando sistemi eucariotici
Il materiale necessario
di partenza è dato dagli
acidi nucleici e dai
metodi di estrazione
purificazione di acidi nucleici
Il primo passo di qualunque tecnica di biologia molecolare consiste nell’isolare
e purificare gli acidi nucleici.
I protocolli sperimentali variano a seconda
del materiale di partenza
del tipo di acido nucleico che si vuole separare
dal tipo di esperimento che si deve effettuare, ecc.
In tutti i casi dovremo :
1. Rompere la parete e/o la membrana cellulare
2. Separare gli acidi nucleici dagli altri componenti cellulari
3. Separare gli acidi nucleici tra loro (per es. il DNA dal RNA)
sorgenti o fonti diverse di A.N.
qualunque tipo di struttura biologica cellulare
contiene acidi nucleici
diversi tipi di utilizzazione:
clonaggio di frammenti genomici
DNA genomico per PCR con frammenti lunghi
oltre le 10 kb
DNA genomico per PCR con frammenti corti
per analisi di SNPs e VNTR (var. numb. tand. rep.)
secondo la lunghezza dei frammenti di Ac. Nucl. da
ottenere si usano accorgimenti diversi
da cellule in coltura
- cellule batteriche o eucariotiche in coltura in
sospensione: separazione dal mezzo di coltura
mediante centrifugazione
- campione da cellule aderenti come fibroblasti si
devono tripsinizzare
- campione di tessuto (fresco o congelato a –20°C o
a -195°C in azoto liquido per evitare la
degradazione da parte di enzimi presenti nelle cellule,
che vengono così inattivati): frazionamento ed
omogenizzazione del tessuto
- lisi delle cellule, affinché queste rilascino i loro
componenti cellulari.
come fare la lisi
Le membrane delle cellule animali sono solubilizzate con detergenti
quali SDS o altri solventi blandi per lisare le membrane,
quando avviene la lisi si liberano anche tutte le nucleasi che devono
essere inattivate (digeriscono DNA e RNA)
Per un campione di tessuto è necessaria un’iniziale omogenizzazione
che è realizzata mediante:
• Metodi meccanici: omogeneizzatore a pestello (potter).
• Vibrazioni ultrasoniche
• Congelamento/scongelamento
Una centrifugazione permette di eliminare i detriti cellulari dal
contenuto cellulare rilasciato nel mezzo, che è costituito da varie
componenti cellulari come DNA, RNA, lipidi, mono e polisaccaridi,
proteine e sali.
separare gli A.N. dal resto
Oltre alle membrane ed al resto delle strutture particellari
centrifugabili ci sono le parti in soluzione del citosol e del nucleo
Oltre ad eliminare le proteine può essere necessario eliminare
alternativamente DNA o RNA indesiderati
Per le preparazioni di DNA, per eliminare l’RNA si usa la ribonucleasi A
(RNasi);
Per le preparazioni di RNA, per eliminare contaminazioni di DNA invece è
utilizzata la desossiribonucleasi (Dnasi).
Anche queste attività enzimatiche vanno poi eliminate inattivando con calore
o con fenolo-cloroformio
arricchire e rimuovere
La rimozione delle proteine dal lisato cellulare è particolarmente importante
sia perché
•tra le proteine sono presenti enzimi capaci di degradare gli acidi nucleici,
•per la presenza di proteine capaci di legarsi agli acidi nucleici
impedendone la funzione e/o la purificazione.
•I DNA possono essere metilati e gli enzimi di restrizione potrebbero
digerire male, si usano ceppi batterici “met “ mutanti oppure per studiare lo
stato di metilazione di cellule eucariotiche si usano enzimi isoschizzomeri
che digeriscono lo stesso sito ma solo se non è metilato e un altro che
digerisce comunque il sito met +/-
purificazione
le purificazioni non sono mai assolute, a seconda del grado di
purificazione si può parlare di arricchimento, separazione
Le proteine sono rimosse dalla preparazione mediante varie tecniche da usare in
combinazione, o l’una in alternativa all’altra.
- uso di enzimi proteolitici, come pronasi e proteinasi K.
- la Pronasi: miscela di almeno 4 enzimi proteolitici di cui due endopeptidasi
(serina- e metallo-proteasi) e due esopeptidasi (carbossi e ammino-petidasi).
-
la Proteinasi K, così detta per il suo potere di idrolizzare la cheratina, è una
endopeptidasi di origine fungina.
Gli enzimi proteolitici andranno poi eliminati di solito con fenolo cloroformio che
lascia in fase acquosa gli acidi nucleici.
fenolo cloroformio (alcohol isoamilico)
Estrazione con fenolo
[miscela di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1) pH 7.88.0, con pH acido si degrada il DNA e si estrae RNA]
E’ la tecnica comunemente utilizzata per rimuovere le proteine dagli
acidi nucleici, e consiste nel trattare la soluzione acquosa contenente
gli acidi nucleici con una miscela fenolo/cloroformio, immiscibile
(quasi) in acqua.
Tale procedura può essere usata da sola o dopo la digestione con
enzimi proteolitici, al fine di rimuoverli.
caratteristiche del fenolo
E’ un forte denaturante delle proteine che le lega mediante
legami H, alterandone la struttura.
Le proteine denaturate, con i gruppi idrofobici esposti,
diventano solubili nella fase fenolica o precipitano
all’interfase fenolo-acqua.
C6H5OH
E’ un solvente dei lipidi e delle molecole di RNA contenenti
lunghi tratti di poli(A).
Cloroformio
- completa la denaturazione delle proteine
- rimuove i lipidi
- grazie alla sua elevata densità facilita la separazione della fase
acquosa (contenente il DNA deproteinizzato) da quella organica (fenolica)
stabilizzando l’interfaccia tra le due fasi.
Alcol isoamilico: stabilizzante riduce la schiuma che si forma nel corso
dell’estrazione.
Fenolo instabile
Si ossida e si aggiungono degli antiossidanti per stabilizzarlo, è
tossico, è stato usato anche come disinfettante, brucia la pelle, si
neutralizza col sapone o con gli alcali, normalmente a pH 7.8
Dopo centrifugazione si ottengono tre fasi:
1) superiore, che contiene la soluzione di acidi nucleici;
2) interfase, di proteine denaturate;
3) inferiore, fase fenolica
contenente lipidi e proteine
Fase acquosa (DNA e RNA)
ricche di aminoacidi idrofobici.
Interfase (proteine denaturate)
Fase fenolica (proteine solubili)
precipitazione di A.N.
Uso dell’ isopropanolo per la precipitazione
vantaggio: uso di volumi inferiori (0,7 volumi per 5’ a Temp Amb)
svantaggio: meno volatile dell’etanolo e quindi di più difficile rimozione
Lavaggio del pellet
Dopo centrifugazione, il pellet di acido nucleico va “lavato” in etanolo 70% con
H2O e ricentrifugato. Tale lavaggio rimuove i sali precipitati e isopropanolo.
Risospensione del DNA
Il pellet dopo essiccazione è risospeso in adeguato tampone a bassa forza ionica, in
genere TE (Tris-EDTA) a pH 7.6-8.0, alla concentrazione desiderata
condizioni del DNA
Separazione di acidi nucleici tra di loro
Separazione del DNA plasmidico da quello genomico
Si sfruttano le differenze chimico-fisiche tra questi due tipi di macromolecole
plasmidi (3-8 kb) si trovano prevalentemente
in forma circolare super-avvolta (supercoiled)
in forma circolare rilassata
in forma lineare
nick
Plasmide superavvolto
(supercoiled)
Plasmide circolare
rilassato
Plasmide linearizzato
DNA cromosomale è presente sotto forma di grossi frammenti lineari (intorno a 25 Kpb e
oltre)
DNA plasmidico e nucleare
Per separare il DNA plasmidico da quello cromosomale
a) si innalza del pH del mezzo fino ad un valore di circa 12 o l’ebollizione della soluzione
per pochi minuti
b) si riporta la soluzione in condizioni normali (pH neutro o temperatura ambiente)
i plasmidi saranno in grado di rinaturarsi velocemente riassumendo una forma circolare
covalentemente chiusa
i frammenti cromosomali lineari non saranno in grado di rinaturare correttamente e si
aggregano dando luogo ad una massa reticolata insolubile che viene eliminata per
centrifugazione, lasciando il DNA plasmidico in soluzione.
maggior purezza
Alternativamente, la purificazione può essere effettuata mediante:
- Ultracentrifugazione in gradiente all’equilibrio di densità di cloruro di cesio-bromuro di etidio
Il bromuro d’etidio, si intercala tra le basi
del DNA, determinando un parziale
svolgimento della doppia elica.
DNA circolare chiuso e superavvolto
intercala una certa quantità di etidio limitata.
In questo caso la molecola assume una forma
più compatta, con il conseguente incremento
della densità di galleggiamento.
Molecole di DNA circolari rilassate e lineari
sono invece in grado di intercalare una
maggiore quantità di etidio che ne provoca
un maggior srotolamento. Di conseguenza il
DNA lineare sarà meno denso.
Le due differenti forme di DNA possono essere separate mediante ultracentrifugazione in
gradiente di densità di CsCl/EtBr, una tecnica di separazione che sfrutta le differenze di densità
delle diverse molecole. Questo DNA è altamente puro e utile per trasfezioni.
vari metodi e kit di estrazione
i kit piu’ utilizzati si basano sull’utilizzo
di:
matrici silicee: gli acidi nucleici si legano
alle particelle della matrice
differenti tipi di acido nucleico
adsorbono più o meno bene alla matrice
di silice, a seconda della forza ionica e
del pH della soluzione
dopo avere lavato la matrice silicea, gli
acidi nucleici sono eluiti con un tampone
a bassa concentrazione salina o con
acqua e sono pronti per le successive
reazioni