Progetto POM A32 “Norme fitosanitarie e commercializzazione delle produzioni vivaistiche”
Locorotondo (BA), 4 – 7 dicembre 2001
Sessione II
AGRUMI
COORDINATORE:
A. CATARA
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Fitosanitarie,
Università degli Studi di Catania
Progetto POM A32 “Norme fitosanitarie e commercializzazione delle produzioni vivaistiche”
Locorotondo (BA), 4 – 7 dicembre 2001
Organismi patogeni di qualità degli agrumi
D. Boscia, A. Ippolito, A. M. D’Onghia, F. Nigro, G. Romanazzi, N. Vovlas
PREMESSA
1. Funghi
1.1. Mal secco (Phoma tracheiphila)
1.2. Marciume radicale e gommosi del colletto degli agrumi
2. Nematodi
2.1. Tylenchulus semipenetrans
3. Virus ed agenti virus-simili
3.1. Virus della tristezza degli agrumi (CTV)
3.2. Virus della psorosi degli agrumi (CPsV)
3.3. Virus della variegatura infettiva degli agrumi (CIVV)
3.4. Concavità gommose
3.5. Impietratura
3.6. Cristacortite
3.7. Exocortite
3.8. Cachessia- xiloporosi
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Premessa
Il D.M. del 14/4/1997 (Recepimento delle Direttive della Commissione n. 93/48/CEE del 23
giugno 1993, n. 93/64/CEE del 5 luglio 1993 e n. 93/79/CEE del 21 settembre 1993), fornisce un
contributo di indiscutibile valenza, introducendo una nuova categoria di materiale di propagazione,
quella del CAC (Conformitas Agraria Comunitatis). Per l’ottenimento di materiale CAC il Decreto
detta precise norme riguardanti le caratteristiche dei materiali di moltiplicazione (requisiti
fitosanitari e di identità varietale), i punti critici del processo produttivo in vivaio e della produzione
del materiale di moltiplicazione, i requisiti di commercializzazione, gli obblighi del fornitore, ecc.
Relativamente alla definizione di “requisiti fitosanitari” di cui all’art. 5 e all’elenco dei
patogeni di “qualità” riportato nell’allegato II del D.M. del 14/4/1997 per gli agrumi, si è ritenuto
opportuno, sulla base dei dati disponibili in letteratura e, soprattutto, dell’esperienza maturata
nell’ambito del Progetto POM A32, precisare le specie dei funghi e dei nematodi nonché gli agenti
virali responsabili delle malattie citate nel suddetto D.M. (Tab. 1).
In particolare, per quanto riguarda i funghi sono state inserite le specie di Phytophthora,
responsabili del marciume radicale e della gommosi del colletto (P. nicotianae e P. citrophthora),
per i nematodi il Pratylenchus vulnus, mentre per i virus si è pensato di separare la psorosi dalle
malattie che inducono il mosaico a foglia di quercia (concavità gommose, cristacortite e
impietratura), essendo state acquisite maggiori conoscenze sulla sua eziologia e sul suo ruolo nella
induzione della maculatura anulare. Inoltre, si è ritenuto opportuno citare anche alcuni patogeni da
quarantena quali Phoma tracheiphila, agente del mal secco, e citrus tristeza virus, agente della
tristezza.
Per ciascun patogeno è stata realizzata una scheda riportante le informazioni circa
l’inquadramento sistematico, la distribuzione geografica, le piante ospiti, l’epidemiologia, la
sintomatologia indotta sulle piante, le modalità di diagnosi e i principi su cui si basa la lotta. Inoltre,
si è ritenuto utile indicare anche quegli aspetti che nel processo produttivo possono creare le
condizioni per una possibile infezione (punti critici), gli obblighi che vivaisti e Servizio
Fitosanitario devono rispettare e, infine, alcuni consigli pratici per gli agricoltori.
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Tabella 1. Malattie ed organismi pregiudizievoli la qualità del materiale di propagazione
previsti dall'allegato II del DM 14/04/1997 e proposta del progetto POM A32.
allegato ii
Proposta
dm 14/04/1997
progetto pom a32
Funghi
PHYTOPHTHORA SPP.
- MARCIUME RADICALE E
GOMMOSI:
PHYTOPHTHORA NICOTIANAE
PHYTOPHTHORA CITROPHTHORA
- MAL SECCO:
PHOMA TRACHEIPHILA
VIRUS ED ORGANISMI PATOGENI VIRUS-SIMILI
- Foglia rugosa
- Malattie che, sulle giovani
foglie inducono sintomi tipo
psorosi come:
Psorosi, Maculatura anulare
Cristacortite, Impietratura
- Foglia rugosa (CiLRV)
- Psorosi (CPsV)
- Malattie che, sulle giovani
foglie inducono sintomi di
maculatura a foglia di quercia:
Cristacortis
Impietratura
Concavità gommose
Concavità gommose
- Variegatura infettiva
- Esocortite
- Cachessia
- Variegatura infettiva (CIVV)
- Esocortite (CEVd)
- Cachessia (CCaVd)
NEMATODI
Meloidogyne spp.
Meloidogyne spp.
Tylenchulus semipenetrans
Pratylenchus vulnus,
Tylenchulus semipenetrans
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1. FUNGHI
1.1. Mal secco degli agrumi (Tav. I)
Gruppo tassonomico di appartenenza
Regno
Divisione
Sottodivisione
Classe
Ordine
Famiglia
Genere
Specie
Mycetae
Eumycota
Deuteromycotina
Coelomycetes
Sphaeropsidales
Sphaeropsidaceae
Phoma
P. tracheiphila (Petri) Kanc. et Ghik.
Malattia
Il mal secco, grave tracheomicosi degli agrumi, è causato da Phoma tracheiphila.
Distribuzione geografica
È una malattia diffusa in tutti i Paesi agrumicoli che si affacciano sul Mar Mediterraneo,
fatta eccezione per Spagna, Marocco ed Egitto, e sulle coste orientali del Mar Nero.
Modalità di diffusione
L’infezione avviene attraverso ferite della chioma e, meno frequentemente, dell’apparato
radicale. I picnoconidi, che si formano in autunno, sono responsabili delle infezioni autunnali ed
invernali mentre le infezioni che avvengono nel periodo estivo, soprattutto in seguito a grandinate,
sono da attribuire ai fialoconidi, prodotti da fialidi libere del micelio. La disseminazione del
patogeno avviene principalmente ad opera del vento.
Piante ospiti
P. tracheiphila è capace di infettare oltre che le specie del genere Citrus anche specie di altri
generi, come Poncirus, Severinia e Fortunella, nonché ibridi interspecifici e intergenerici. La
malattia, tuttavia, è maggiormente diffusa dove sono coltivati il limone (Tavola VIII, Figura 1), il
cedro, il bergamotto e la limetta. I casi di malattia ricordati su altre specie sono gravi soltanto
quando dovuti ad infezioni basali o radicali sul suscettibile arancio amaro, portinnesto di uso
generalizzato nell’agrumicoltura italiana.
Sintomatologia
I primi sintomi compaiono sui giovani rametti apicali, che manifestano decolorazione delle
foglie con ingiallimenti delle nervature cui segue in genere la caduta delle foglie stesse; il rametto
infetto, che può divenire anch’esso clorotico, infine dissecca (Tavola I, Figura 2). Il legno infetto
presenta una colorazione rossastra (Tavola I, Figura 3). Le infezioni radicali e basali possono
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causare il mal fulminante e il mal nero. Nel caso del mal fulminante la pianta collassa rapidamente,
mentre nel caso del mal nero l’incubazione della malattia è lunga, fino a parecchi anni, e le cerchie
legnose più vecchie manifestano una colorazione nerastra (Tavola I, Figura 4).
Diagnosi
La diagnosi può essere visiva in base ai sintomi prima descritti. Tuttavia, per la conferma è
necessario l’isolamento in piastra.
Lotta
La lotta si basa principalmente su interventi agronomici. E’ necessario tagliare
periodicamente i rami infetti almeno alcuni centimetri al di sotto della zona mostrante la tipica
colorazione rossastra del legno, bruciando il materiale di risulta. Ridurre le concimazioni azotate ed
evitare le lavorazioni al terreno da metà autunno a primavera inoltrata. La lotta chimica, consigliata
soprattutto sulle piante giovani e in vivaio, va effettuata con quattro trattamenti a cadenza mensile, a
partire dalla fine di ottobre. I principi attivi da utilizzare sono costituiti da ziram e rame;
quest’ultimo in genere non può essere utilizzato per più di un trattamento a causa della sua
fitotossicità.
Punti critici
per i vivaisti: nelle aree dov’è presente la malattia l’attività vivaistica, deve essere effettuata
sotto rete di plastica;
per gli agricoltori: realizzare i nuovi impianti con materiale di propagazione esente da mal
secco.
Obblighi
per i vivaisti: è vietata la commercializzazione di piante di agrumi colpite da mal secco;
per gli agricoltori: è obbligatorio il taglio e la distruzione col fuoco delle parti infette o
dell’intera pianta qualora questa sia irrimediabilmente compromessa.
per il Servizio Fitosanitario: attuare rigorosi controlli sul territorio, al fine di individuare gli
agrumeti colpiti dalla malattia.
Consigli pratici
Per gli agricoltori: per prevenire la malattia, in impianti adulti limitare le concimazioni azotate
e le potature eccessive; negli impianti giovani, in aggiunta, effettuare trattamenti
anticrittogamici in autunno-inverno.
Per il Servizio Fitosanitario Regionale: promuovere la divulgazione delle tecniche di difesa
atte a controllare la malattia, con particolare riferimento all’impiego di varietà resistenti.
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TAVOLA I
Fig. 1 – Pianta di limone affetta da mal secco. Si osservino i rami defogliati e
disseccati e la presenza di polloni alla base del tronco non ancora raggiunto dalla
malattia.
Fig. 2 – Rametti di limone defogliati e disseccati per infezioni di mal secco.
Fig. 3 – Colorazione rossastra del legno di rametti di limone con infezioni di mal
secco.
Fig. 4 – Imbrunimento interno del legno di una branca di limone affetto da mal secco.
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1.2. Marciume radicale e gommosi del colletto degli agrumi (Tav.II)
Gruppo tassonomico di appartenenza
Regno
Phylum
Classe
Ordine
Famiglia
Genere
Specie
Chromista
Oomycota
Oomycetes
Peronosporales
Pythiaceae
Phytophthora
P. nicotianae Breda de Haan
P. citrophthora (Sm. et Sm.) Leonian
Malattia
Il marciume radicale e la gommosi del colletto degli agrumi sono particolarmente gravi in
presenza di portinnesti suscettibili e di errate pratiche irrigue.
Distribuzione geografica
Le due malattie sono presenti in tutte le zone di coltivazione degli agrumi.
Modalità di diffusione
Entrambe le specie di Phytophthora vivono nel terreno dove, grazie a più forme di resistenza
(oospore, clamidospore), possono permanere vitali fino a 4-6 anni. L’infezione è causata dalle
zoospore, unità mobili dotate di flagelli, capaci di nuotare nell’acqua e giungere a contatto con
l’ospite. Le radichette sono attaccate nella zona di accrescimento, subito dietro la cuffia. Le
infezioni al colletto (gommosi) si hanno in seguito a piccole ferite sulla corteccia e quando il
colletto resta bagnato per oltre 18 ore. Metodi irrigui quali l’infiltrazione laterale da solchi, così
come il trasporto di terreno infetto da un campo all’altro mediante gli attrezzi di lavorazione,
concorrono a diffondere velocemente i propaguli del patogeno. L’impiego di materiale di
propagazione infetto, con pane di terra contaminato, rappresenta un metodo di diffusione di
Phytophthora anche a notevoli distanze.
Piante ospiti
Tutte e due le specie, ma più in particolare P. nicotianae, sono caratterizzate da una elevata
polifagia. Possono infettare i diversi portinnesti degli agrumi, anche se la suscettibilità varia con la
specie.
Sintomatologia
Per entrambe le malattie, i sintomi sulla chioma sono aspecifici e si manifestano con un
deperimento progressivo, clorosi diffusa, caduta delle foglie e disseccamento dei rametti (Tavola II,
Figura 1); la ripresa vegetativa è stentata, la fioritura debole, la fruttificazione ridottissima e
qualitativamente scadente.
Le radichette delle piante infette da marciume radicale sono poche, corte e bitorzolute
(Tavola II, Figure 2 e 4). Spesso le estremità si estraggono dal terreno prive del tessuto corticale, e
dove sono integre questo tessuto si distacca facilmente. Sulle radici più grosse si osservano leggeri
rigonfiamenti della corteccia per la formazione di sacche di gomma nella zona cambiale; la
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corteccia poi si spacca e si formano le caratteristiche lesioni ad “occhio di rana” (Tavola II, Figura
3).
La gommosi del colletto si manifesta con macchie d’umido sulla corteccia dalle quali
successivamente, attraverso delle screpolature, si hanno emissioni di gomma (Tavola II, Figura 5).
Diagnosi
La diagnosi del marciume radicale e della gommosi del colletto può essere effettuata
osservando i sintomi per ciascuna malattia prima descritti; tuttavia, è sempre necessaria una
conferma mediante isolamento del patogeno in piastra, su substrato selettivo, o mediante kit ELISA
o metodiche molecolari (PCR). Queste tecniche consentono di accertare la presenza dei patogeni sia
nei tessuti infetti, sia nel terreno.
Lotta
La lotta contro il marciume radicale e la gommosi del colletto viene praticata in maniera
preventiva con l’uso di materiale di propagazione sano e di portinnesti resistenti come l’arancio
amaro, i citrange “Troyer” e “Carrizo” e alcune selezioni di Poncirus. Per evitare la possibilità di
infezioni al colletto è preferibile tenerlo sconcato e libero da infestanti, praticare l’innesto ad
un’altezza di 60-70 cm dal colletto e adottare un sistema di irrigazione che non ne permetta la
bagnatura. Per ridurre il marciume delle radichette evitare, mediante drenaggio, il ristagno idrico e
adottare turni irrigui lunghi. La lotta chimica contro il marciume radicale si attua mediante
trattamenti al terreno con Metalaxyl o alla chioma con Phosetyl-Al. Sia preventivamente che
curativamente contro la gommosi spennellare il colletto e il basso tronco con prodotti a base di
Metalaxyl o di Phosetyl-Al. Entrambi i fungicidi, essendo sistemici, hanno un effetto eradicante;
efficaci sono anche prodotti a base di rame quando utilizzati in modo preventivo.
Punti critici
Per i vivaisti: usare substrati di coltivazione e terreni esenti da propaguli di P. nicotianae e P.
citrophthora e porre in atto tutti gli accorgimenti necessari per evitare infezioni. In
particolare, i contenitori (fitocelle) devono essere isolati dal terreno mediante uno strato di
ghiaia di almeno 10 cm; inoltre, è consigliabile la baulatura del terreno, per facilitare lo
sgrondo dell’acqua di irrigazione e di pioggia, e l’utilizzazione di acqua non contaminata da
propaguli del patogeno.
Per gli agricoltori: realizzare i nuovi impianti con materiale di propagazione sano; livellare il
terreno in modo da evitare i ristagni idrici superficiali e drenarlo contro il ristagno idrico
profondo.
Consigli pratici
Per gli agricoltori: contro la gommosi, evitare di bagnare il colletto durante l’irrigazione, la
crescita di erbe infestanti e l’accumulo del terreno alla base del tronco. Contro il marciume
radicale, ridurre la frequenza delle irrigazioni, rompere l’eventuale suola di coltivazione e
curativamente intervenire con prodotti sistemici.
per il Servizio Fitosanitario Regionale: controllare che in vivaio vengano adottate tutte le
norme di profilassi atte a ridurre le possibilità di contaminazione dei terreni e dei substrati.
Per gli eventuali controlli fitosanitari, ispezionare la zona del colletto per la presenza di
gomma e l’apparato radicale di piante con sintomi di deperimento.
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TAVOLA II
Fig. 1 – Forte defogliazione e disseccamento basipeto dei rametti in pianta di arancio
“Navelina” affetta da marciume radicale da Phytophthora spp.
Fig. 2 – Esito di infezioni di Phytophthora spp. su radici di arancio amaro di 2 anni di età. Si
noti la scarsità del capillizio radicale.
Fig. 3 – Vecchie lesioni da Phytophthora spp. su radici del portinnesto arancio amaro. Tali
lesioni sono dette ad “occhio di rana” per il loro particolare aspetto.
Fig. 4 – Radichette di arancio amaro affette da marciume radicale (a destra) a confronto con una
sana. Nelle radici infette il capillizio è quasi completamente assente.
Fig. 5 – Gommosi del colletto su tronco di arancio amaro innestato con limone. Al flusso
gommoso seguirà la necrosi della corteccia.
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2. NEMATODI
2.1. Tylenchulus semipenetrans Cobb, 1913 (Tav.III)
Premessa
La distribuzione geografica di questa specie coincide con la distribuzione della coltura di
agrumi sia in Italia che nel resto del mondo.
Gruppo tassonomico di appartenenza
Specie
Tylenchulus semipenetrans
Modalità di diffusione
Come tutti i nematodi, la diffusione avviene attraverso attrezzi da taglio, acqua e materiali di
propagazione.
Piante ospiti
L’ospite principale di questa specie è il genere Citrus., anche se particolari biotipi di questa
specie possono infettare altri generi non appartenenti alla famiglia delle Rutaceae. Vitis sp. e
Diospyros lotus sono stati rinvenuti come ospiti nell’area Mediterranea.
Sintomatologia
Le femmine adulte di questa specie sono parassiti obbligati che si nutrono della parte
corticale della radice in posizione semiendo-parassitica. Il sito di alimentazione di questa specie è
costituito da 4-5 cellule “nutrici”, molto specializzate, ad intensa attività metabolica.
Non si presentano alterazioni esterne alla radice.
Danni
Modificazioni anatomiche a carico dei tessuti corticali della radice.
Diagnosi
Identificazione a livello specifico basata sulla morfo-anatomia che esamina una serie di
parametri specifici sia degli stadi larvali che di esemplari adulti.
Lotta
Lotta preventiva con la preparazione di piante non infette utilizzando terricci e piante.
Norme fitosanitarie
Analisi nematologiche preventive e uso di materiale esente da nematodi sono le norme base
per la riuscita di un nuovo impianto.
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Tavola III
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3. VIRUS ED AGENTI VIRUS-SIMILI
3.1. Virus della tristezza degli agrumi (Tav. IV )
Inquadramento tassonomico:
Famiglia
Genere
Specie
Acronimo
Closteroviridae
Closterovirus
Citrus tristeza virus
CTV
Malattia
Tristezza degli agrumi. E’ una delle malattie maggiormente distruttive degli agrumi e
colpisce, in modo massiccio, la maggior parte delle specie coltivate. La sua denominazione deriva
dall’intristimento che si manifesta nelle piante colpite dalla malattia, quando innestate su arancio
amaro.
Distribuzione geografica
Il patogeno è presente, con incidenze variabili, in quasi tutte le regioni agrumicole del
mondo (Sud-Est Asiatico, Sud America, California, Florida, Spagna, Israele, Cipro, Turchia). In
Italia e Marocco per il momento sono stati segnalati solo alcuni focolai isolati. Di recente il virus è
stato rinvenuto anche in Albania, Egitto, Grecia, Libano e Palestina.
Modalità di diffusione
La Tristezza si diffonde in natura mediante diverse specie di afidi (Toxoptera citricida,
Aphis gossypii, A. spiraecola) con modalità di trasmissione semipersistente. La capacità e
l'efficienza di trasmissione variano a seconda della specie vettrice, dei ceppi del virus, delle piante
ospiti e del clima. Inoltre si trasmette, anche a grande distanza, attraverso il materiale di
propagazione infetto.
Piante ospiti
Può infettare tutte le specie di Citrus coltivate.
Sintomatologia sugli ospiti naturali
• “Deperimento rapido”: questo sintomo si manifesta in tutte le specie di agrumi innestate su
arancio amaro Il rilievo sintomatologico si esegue, oltrechè avendo riguardo all’aspetto
generale della pianta, anche effettuando un'incisione sulla corteccia ed aprendo una finestra
lungo la linea d’innesto per evidenziare il sintomo su arancio amaro di “inverse pitting”,
ossia di minute alveolature sulla faccia interna della corteccia alle quali corrispondono delle
estroflessioni puntiformi nel legno. Nello stesso punto è anche possibile osservare
l’imbrunimento della linea d’innesto dovuto alla necrosi dei vasi cribrosi. (estroflessioni
puntiformi sulla faccia cambiale del legno; minute alveolature sulla faccia cambiale della
corteccia).
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•
•
“Butteratura del legno”: si manifesta solo su alcune specie particolarmente suscettibili (es.
pompelmo e suoi ibridi, arancio amaro, arancio dolce e limetta). Si evidenzia scortecciando
sia il tronco sia i rami.
“Giallume dei semenzali”: rappresenta il ceppo più distruttivo della tristezza. I sintomi sui
semenzali di agrumi sono rappresentati da nanismo accentuato delle piante e da forte clorosi
sulle foglie.
Diagnosi
La diagnosi del patogeno, oltre che in campo, viene effettuata soprattutto per via sierologica
(ELISA e DTBIA) e biologica sull’indicatore limetta messicana. Sono anche disponibili altre
tecniche diagnostiche quali ibridazione molecolare, RT-PCR, dsRNA e immuno-microscopia.
Lotta
Impiego di materiale di propagazione sano; produzione di materiale di propagazione in
areali esenti da focolai di Tristeza; monitoraggio periodico delle aree di coltivazione delle specie
suscettibili ed eradicazione tempestiva di focolai d’infezione; attuazione delle norme contenute nel
Decreto di lotta obbligatoria contro il virus della Tristezza degli agrumi (D.M. del 22/11/1996).
Punti critici
Per i vivaisti: impiego esclusivo di materiali di moltiplicazione da piante madri risultate
esenti da CTV in seguito ad accertamenti mediante esame visivo, saggi di laboratorio e
saggi biologici. Ubicazione dei campi di piante madri e dei vivai in comprensori esenti da
Tristeza.
Per gli agricoltori: realizzazione dei nuovi impianti con materiali di propagazione garantiti
esenti dal virus. Immediata segnalazione di piante sospette alle Istituzioni preposte al
controllo fitosanitario.
Consigli pratici
Agricoltori: utilizzare materiale di propagazione certificato; evitare l’utilizzo di marze e di
piante di dubbia origine.
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TAVOLA IV
1
2
3
Fig. 1 – Deperimento di una pianta di mandarino (destra) affetta da Tristezza.
Fig. 2 – Scolorazione delle nervature causate dall’infezione da CTV sull’indicatore Limetta
messicana.
Fig. 3 – Minuscole alveolature (“inverse pitting”) sulla faccia interna della corteccia di
arancio amaro affetto da Tristezza.
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3.2. Virus della psorosi degli agrumi (Tav. V)
Inquadramento tassonomico
Genere
Ophiovirus
Specie
Citrus psorosis virus
Acronimo CPsV
Malattia
Psorosi degli agrumi (Psorosi A, Psorosi B, maculatura anulare).
Distribuzione geografica
Presente in tutte le aree agrumicole del mondo.
Modalità di diffusione
Come tutti i virus, CPsV si trasmette attraverso il materiale di propagazione agamica. In
America è stata osservata una diffusione naturale, ma il vettore non è stato individuato.
Piante ospiti
Può infettare tutte le specie di Citrus coltivate.
Sintomatologia sugli ospiti naturali
Il sintomo tipico, costituito da desquamazione corticale del tronco e talvolta delle branche,
con possibile formazione di depositi di gomma, si osserva prevalentemente su piante adulte con età
superiore ai 15 anni. Altri sintomi sono l’imbrunimento del legno, visibile sezionando le branche, e
un deperimento progressivo delle piante fino alla morte. Piante affette da psorosi sono meno
produttive, più sensibili al freddo e alla siccità, meno longeve. Sintomi fogliari sono le scolorazioni
perinervali che colpiscono la nuova vegetazione primaverile ed autunnale e scompaiono a maturità.
La sindrome nota come Psorosi B causa maculatura ad anello a carico dei frutti, delle foglie e talora
pustole sulla corteccia. L’infezione è spesso latente in molte aree agrumicole.
Diagnosi
Rilievo sintomatologico; ELISA; DTBIA; ibridazione molecolare e RT-PCR; saggio
biologico su piante indicatrici legnose (arancio dolce ‘Madame Vinous’ o ‘Navelina’ e Dweet
tangor ) che sviluppano, nell’arco di un mese, sintomi di scolorazioni perinervali sulle giovani
foglie spesso accompagnati da necrosi dei germogli (shock).
Lotta
Impiego di materiale di propagazione sano.
Punti critici
Per i vivaisti: marze da piante madri negative ai saggi biologici e di laboratorio.
Per gli agricoltori: realizzazione dei nuovi impianti con materiali di propagazione
garantiti esenti dal virus.
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Consigli pratici
Agricoltori: utilizzare piante certificate ed evitare l’utilizzo di materiali di
propagazione di dubbia origine.
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TAVOLA V
1
3
2
4
Fig. 1 – Particelle di CPsV osservate al microscopio elettronico.
Fig. 2 – Scolorazioni perinervali su foglie infette da CPsV.
Fig. 3 – Desquamazione corticale del tronco di pianta affetta da psorosi.
Fig. 4 – Desquamazione corticale delle branche di arancio dolce cv. Navelina affetta da
psorosi.
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3.3. Virus della variegatura infettiva degli agrumi (Tav.VI )
Inquadramento tassonomico
Famiglia
Genere
Specie
Acronimo
Bromoviridae
Ilarvirus
Citrus infections variegation virus
CIVV
Malattia
Variegatura infettiva, Foglia bollosa.
Distribuzione geografica
Presente in tutte le aree agrumicole del mondo.
Modalità di diffusione
CIVV si trasmette attraverso il materiale di propagazione agamica e,in maniera molto
limitata, con gli attrezzi di taglio e per seme.
Piante ospiti
Può infettare tutte le specie di Citrus coltivate.
Sintomatologia sugli ospiti naturali
I sintomi di variegatura sono caratterizzati dalla presenza di aree clorotiche e scolorazioni
più o meno evidenti della lamina fogliare ed in alcuni casi anche da veri e propri giallumi; la lamina
fogliare si presenta piuttosto allungata, con margine spesso ondulato ed irregolare, e con alcune
bollosità; viene definita “foglia bollosa” quando la lamina fogliare mostra una bollosità più
accentuata; i sintomi di bollosità e di scolorazioni si manifestano con maggior frequenza su limone
mentre i giallumi fogliari sono stati notati su alcune varietà di arancio e su pomelo. Non sempre
questi sintomi sono ascrivibili alla presenza di CIVV, ma potrebbero essere indotti da altri virus,
quali CiLRV. La variegatura infettiva è una malattia poco diffusa, che interferisce raramente su
sviluppo e produttività delle piante e sulle caratteristiche organolettiche dei frutti.
Diagnosi
Rilievo sintomatologico; ELISA; ibridazione molecolare; saggio biologico (limone Eureka,
cedro Etrog, limetta messicana).
Lotta
Impiego di materiale di propagazione sano e disinfezione degli attrezzi di taglio con
ipoclorito di sodio.
Punti critici
Per i vivaisti: marze da piante madri negative ai saggi biologici e di laboratorio.
Disinfezione degli attrezzi di taglio.
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Per gli agricoltori: realizzazione dei nuovi impianti con materiali di propagazione garantiti
esenti dal virus.
Consigli pratici
Agricoltori: utilizzare piante certificate ed evitare l’utilizzo di materiali di propagazione di
dubbia origine. Disinfezione degli attrezzi di taglio.
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TAVOLA VI
Margine ondulato e bollosità in foglie infette da CIVV.
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3.4. Concavità gommose (Tav.VII )
Agente eziologico
Malattia virus-simile ad agente causale sconosciuto.
Malattia
Unitamente all’impietratura ed alla cristacortite, appartiene al gruppo delle malattie che
inducono il sintomo denominato mosaico a “foglia di quercia” sulla nuova vegetazione primaverile.
Le concavità gommose e a sacche rappresentano ancora oggi un problema di rilievo nei vecchi
impianti, ove l’incidenza di piante affette è piuttosto elevata, con ripercussioni economiche di una
certa importanza per le produzioni insoddisfacenti sia sotto l’aspetto quantitativo che sotto l'aspetto
qualitativo.
Distribuzione geografica
Questa malattia è presente in tutte le aree agrumicole del mondo, sopratutto in quelle
mediterranee.
Modalità di diffusione
Si diffonde attraverso il materiale di propagazione agamica e non è esclusa la sua possibile
trasmissione per seme.
Piante ospiti
Può infettare tutte le specie di Citrus coltivate.
Sintomatologia sugli ospiti naturali
La malattia colpisce in modo evidente l’arancio dolce (soprattutto le cultivar del gruppo
Navel), il mandarino e il tangelo, in modo latente gli altri agrumi. I sintomi caratteristici si
manifestano sul tronco e sui rami principali e si possono estendere anche a quelli secondari. Essi
consistono in depressioni sia del legno che della corteccia con impregnazioni di gomma lungo le
cerchie legnose. Nei casi più gravi è possibile osservare rigonfiamenti del legno, anche sui piccoli
rametti, soprattutto nel punto d’inserzione con i rami più grossi, che si fessurano con forte
emissione di essudati gommosi. Sulle giovani foglie in primavera compare una maculatura clorotica
denominata mosaico a “foglia di quercia”, sintomo di notevole significato diagnostico e non solo
per questa malattia.
Diagnosi
In presenza di piante completamente asintomatiche, è necessario eseguire il saggio biologico
su arancio dolce (Navelina o Madam Vinous) e su tangerino Dweet che reagiscono manifestando, a
determinate condizioni di temperatura (22-24°C), la maculatura a foglia di quercia (comune anche
all’impietratura ed alla cristacortite). Se si ha necessità di diagnosticare in maniera specifica la
malattia si ricorre al saggio su tangelo, che però richiede tempi molto lunghi.
Lotta
L’impiego di materiale di propagazione sano è l’unico mezzo di controllo della malattia.
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Punti critici
Per i vivaisti: utilizzare marze provenienti da piante madri controllate mediante saggi
biologici.
Per gli agricoltori: realizzare nuovi impianti con materiali di propagazione garantiti esenti
dalla virosi.
Consigli pratici
Agricoltori: utilizzare piante certificate ed evitare l’utilizzo di materiali di propagazione di
dubbia provenienza.
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TAVOLA VII
1
2
Fig. 1 – Profonde depressioni del tronco, tipiche dell’affezione virale nota come “concavità
gommose”.
Fig. 2 – Mosaico a “foglia di quercia” su foglia di Navelina.
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3.5. Impietratura (Tav. VIII)
Agente eziologico
Malattia virus-simile ad agente causale sconosciuto.
Malattia
Impietratura. Il nome della malattia si riferisce all’alterazione che si evidenzia sui frutti che
si presentano duri come la pietra. Le perdite economiche negli impianti colpiti possono essere in
alcuni casi molto gravi per la riduzione qualitativa della produzione.
Distribuzione geografica
Malattia diffusa nei Paesi del bacino del Mediterraneo.
Modalità di diffusione
Come tutte le virosi, l’impietratura si trasmette attraverso il materiale di propagazione
agamica.
Piante ospiti
L’impietratura può colpire tutte le specie di Citrus coltivate. In Italia è stata riscontrata
soprattutto su arancio dolce e clementino.
Sintomatologia sugli ospiti naturali
La malattia provoca sui frutti delle protuberanze di colore verde, dure come la pietra, cui
corrispondono, nell’albedo, depositi di gomma che successivamente s’induriscono. I frutti mostrano
una pezzatura ridotta e la nuova vegetazione presenta la tipica maculatura “a foglia di quercia”.
Diagnosi
In presenza di piante completamente asintomatiche, è necessario eseguire il saggio biologico
su arancio dolce (Navelina o Madam Vinous) e su tangerino Dweet che reagiscono manifestando, a
determinate condizioni di temperatura (22-24°C), la maculatura a foglia di quercia (comune anche
alle concavità gommose ed alla cristacortite). Se si ha necessità di diagnosticare in maniera
specifica la malattia si ricorre al saggio su pompelmo, che però richiede tempi molto lunghi.
Lotta
L’impiego di materiale di propagazione sano è l’unico mezzo di controllo della malattia.
Punti critici
Per i vivaisti: utilizzare marze provenienti da piante madri controllate mediante saggi
biologici.
Per gli agricoltori: realizzare nuovi impianti con materiali di propagazione garantiti
esenti dalla virosi.
Consigli pratici
Agricoltori: utilizzare piante certificate ed evitare l’utilizzo di materiali di
propagazione di dubbia origine.
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TAVOLA VIII
Malformazione dei frutti di piante affette da impietratura.
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3.6. Cristacortite (Tav. IX )
Agente eziologico
Malattia virus-simile ad agente causale sconosciuto
Malattia
Cristacortite (cristacortis).
La denominazione della malattia deriva dal principale sintomo attraverso il quale si manifesta sul
tronco e sui rami delle piante infette, che tuttavia appaiono normali o con sviluppo leggermente
ridotto. Risulta molto diffusa sia nei vecchi impianti che in quelli giovani, con incidenze che, in
alcuni casi, si aggirano intorno al 50% e con danni che vanno ad incidere sia sullo sviluppo
vegetativo che sulla produttività. Anche la cristacortite, unitamente all’impietratura ed alle
concavità gommose, appartiene al gruppo delle malattie che producono, sulla nuova vegetazione
primaverile, il sintomo denominato mosaico a “foglia di quercia”.
Distribuzione geografica
Questa malattia finora si è manifestata solo nei Paesi del bacino del Mediterraneo.
Modalità di diffusione
La cristacortite si trasmette, come tutte le malattie virus-simili, attraverso il materiale di
propagazione agamica.
Piante ospiti
Può infettare tutte le specie di Citrus coltivate.
Sintomatologia sugli ospiti naturali
E' possibile osservare i sintomi tipici prevalentemente sugli organi legnosi del portinnesto
arancio amaro. Essi consistono in creste prominenti dalla faccia inferiore della corteccia cui
corrispondono alveolature nel legno, alla base delle quali si formano depositi di gomma. Lo
sviluppo della gomma in senso radiale sulla sezione trasversale del legno è sintomo di elevato
valore diagnostico. In primavera sulle foglie giovani si osservano le tipiche maculature a foglia di
quercia.
Diagnosi
In presenza di piante completamente asintomatiche, è necessario eseguire il saggio biologico
su arancio dolce (Navelina o Madam Vinous) e su tangerino Dweet che reagiscono manifestando, a
determinate condizioni di temperatura (22-24°C), la maculatura a foglia di quercia (comune anche
all’impietratura ed alle concavità gommose). Se si ha necessità di diagnosticare in maniera specifica
la malattia si ricorre al saggio su tangelo, che però richiede tempi molto lunghi.
Lotta
Il controllo alla malattia si attua attraverso l’impiego di materiale di propagazione sano.
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Punti critici
Per i vivaisti: utilizzare marze provenienti da piante madri controllate mediante saggi
biologici.
Per gli agricoltori: realizzare nuovi impianti con materiali di propagazione garantiti esenti
dalla virosi.
Consigli pratici
Agricoltori: utilizzare piante certificate ed evitare l’impiego di materiali di propagazione di
dubbia origine.
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TAVOLA IX
1
2
Fig. 1 – Sintomi esterni di cristacortite (infossature del tronco).
Fig. 2 – Creste prominenti dalla faccia inferiore della corteccia cui corrispondono
alveolature nel legno, alla base delle quali si osservano depositi di gomma.
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3.7. Esocortite (Tav. X)
Inquadramento tassonomico
Famiglia
Genere
Specie
Acronimo
Pospiviroidae
Pospiviroid
Citrus exocortis viroid
CEVd
Malattia: Esocortite
Distribuzione geografica
Malattia presente in tutte le aree agrumicole del mondo.
Modalità di diffusione
Come tutte le malattie da viroidi, l’exocortite si trasmette attraverso il materiale di
propagazione agamica e gli attrezzi di taglio.
Piante ospiti
Può infettare tutte le specie di Citrus coltivate. Altre varianti possono infettare il pomodoro,
generando una malattia denominata “Indian bunchy top”, e la vite.
Sintomatologia sugli ospiti naturali
Riduzione di sviluppo, desquamazione e fessurazione della corteccia del tronco di piante
adulte di arancio trifogliato, di alcuni suoi ibridi, di limetta di Rangpur, di limetta di Tahiti e di
limetta messicana. La maggior parte degli agrumi commerciali (arancio dolce, mandarino,
pompelmo, limone) sono quasi sempre asintomatici, a differenza del cedro che è invece
particolarmente suscettibile. Tra i portinnesti, l’arancio amaro, il limone rugoso, l’alemow, il
limone volkameriano e il mandarino di Cleopatra sono tolleranti.
Diagnosi
Saggio biologico su cedro Etrog. Impiego di pomodoro Rutgers, crisantemo e Gynura
aurantiaca per inoculazione mediante trasmissione meccanica o taglio. Ibridazione molecolare, RTPCR e saggio elettroforetico (r-PAGE e dPAGE)
Lotta
Impiego di materiale di propagazione sano e disinfezione degli attrezzi di taglio con
ipoclorito di sodio.
Punti critici
Per i vivaisti: marze da piante madri negative ai saggi biologici e di laboratorio, disinfezione
degli attrezzi di taglio.
Per gli agricoltori: realizzazione dei nuovi impianti con materiali di propagazione garantiti
esenti dal patogeno.
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Consigli pratici:
Agricoltori: utilizzare piante certificate ed evitare l’utilizzo di materiali di propagazione di
dubbia origine; disinfettare gli attrezzi di taglio
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TAVOLA X
1
2
Fig. 1 – Fessurazione della corteccia del tronco di arancio trifogliato infetto dal viroide
dell’esocortite (da C.N. Roistacher, Graft-trasmissible diseases of citrus, FAO).
Fig. 2 – Desquamazione della corteccia del portinnesto limetta di Rangpur affetto da
exocortite (da C.N. Roistacher, Graft-trasmissible diseases of citrus, FAO).
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3.8. Cachessia-Xiloporosi (Tav. XI)
Inquadramento tassonomico
Famiglia
Genere
Specie
Acronimo
Pospiviroidae
Hostuviroid
Hop stunt viroid (variante “Citrus cachexia viroid”)
HSVd (variante CCaVd)
Malattia/Avversità
La cachessia-xiloporosi è asintomatica nella maggior parte delle specie commerciali (arancio
dolce, pompelmo, limone) e dei portinnesti, mentre colpisce gli agrumi mandarino e mandarinosimili.
Distribuzione geografica
La malattia è stata segnalata in tutte le aree agrumicole del mondo.
Modalità di diffusione
Come tutte le malattie da viroidi, la cachessia-xiloporosi si trasmette attraverso il materiale
di propagazione agamica e gli attrezzi di taglio.
Piante ospiti
Può infettare tutte le specie di Citrus coltivate.
Sintomatologia sugli ospiti naturali
La cachessia induce formazione di gomma nella corteccia con alveolature nel legno di piante
di mandarino e suoi ibridi. Sintomi analoghi si possono manifestare anche su limetta dolce di
Palestina.
Diagnosi
Saggio biologico su mandarino Parson’s Special innestato su limone rugoso. Trasmissione
meccanica su cetriolo cv Suyo. Ibridazione molecolare, RT-PCR e saggio elettroforetico (r-PAGE e
dPAGE).
Lotta
Impiego di materiale di propagazione sano e disinfezione degli arnesi da taglio con
ipoclorito di sodio.
Punti critici
Per i vivaisti: marze da piante madri negative ai saggi biologici e di laboratorio,
disinfezione degli attrezzi di taglio.
Per gli agricoltori: realizzazione dei nuovi impianti con materiali di propagazione
garantiti esenti dal patogeno.
Consigli pratici:
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Agricoltori: utilizzare piante certificate ed evitare l’utilizzo di materiali di
propagazione di dubbia origine e disinfettare gli attrezzi di taglio
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TAVOLA XI
Fig. 1 – Formazione di gomma nella corteccia in prossimità del punto d’innesto,
su pianta affetta da cachessia.
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Presentazione dei poster riguardanti la messa a punto e validazione di
protocolli di monitoraggio, di campionamento, di diagnosi,
produzione e standardizzazione di reagenti per corredi diagnostici,
ecc.
M. Salerno
Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata
Università degli Studi di Bari
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Diagnosi nel terreno dei vivai, mediante Scorpion-PCR, di Phytophthora nicotianae e di P.
citrophthora, agenti del marciume radicale e della gommosi degli agrumi.
Ippolito A., Schena L., Nigro F., Kukhun W., Murolo S., Salerno M.
Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata, Università degli Studi di Bari
Riassunto
Per la diagnosi nel terreno dei patogeni responsabili del marciume radicale e della gommosi
del colletto degli agrumi, due coppie di primer specifiche per Phytophthora nicotianae (Pn6-Pn5) e
per P. citrophthora (Pc2B-Pc7), sono state modificate per ottenere due primer Scorpion (Pn6
Scorpion e Pc2B Scorpion). Tali coppie hanno conservato la specificità emettendo un segnale
fluorescente solo in caso di amplificazione del DNA bersaglio e non del DNA estratto da colture
pure di 150 isolati fungini appartenenti a diversi generi e specie, ivi compresi 14 specie di
Phytophthora. Le coppie di primer Pn6 Scorpion-Pn5 e Pc2B Scorpion-Pc7, in PCR multipla,
hanno permesso l’identificazione contemporanea di P. citrophthora e di P. nicotianae; tuttavia, la
prima coppia ha indotto un incremento di fluorescenza anche in presenza di DNA di P. cactorum.
Due amplificazioni separate e consecutive, utilizzando nella prima due primer (Ph2-ITS4)
amplificanti DNA da tutte le specie di Phytophthora e nella seconda i primer Pn6 Scorpion-Pn5 e
Pc2B Scorpion-Pc7 (nested Scorpion-PCR), hanno incrementato notevolmente la sensibilità della
reazione. Per la diagnosi dei due patogeni nel terreno sono state sviluppate tecniche di estrazione
del DNA che hanno consentito l’ottenimento di acidi nucleici sufficientemente puliti da terreni
naturalmente infestati. Combinando nested Scorpion-PCR ed estrazione del DNA direttamente dal
terreno infestato è stato possibile, nell’arco di un solo giorno, diagnosticare entrambi i patogeni. Il
livello di sensibilità accertato è risultato uguale ed in alcuni casi maggiore di quello ottenibile con la
diagnosi tradizionale basata sull’impiego di substrati selettivi.
Summary
Two primer pairs, specific for Phytophthora nicotianae (Pn6-Pn5) and P. citrophthora
(Pc2B-Pc7), were modified to obtain two Scorpion primers (Pn6 Scorpion and Pc2B Scorpion) for
real-time detection of the pathogens in citrus nursery soils. Both primers confirmed their specificity
identifying P. nicotianae and P. citrophthora among 150 fungal isolates belonging to several genera
and species, including 14 different Phytophthora species. Multiplex PCR with modified primers on
DNA from pure cultures allowed concurrent identification of both species of Phytophthora;
however, a slight fluorescence increase was observed with DNA from P. cactorum. A simple and
rapid procedure for direct DNA extraction from soil was developed to yield DNA of purity and
quality suitable for PCR assays. Combining this protocol with a double amplification (nested PCR)
using primer Ph2-ITS4 (amplifying DNA from all Phytophthora species) and Pn6 Scorpion-Pn5
and Pc2B Scorpion-Pc7 (second amplification) it has been possible the real time detection of P.
nicotianae and P. citrophthora from soils. The level of sensitivity was similar and even higher,
compared to the traditional detection method based on the use of selective media.
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INTRODUZIONE
Il marciume radicale e la gommosi del colletto causati da Phytophthora spp. sono le malattie
più diffuse e dannose degli agrumi. Delle due Phytophthorae responsabili delle malattie in Italia, P.
nicotianae Breda de Haan [sin. P. nicotianae Breda de Haan var. parasitica (Dast) Watherh.] è più
frequente in Puglia, Basilicata e Calabria, mentre P. citrophthora (Sm. et Sm.) Leonian è
maggiormente presente in Sicilia (Ippolito et al., 1997). Quest’ultima risulta più frequentemente
associata alla gommosi del colletto. La lotta contro queste malattie molto si giova dell’uso di
materiale di propagazione sano, nonché di terreno privo di propaguli dei patogeni e le recenti
normative al riguardo (D.M. del 14/4/1997) forniscono gli strumenti operativi per la produzione di
materiale agrumicolo esente da infezioni e da propaguli di P. nicotianae e P. citrophthora. Per la
diagnosi di questi patogeni è di fondamentale importanza la disponibilità di metodiche affidabili,
rapide e di facile applicazione. Le tecniche correntemente utilizzate per la diagnosi di Phytophthora
spp. nel terreno e nei tessuti, basate sull’uso di substrati selettivi, sono laboriose e richiedono tempo
e personale specializzato; i kit commerciali ELISA, pur se affidabili e di facile impiego, sono meno
sensibili e al momento non permettono l’identificazione delle specie coinvolte. Recentemente sono
state sviluppate tecniche di diagnosi basate sulla reazione a catena della polimerasi (PCR), che
hanno consentito la diagnosi e l’identificazione di numerosi funghi fitopatogeni, inclusi P.
nicotianae e P. citrophthora (Ippolito et al., 2000). L’uso della PCR per l’analisi su larga scala è
però ancora limitato da operazioni di post-amplificazione, come ad es. elettroforesi e colorazione
degli acidi nucleici con bromuro di etidio, che la rendono laboriosa e pericolosa per gli operatori.
Tali inconvenienti possono essere superati mediante l’uso di recenti tecniche di PCR (Taq-man,
Molecular beacons, Scorpion-PCR) che consentono l’identificazione in tempo reale dell’amplificato
attraverso l’emissione di un segnale fluorescente (Finetti Sialer e Gallitelli, 2001). Tali tecniche,
dispensando gli operatori dalle operazioni di post-amplificazione, rendono l’analisi più veloce e
sicura, e, inoltre, possono consentire la realizzazione di ricerche di tipo quantitativo. In particolare,
la Scorpion-PCR (Whitecombe et al., 1999) sembra essere molto promettente (Thewell et al.,
2000) ed è stata utilizzata in patologia vegetale per il monitoraggio di microrganismi agenti di lotta
biologica (Schena et al., 2000 e 2001) e per la diagnosi di funghi e virus fitopatogeni (Finetti Sialer
e Gallitelli, 2001). Scopo del lavoro è la messa a punto di una metodica per l’identificazione di P.
nicotianae e di P. citrophthora mediante PCR in tempo reale (Scorpion-PCR) nel terreno dei vivai
dove è sufficiente il loro rilevamento ai fini della diagnosi della malattia (Ippolito et al., 1991).
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MATERIALI E METODI
Identificazione in tempo reale di P. nicotianae e P. citrophthora
L’identificazione in tempo reale di P. nicotianae e
P. citrophthora è stata realizzata
utilizzando due coppie di primer specifiche per P. nicotianae (Pn6-Pn5) e per P. citrophthora
(Pc2B-Pc7) (Ippolito et al., 2001). I primer Pn6 e Pc2B sono stati modificati dalla Oswel Research
Products Ltd. (Southampton, UK) per sviluppare due primer Scorpion (Pn6 Scorpion e Pc2B
Scorpion) che consentono l’identificazione dell’amplificato in tempo reale attraverso l’emissione di
un segnale fluorescente (Whitecombe et al., 1999). Al fine di consentire l’identificazione
contemporanea di entrambe le specie (PCR multipla) i primer Pn6 Scorpion e Pc2B Scorpion, sono
stati marcati con due fluorofori diversi,
Fam (carboxy fluorescein)per P. nicotianae
e Rox
(carboxy X-rhodamine) per P. citrophthora. La specificità dei primer Scorpion è stata valutata
utilizzando un’ampia collezione di funghi presenti nel terreno (150 isolati) di generi e specie
diverse, ivi comprese 14 specie di Phytophthora. Le reazioni di PCR sono state condotte in un
volume totale di 25 µl contenente 100 ng di DNA totale, 10 mM Tris-HCl (pH 9), 50 mM KCl,
0,1% Triton X-100, 100 µM di ciascun dNTPs, 1 mM MgCl2, 1 unità di DNA polimerasi (Taq
DNA polymerase, Promega Corporation, WI, USA) e 2 µM dei primer convenzionali (Pn5 e Pc7) e
0,3 µM dei primer Scorpion (Pc2B Scorpion e Pn6 Scorpion). L’amplificazione è consistita in una
fase iniziale di denaturazione a 94°C per 5 min seguita da 40 cicli di 45 s a 94°C e 45 s di
appaiamento-sintesi a 50°C. Condizioni di maggiore stringenza sono state valutate solo per la
coppia di primer Pn6 Scorpion-Pn5; in questo caso la fase di appaiamento-sintesi è stata realizzata a
62°C. La fluorescenza è stata monitorata in tempo reale sia per Fam, sia per Rox, utilizzando uno
specifico termociclatore (BIO-RAD iCycler Thermal Cycler) che consente la lettura dei livelli di
fluorescenza ad ogni ciclo durante la fase di appaiamento-sintesi. Il valore di Ct (Cycle threshold),
ovvero il ciclo di PCR al quale il segnale fluorescente di uno specifico campione diventa
significativamente più elevato della fluorescenza di base (threshold), comune a tutti i campioni, e
misurata nei primi cicli di PCR è stato calcolato automaticamente dal “software” iCycler Thermal
Cycler a corredo dell’apparecchiatura.
Al fine di valutare la sensibilità delle reazioni sono state preparate diluizioni decimali (1 ng µl-1,
100 pg µl-1, 10 pg µl-1, 1 pg µl-1 e 100 fg µl-1) di DNA estratto da colture pure di P. nicotianae e P.
citrophthora e sono state amplificate utilizzando le coppie di primer precedentemente descritte,
nella stessa miscela di reazione (PCR multipla) o in miscele separate. L’amplificazione è stata
condotta utilizzando le stesse miscele di reazione prima descritte, ed una temperatura di
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appaiamento-sintesi di 50°C (primer Pc2B Scorpion-Pc7 e PCR multipla) o 62°C (primer Pn6
Scorpion-Pn5).
Diagnosi di P. citrophthora e P. nicotianae nel terreno
La diagnosi di P. nicotianae e P. citrophthora è stata realizzata in due differenti periodi
dell’anno (febbraio e luglio), su terreni prelevati da fitocelle ospitanti semenzali di arancio amaro di
circa due anni di età, provenienti da diversi vivai dell’Italia meridionale. Nel mese di febbraio i
campioni sono stati prelevati dal vivaio A (4 campioni), B (5 campioni), C (1 campione) ed S (2
campioni). A luglio i campioni sono stati prelevati dal vivaio A (3 campioni), B (4 campioni), D (3
campioni) ed E (2 campioni). In entrambe le serie di saggi sono stati inseriti tre campioni (LS1,
LS2, LS3) prelevati da terreni coltivati costantemente a graminacee. Ciascun campione da vivaio
consisteva di circa 500 g di terreno prelevato da almeno tre differenti fitocelle. Da ogni campione,
dopo accurato rimescolamento e setacciamento attraverso un vaglio con maglia da 2 mm, sono state
prelevate tre repliche di 0,5 g di terreno ciascuna, sottoposte all’estrazione del DNA e successiva
purificazione, seguendo il protocollo riportato da Schena et al. (2001). Per ciascun campione, 1 µl
di DNA è stato amplificato mediante Scorpion-PCR utilizzando una singola coppia di primer (Pn6
Scorpion-Pn5 o Pc2B Scorpion-Pc7) o due coppie di primer (nested PCR). Nella nested PCR la
prima amplificazione è stata realizzata con la coppia Ph2-ITS4, amplificante un frammento di
DNA, comprendente la regione bersaglio dei primer Pn6 Scorpion-Pn5 e Pc2B Scorpion-Pc7 (usati
nella seconda amplificazione), da tutte le specie di Phytophthora saggiate (Ippolito et al., 2001), ivi
comprese P. nicotianae e P. citrophthora.
Amplificazione in tempo reale ed analisi dei risultati sono state realizzate come descritto nel
paragrafo precedente.
RISULTATI E DISCUSSIONE
La specificità delle coppie di primer Pn6 Scorpion-Pn5 e Pc2B Scorpion-Pc7 è stata
valutata, in PCR multipla, utilizzando un elevato numero di specie fungine ed una temperatura di
appaiamento-sintesi di 50°C. In queste condizioni i primer Pc2B Scorpion-Pc7 sono risultati
specifici di P. citrophthora, determinando un significativo incremento di fluorescenza solo in
presenza di DNA di P. citrophthora (Fig. 1A). I primer Pn6 Scorpion-Pn5, nelle indicate condizioni
di amplificazione, hanno indotto un incremento di fluorescenza in presenza di DNA degli isolati di
P. nicotianae, ma anche di P. cactorum (Fig. 1B), sebbene il livello della fluorescenza sia stato
costantemente più basso per quest’ultima specie (Fig. 1B). Tuttavia, quando la temperatura di
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appaiamento-sintesi è stata portata a 62°C la coppia di primer è risultata specifica, identificando
solo P. nicotianae (Fig. 2). La separazione su gel di agarosio e la colorazione con bromuro di etidio
delle miscele di reazione utilizzate per le analisi in tempo reale hanno confermato l’amplificazione
di frammenti delle dimensioni attese solo per i campioni risultati positivi con l’analisi in tempo
reale (dati non mostrati). La sensibilità della reazione è stata valutata sia utilizzando le due coppie
di primer in miscele di reazione separate, sia utilizzandole insieme (PCR multipla). Il livello di
sensibilità rilevato è stato di 10 pg/µl (Pn6 Scorpion-Pn5) e di 100 pg/µl (Pc2B Scorpion–Pc7) nella
PCR multipla ed è arrivato ad 1pg/µl per entrambe le coppie di primer quando utilizzate
separatamente (dati non mostrati).
500
Fig.
A
Fluorescenza (Rox)
400
Identificazione
Phytophthora
300
P. citrophthora
di
citrophthora
isolati
(A)
e
di
P.
nicotianae (B) mediante PCR multipla in
200
tempo
100
Soglia
Altre specie di
Phytophthora
1200
1000
40
38
36
34
32
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
8
-100
10
6
4
2
0
Fluorescenza (Fam)
1.
Cicli di PCR
con
temperatura
di
appaiamento-sintesi di 50°C. In A è
riportata la fluorescenza (Rox) ottenuta
amplificando DNA di P. citrophthora a
B
P. nicotianae
confronto con quella ottenuta con altre
specie appartenenti allo stesso genere; in B
800
la
600
P. cactorum
400
200
Soglia
40
38
36
34
32
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
-200
reale
Altre specie di
Phytophthora
fluorescenza
(Fam)
ottenuta
amplificando DNA di P. nicotianae a
confronto con P. cactorum e altre specie di
Phytophthora.
Cicli di PCR
L’uso della PCR multipla con cui in una sola reazione è possibile individuare e identificare
contemporaneamente la presenza di P. nicotianae e di P. citrophthora è di indubbio vantaggio nella
diagnosi degli agenti del marciume radicale degli agrumi. Tuttavia, la minore sensibilità e
l’identificazione, con la temperatura di appaiamento-sintesi di 50°C, anche di P. cactorum hanno
determinato, in prove preliminari con DNA estratto direttamente da matrice infetta, risultati di
difficile interpretazione (dati non mostrati). I primer Scorpion individuati, pertanto, possono essere
utilizzati efficacemente per l’identificazione rapida e contemporanea delle due specie previo
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Locorotondo (BA), 4 – 7 dicembre 2001
isolamento in purezza, mentre per la diagnosi dei patogeni direttamente da matrice infetta sembra
preferibile una loro utilizzazione in reazioni separate.
1100
Fig. 2. Identificazione di isolati di P.
Fluorescenza (Fam)
900
nicotianae mediante PCR in tempo reale
P. nicotianae
700
con temperatura di appaiamento-sintesi di
500
300
62°C. Con questa temperatura sono stati
P. cactorum
100
S oglia
ottenuti
incrementi
di
fluorescenza
-300
40
38
36
34
32
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
8
10
6
4
2
-100
specifici per P. nicotianae.
Cicli di PC R
Nei terreni esaminati P. nicotianae è risultato il patogeno maggiormente presente, con valori
fino a 328 propaguli per grammo di terreno (Fig 3A, Fig. 4); mentre P. citrophthora, con valori
molto bassi, è stata riscontrata solo in due campioni analizzati nel primo esperimento. Nei terreni
coltivati a graminacee (LS3, LS4 e LS5), utilizzati come testimoni negativi, non sono stati
riscontrati propaguli dei due patogeni.
Da tutti i terreni è stato estratto il DNA ed analizzato mediante PCR Scorpion per rilevare la
presenza di P. nicotianae e/o P. citrophthora. In entrambe le serie di saggi (febbraio e luglio) non è
stato rilevato alcun incremento di fluorescenza dopo una singola amplificazione con i primer
Scorpion (dati non mostrati), mentre l’incremento è risultato evidente quando è stata applicata la
nested PCR, utilizzando come stampo l’amplificato ottenuto con i primer Ph2-ITS4. In particolare,
nel primo saggio un significativo incremento di fluorescenza è stato rilevato per tutti i campioni
risultati infestati da P. nicotianae (Fig. 3A). Il ciclo soglia (Ct), nel complesso, ha mostrato valori
inversamente proporzionali rispetto al livello di propaguli del patogeno presenti nel terreno (Fig.
3A). Un significativo incremento di fluorescenza è stato anche rilevato per i due campioni di terreno
risultati infestati da P. citrophthora (C1 e B6) e per altri tre (A2, B1 e B2) risultati non infestati con
l’analisi tradizionale basata sull’uso di substrati selettivi (Fig. 3B). Nella seconda serie di saggi,
concordemente con i risultati dell’isolamento su substrato selettivo, non è stato rilevato alcun
incremento di fluorescenza per P. citrophthora (dati non mostrati); un significativo aumento di
fluorescenza, invece, è stato ottenuto per tutti i campioni infestati da P. nicotianae con valori di Ct
risultati, nel complesso, più elevati per i campioni con un basso numero di propaguli. In tutti i saggi
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per i terreni coltivati a graminacee (LS1, LS2 e LS3) non è stato riscontrato alcun incremento di
fluorescenza.
In base ai risultati ottenuti, è apparso evidente che un solo ciclo di amplificazione non è
sufficiente per il rilevamento di significativi incrementi di fluorescenza. L’applicazione di due
amplificazioni consecutive (nested), di cui la seconda con l’uso di primer Scorpion, ha invece
permesso di individuare e nello stesso tempo di identificare le Phytophthorae presenti nei campioni
esaminati. La possibilità di utilizzare una prima amplificazione (primer Ph2-ITS4), comune a
entrambe le specie di Phytophthora, inoltre, riduce il numero di reazioni necessarie.
I risultati ottenuti, e in particolare i valori del ciclo soglia (Ct), sembrano mettere in evidenza una
chiara corrispondenza fra incremento di fluorescenza e livello di propaguli delle specie di
Phytophthora. Ulteriori studi sono necessari per la costruzione di curve di taratura che potrebbero
permettere la stima della concentrazione dei propaguli del patogeno bersaglio. Una analisi
quantitativa, oltre che qualitativa, potrebbe essere di notevole importanza, considerato che in piante
adulte Phytophthora è in grado di procurare danno solo quando si supera la soglia di 15-30
propaguli per grammo di terreno, in relazione al portinnesto utilizzato (Lutz e Menge, 1986;
Ippolito et al., 1991).
30
A
2
2 ,1
30
16
35
0
A
0
14
0
0
0
0
0
0
P. citrophth ora
0
0
12
59
3 28
0
0
0
0
10
30
0
P. citrophth ora
B
28
26
2
1
24
24
22
22
20
20
18
18
16
16
14
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
B7
B8
D1
D5
D10
E1
E10
L S1
L S2
L S3
10
B5
12
B4
0
A10
S2
0
A7
0
LS3
0
LS2
0
L S1
C1
0
B8
B7
B6
B2
B1
A7
A6
0
0
S1
14
0
0
A1
10
32
1 50
16
1 01
10
30
21
1 79
18
65
14
12
25
20
18
18
26
10
22
20
28
14
9
24
2 ,4
22
12
Ciclo soglia (C t)
26
24
P. n icotianae
B
28
A3
26
30
P. nicotianae
A2
Ciclo soglia (C t)
28
Fig. 3. Diagnosi di Phytophthora nicotianae e P. citrophthora mediante nested PCR in tempo reale in terreni
prelevati a febbraio (A) e luglio (B). Ciascuna barra rappresenta il ciclo di PCR (Ct) al quale il livello di
fluorescenza ha superato la fluorescenza di base comune a tutti i campioni. La mancanza di barra indica il
mancato incremento di fluorescenza oltre il valore soglia. Su ciascuna barra è riportato il numero di
propaguli per grammo di terreno rilevato mediante isolamento su substrato selettivo.
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Anche nei vivai il numero di propaguli del patogeno è proporzionale al danno dell’apparato
radicale; tuttavia, ai fini della produzione del materiale di propagazione è nostra convinzione che,
nonostante le nuove normative europee recepite dal D.M. del 14 aprile 1997 non siano precise al
riguardo, il patogeno debba essere assente nella pianta e nel pane di terra che l’accompagna all’atto
della commercializzazione. Nella rilevazione della “presenza-assenza” dei due patogeni il metodo
messo a punto sembra già soddisfare pienamente le esigenze di diagnosi, considerato che la
sensibilità è pari e anche superiore (nel caso di P. citrophthora) a quella del metodo della diluizione
in piastra con l’uso di substrati selettivi.
CONCLUSIONI
La ricerca svolta ha consentito lo sviluppo di una tecnica rapida, sensibile e specifica per la
diagnosi di P. nicotianae e P. citrophthora, basata sulla reazione a catena della polimerasi e il
rilevamento dei prodotti dell’amplificazione in tempo reale (Scorpion-PCR). Al contrario, l’uso
della PCR multipla per l’analisi contemporanea delle due specie di Phytophthora in combinazione
con la nested Scorpion PCR, che avrebbe consentito di abbreviare ulteriormente i tempi e i costi
della diagnosi, non ha fornito risultati che ne consentano una immediata applicazione.
La valutazione dei propaguli del patogeno nel terreno della rizosfera con la tecnica basata
sulla Scorpion-PCR può avere interessanti risvolti pratici, anche perché
è
completamente
automatizzabile e potrebbe essere impiegata per analisi massali in laboratori privi di conoscenze
specifiche del patogeno e della malattia. La diagnosi su un elevato numero di campioni, infatti, è
sempre necessaria in vivaio, considerato che in questi ambienti, nonostante la presenza del
patogeno, raramente le piante manifestano sintomi di sofferenza sulla chioma. D’altra parte, da una
recente indagine svolta in numerosi vivai agrumicoli è emerso che, tranne pochissime eccezioni, il
patogeno è sempre presente nel pane di terra (Ippolito et al., 2001). Infine, similmente a quanto
riscontrato in campo, anche nei vivai si osserva la prevalenza di P. nicotianae.
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Locorotondo (BA), 4 – 7 dicembre 2001
Impiego dell’ELISA nella diagnosi di Phytophthora spp.
agenti del marciume radicale e della gommosi del colletto degli agrumi
Romanazzi G., A. Ippolito, A. Ligorio, F. Nigro
Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata, Università degli Studi di Bari
Riassunto
Il marciume radicale e la gommosi del colletto causati da Phytophthora spp. sono malattie
degli agrumi molto diffuse e dannose. La lotta contro queste malattie, in Italia causate dalle specie
P. nicotianae e P. citrophthora, molto si giova dell’uso di materiale di propagazione sano e le
recenti normative sulla commercializzazione del materiale vivaistico (D.M. 14/04/97) forniscono gli
strumenti operativi per la produzione di materiale agrumicolo di qualità esente da tali patogeni. Per
la diagnosi di queste malattie è di fondamentale importanza la disponibilità di metodiche affidabili,
rapide e di facile applicazione. Oggetto delle indagini è stata la valutazione di kit commerciali
ELISA per Phytophthora spp. nella diagnosi del marciume radicale e della gommosi del colletto
degli agrumi. Sono stati utilizzati i kit Agdia e Loewe (kit “classici”) e i kit Agriscreen e Alert (kit
“a risposta rapida”). Tutti i kit impiegati hanno consentito la diagnosi del patogeno su frammenti di
radice e su porzioni di corteccia, sia artificialmente sia naturalmente infetti da P. nicotianae e P.
citrophthora, fornendo risultati concordi con quelli ottenuti dall’isolamento in coltura su substrato
semiselettivo. Nelle analisi condotte su terreni naturalmente infestati da P. nicotianae e P.
citrophthora i migliori risultati sono stati ottenuti utilizzando i kit “classici” e in particolare il kit
Loewe, che ha mostrato una sensibilità paragonabile a quella del metodo basato sull’impiego di
substrati semiselettivi.
Summary
Phytophthora root rot and gummosis are the most important diseases of citrus worldwide, in
Italy caused by the species P. nicotianae and P. citrophthora. The use of pathogen-free propagative
materials is of basic importance to prevent the spread of the disease and the introduction of the
pathogen into disease-free soil. The recent Italian (D.M. 14/04/97) and European regulations on the
commercialization of plant propagative material provide the operative tools to produce citrus plants
free of Phytophthora spp. Therefore, the availability of reliable, rapid, and ready to use diagnostic
methods is important for early in planta detection of the pathogen and for avoiding infested soils.
The purpose of the current study was the evaluation of commercial ELISA kits in detecting
Phytophthora spp. in citrus orchards and nurseries. Agdia and Loewe kits (“classical” kits), and
Agriscreen and Alert (“quick response” kits) were included in the trials. All the kits allowed the
diagnosis of the pathogen on feeder roots and bark pieces artificially and naturally infected by P.
nicotianae and P. citrophthora; the diagnosis was in agreement with the results obtained by using
isolation on semiselective medium. In the investigations performed on soils naturally infested by P.
nicotianae and P. citrophthora, good results were obtained by using classical kits. In particular,
Loewe kit performed the best with results comparable to those obtained by using the semiselective
medium.
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INTRODUZIONE
Il marciume radicale e la gommosi del colletto causati da Phytophthora spp. sono malattie
degli agrumi molto diffuse e dannose. In Italia P. nicotianae Breda de Haan [sin. P. n. Breda de
Haan var. parasitica (Dast) Watherh.] e P. citrophthora (Sm. et Sm.) Leonian sono le specie
responsabili del marciume radicale, la prima più frequente in Puglia, Basilicata e Calabria, la
seconda in Sicilia (Ippolito et al., 1991). P. citrophthora, invece, risulta solitamente associata alla
gommosi del colletto. La lotta contro queste malattie molto si giova dell’uso di materiale di
propagazione sano. Le recenti normative sulla commercializzazione del materiale vivaistico (D.M.
del 14/4/1997) forniscono gli strumenti operativi per la produzione di materiale agrumicolo di
qualità esente da infezioni e da propaguli di Phytophthora spp. Per la diagnosi di queste malattie è
di fondamentale importanza la disponibilità di metodiche affidabili, rapide e di facile applicazione.
L’ELISA è da tempo applicata in patologia vegetale nella diagnosi di malattie virali (Voeller et al.,
1976; Clark e Adams, 1977), mentre il suo uso nella diagnosi di malattie fungine è relativamente
recente, probabilmente a causa della maggiore complessità antigenica degli agenti causali e della
disponibilità di altri mezzi di diagnosi (Magnano di San Lio et al., 1995; Lorito et al., 2001).
Oggetto delle nostre indagini è stata la valutazione di kit commerciali ELISA per Phytophthora spp.
nella diagnosi del marciume radicale e della gommosi del colletto degli agrumi.
MATERIALI E METODI
Sono stati utilizzati kit delle ditte Agdia e Loewe, che impiegano normali piastre ELISA da
96 pozzetti (kit “classici”) e kit della ditta Adgen denominati “Agriscreen” e “Alert”, completi di
reagenti e pozzetti in strisce già sensibilizzate, nonché di controlli positivi e negativi (kit “a risposta
rapida”) (Tab. 1). I primi, utilizzabili in laboratorio, sono in grado di diagnosticare la presenza del
patogeno nell’arco di 24 ore; i secondi possono essere utilizzati anche in campo e forniscono il
risultato in meno di un’ora. I kit “classici” sono stati utilizzati su Piastre “Nunc MaxiSorp” e
“Falcon”, mentre quelli a risposta rapida, forniti di reagenti e di carte abrasive per la rottura del
campione, non necessitano di ulteriori materiali per la loro utilizzazione. Quando sono stati
utilizzati i kit classici, il materiale è stato sminuzzato con azoto liquido, sospeso nell’apposito
tampone di estrazione e la sospensione ottenuta filtrata con garza. Sono stati analizzati porzioni di
corteccia, frammenti di radichette e terreni. Cento grammi di terreno per ciascun campione sono
stati posti in matracci frangiflusso contenenti 200 ml acqua e tenuti in agitazione a 270 rpm per 15
minuti; dopo 30 minuti di fase stazionaria, sono stati prelevati i residui organici surnatanti. Le
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analisi sono state condotte sia sul terreno tal quale, sia sui residui organici. Le incubazioni sono
state condotte seguendo le istruzioni riportate per ciascun kit. Per i kit classici e per l’Agriscreen, la
risposta è stata valutata leggendo l’assorbanza a 405 nm mediante un fotometro (Multiskan EX);
l’Alert,
invece,
fornisce
una
risposta
direttamente
apprezzabile
ad
occhio
nudo.
Contemporaneamente, nelle diverse prove, è stata effettuata la diagnosi su substrato selettivo
(Masago et al., 1977; Ippolito et al., 1991).
Dal confronto fra i risultati ottenuti con i diversi saggi immunoenzimatici e quelli ricavati
dai metodi classici, si è ritenuto di considerare infetti i campioni che presentavano un valore di
assorbanza pari almeno alla somma tra la media delle letture fotometriche relative ai testimoni non
infetti e il triplo della loro deviazione standard (Sutula et al., 1986).
RISULTATI E DISCUSSIONE
Nel complesso sono stati analizzati 64 campioni di corteccia, 152 campioni di radici e 273
campioni di terreno. Tutti i kit impiegati hanno consentito la diagnosi del patogeno su frammenti di
radice e su porzioni di corteccia, sia artificialmente sia naturalmente infetti da P. nicotianae e P.
citrophthora, fornendo risultati concordi con quelli ottenuti dall’isolamento in coltura su substrato
selettivo (Tabb. 2 e 3). Nelle analisi condotte su terreni naturalmente infestati da P. nicotianae e P.
citrophthora i migliori risultati sono stati ottenuti utilizzando i kit “classici” e, in particolare, il kit
Loewe, che ha mostrato una affidabilità paragonabile a quella del metodo basato sull’impiego di
substrati selettivi (Tab. 4). La sensibilità del kit usato è risultata maggiore quando sono stati saggiati
i residui organici rispetto al terreno tal quale. Il tipo di piastra ha influenzato, seppure non in
maniera significativa, la risposta del kit; infatti, adoperando le piastre Nunc la sensibilità del kit è
stata maggiore rispetto a quando sono state usate piastre Falcon.
CONCLUSIONE
Il test ELISA è impiegabile per la diagnosi di Phytophthora spp. su porzioni di corteccia,
nelle radichette e nei terreni. In particolare, tutti e quattro i kit commerciali utilizzati (Loewe,
Agdia, Agriscreen e Alert) hanno permesso la diagnosi in corteccia e radici, mentre solo i primi due
nei campioni di terreno. La sensibilità dei kit in esame è risultata paragonabile a quella ottenuta con
l’uso del substrato selettivo, essendo stati in grado di evidenziare anche un numero molto basso di
propaguli di Phytophthora spp. per grammo di terreno. I kit in esame possono quindi essere in
grado di diagnosticare la presenza del patogeno nei vivai, considerato che, come messo in evidenza
da una recente indagine, la carica di inoculo di Phytophthora spp. è quasi sempre elevata (Ippolito
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et al., 2001). Pertanto, il saggio ELISA, pur non consentendo la differenziazione a livello di specie,
può rappresentare una valida alternativa ai comuni substrati semiselettivi nella diagnosi su larga
scala di Phytophthora spp. agenti del marciume radicale e della gommosi del colletto degli agrumi.
Tale saggio, inoltre, è di facile esecuzione, non richiede l’uso di attrezzature costose e, utilizzando
si usano i kit a risposta rapida, permette la diagnosi direttamente in campo.
BIBLIOGRAFIA
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Locorotondo (BA), 4 – 7 dicembre 2001
Tabella 1. Caratteristiche dei kit ELISA utilizzati nelle prove.
Patogeno
individuato
Nome e caratteristiche
Anticorpi
Tempo di
risposta
Ditta
produttrice
Phytophthora
infestans
07079S/K, forte reazione
incrociata con altre specie
di Phytophthora
Policlonali
24 ore
Phytophthora spp.
PHYT
Policlonale/
monoclonale
Policlonale/
monoclonale
24 ore
1 ora
Loewe
Biochemica
GmbH
Agdia
Phytophthora spp.
Phytophthora spp.
AGRISCREEN
ALERT
Policlonale/
monoclonale
20 minuti
Adgen
Adgen
Tabella 2. Risultati del saggio ELISA con il kit Agriscreen per la diagnosi di Phytophthora spp. su
radici di arancio amaro naturalmente infette da P. nicotianae e P. citrophthora.
Campione
R1 radici pianta infetta da P. nicotianae
R2 radici pianta infetta da P. nicotianae
R3 radici pianta infetta da P. citrophthora
R4 radici testimone sano 1
R5 radici testimone sano 2
Tampone
Controllo negativo
Controllo positivo
Segmenti infetti (%)
Abs 405 nm
4
23
1
-
2,174*
2,752
0,770
0,246
0,215
0,165
0,160
1,176
* i valori in grassetto indicano un’assorbanza superiore alla somma tra la media delle letture fotometriche
relative ai testimoni non infetti (M) e il triplo della loro deviazione standard (DS), utilizzata come soglia di
discriminazione (S) fra campioni infetti e campioni non infetti. S=M+3DS; M=0,230; DS=0,022; S=0,296
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Tabella 3. Risultati del kit Agdia adoperato nella diagnosi di Phytophthora spp. su porzioni di
corteccia di arancio amaro e arancio dolce artificialmente inoculati con P. nicotianae e P.
citrophthora. La prova è stata svolta utilizzando piastre Falcon.
Campione
P1 arancio amaro inoculato con P. nicotianae
P2 arancio amaro inoculato con P. nicotianae
P3 arancio amaro inoculato con P. citrophthora
P4 arancio amaro inoculato con P. citrophthora
P5 arancio dolce inoculato con P. nicotianae
P6 arancio dolce inoculato con P. nicotianae
P7 arancio dolce inoculato con P. citrophthora
P8 arancio dolce inoculato con P. citrophthora
P9 testimone sano 1
P10 testimone sano 2
P11 testimone sano 3
Tampone
Micelio di P. nicotianae 213
Micelio di P. citrophthora 214
Isolamento
su substrato selettivo
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Abs 405 nm
0,218*
0,217
0,165
0,153
0,162
0,299
0,204
0,194
0,103
0,088
0,072
0,083
2,985
2,803
* i valori in grassetto indicano un’assorbanza superiore alla somma tra la media delle letture fotometriche
relative ai testimoni non infetti (M) e il triplo della loro deviazione standard (DS), utilizzata come soglia di
discriminazione (S) fra campioni infetti e campioni non infetti. S=M+3DS; M=0,088; DS=0,015; S=0,134
Progetto POM A32 “Norme fitosanitarie e commercializzazione delle produzioni vivaistiche”
Locorotondo (BA), 4 – 7 dicembre 2001
Tabella 4. Risultati del saggio ELISA con il kit Loewe per la diagnosi di Phytophthora spp. in
terreni di agrumi naturalmente infestati da P. nicotianae e P. citrophthora. La prova è stata svolta
utilizzando piastre Nunc.
Campione
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
Tampone
Micelio di P.
nicotianae 213
Propaguli per grammo di terreno
P. nicotianae
66
3
4
22
9
2
0
0
0
P. citrophthora
0
7
0
0
0
0
0
0
0
Abs 405 nm
Terreno tal quale Residui organici
0,074*
0,114
0,046
0,076
0,040
0,056
0,045
0,074
0,042
0,069
0,040
0,053
0,033
0,039
0,035
0,038
0,033
0,042
0,032
0,646
* i valori in grassetto indicano un’assorbanza superiore alla somma tra la media delle letture fotometriche
relative ai testimoni non infetti (M) e il triplo della loro deviazione standard (DS), utilizzata come soglia di
discriminazione (S) fra campioni infetti e campioni non infetti. S=M+3DS; per il terreno tal quale: M=0,034;
DS=0,001; S=0,037; per i residui organici, M=0, 040; DS=0,002; S=0, 046
Progetto POM A32 “Norme fitosanitarie e commercializzazione delle produzioni vivaistiche”
Locorotondo (BA), 4 – 7 dicembre 2001
Phytophthora nicotianae e P. citrophthora agenti del marciume radicale degli agrumi:
presenza e variazione stagionale nei vivai della Puglia
Ippolito A., Romanazzi G., Nigro F., Schena L., Murolo S., Kukhun W.
Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata, Università degli Studi di Bari
RIASSUNTO
Sono riportati i risultati di indagini volte a valutare la presenza di Phytophthora nicotianae e
P. citrophthora, agenti del marciume radicale degli agrumi, nei vivai agrumicoli pugliesi, nonché la
variazione stagionale dei propaguli dei due patogeni nel terreno. Nei terricci delle fitocelle di quasi
tutti i vivai oggetto di indagine è stato rinvenuto uno o tutti e due i patogeni, con valori anche
superiori a 500 propaguli per grammo di terreno secco. P. nicotianae è stata la specie più
frequentemente isolata. I substrati di coltura e le acque di irrigazione sono risultati esenti da
propaguli dei patogeni, che invece sono stati rinvenuti nei terreni su cui poggiavano le fitocelle. La
dinamica di popolazione di P. nicotianae nelle fitocelle di 5 vivai ha mostrato un andamento
dipendente dal decorso termico, con una forte riduzione della popolazione nel periodo invernale e
valori elevati dalla primavera inoltrata a metà autunno. I risultati delle indagini svolte sono discussi
in relazione alle possibili implicazioni di carattere epidemiologico.
SUMMARY
The results of investigations aimed at evaluating the presence of Phytophthora nicotianae
and P. citrophthora and their population dynamic in the rhizosphere of citrus plants in Apulian
nurseries, are reported. The pathogens were recovered in almost all the investigated nurseries with
P. nicotianae being the species more frequently isolated. Soil mixes used to propagate citrus and the
irrigation water were free of Phytophthora propagules, whereas the soil under pots was
contaminated. Seasonal fluctuation of pathogen propagules in the soilpot appeared to be related to
the environmental temperature, with low values during winter and high ones from spring to mid
autumn. The results are briefly discussed in relation to the disease management.
INTRODUZIONE
Il marciume radicale da Phytophthora spp. è la principale causa di deperimento degli agrumi
in Puglia; la specie più frequentemente riscontrata è P. nicotianae Breda de Haan [sin. P. nicotianae
Breda de Haan var. parasitica (Dast) Watherh.], mentre P. citrophthora (Sm. et Sm.) Leonian lo è
raramente (Ippolito et al., 1991). La lotta contro questa malattia si basa principalmente
sull’adozione di idonee pratiche colturali, sull’uso di portinnesti resistenti e di fungicidi sistemici
(Salerno e Cutuli, 1992; Ippolito et al., 1996). Questi interventi limitano notevolmente gli attacchi
del patogeno, che tuttavia è sempre presente nel terreno e pronto, quando le condizioni sono
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favorevoli, ad infettare l’ospite. L’eradicazione del patogeno dal terreno con la coltura in atto è
operazione molto difficile se non impossibile; prodotti a base di Phosetyl-Al e di Metalaxyl, usati
per più anni consecutivi, riescono solo ad abbassare la carica di inoculo del patogeno (Menge, 1986;
Ippolito et al., 1996). Il materiale di propagazione contaminato nel pane di terra è una delle
principali fonti di diffusione dei due patogeni (Menge e Nemec, 1997), soprattutto in mancanza di
precise norme e controlli che ne disciplinano la produzione e la commercializzazione.
Nell’ambito del Progetto POM A32 sono state svolte indagini per valutare la presenza di P.
nicotianae e di P. citrophthora nei vivai agrumicoli pugliesi. Inoltre, in cinque vivai dell’Arco
Jonico Tarantino sono state effettuate osservazioni periodiche per lo studio della variazione
stagionale dei propaguli dei due patogeni nel terreno.
MATERIALI E METODI
Per l’indagine sulla presenza di P. nicotianae e P. citrophthora nei vivai agrumicoli
pugliesi, da ogni vivaio sono stati prelevati 15-20 campioni di terriccio da fitocelle scelte a caso nei
diversi lotti, indipendentemente dall’età e dalle specie innestate sul comune portinnesto arancio
amaro; inoltre, da ciascun vivaio sono stati prelevati campioni del terreno su cui poggiavano le
fitocelle, della miscela di coltura e delle sue componenti (sabbia, terreno, torba, letame) e di acqua
di irrigazione. Per lo studio della variazione stagionale, da cinque vivai dell’Arco Jonico Tarantino
sono stati prelevati mensilmente 5 campioni di terriccio dalla rizosfera di piante di arancio amaro
non innestato e 5 da piante di arancio amaro innestato con clementine Comune. In tutti i casi, da
ciascuna fitocella sono stati prelevati 100-200 g di terriccio mediante una sonda. La densità di
inoculo (DI) di P. nicotianae e di P. citrophthora, espressa come numero di propaguli per grammo
di terreno secco, è stata determinata come riportato in precedenza (Ippolito et al., 1991). Le analisi
per la diagnosi dei propaguli dei patogeni nelle acque di irrigazione sono state effettuate come
descritto da Magnano di San Lio e Perrotta (1982).
RISULTATI E DISCUSSIONE
I risultati delle indagini volte a valutare la presenza di P. nicotianae e di P. citrophthora in
vivai agrumicoli pugliesi hanno evidenziato la pressoché totale contaminazione dei terricci dei 17
vivai visitati, con una DI di P. nicotianae anche superiore a 500 propaguli per grammo di terreno
secco (Tab. 1). Raramente sono stati rinvenuti anche propaguli di P. citrophthora. Nei terricci e
nei rispettivi componenti
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(sabbia, terreno, torba, letame), nonché nelle acque di irrigazione, non sono stati rinvenuti
propaguli dei patogeni, mentre i terreni su cui poggiavano direttamente le fitocelle sono risultati
contaminati. Valori più elevati di DI e di percentuale di fitocelle infestate sono stati osservati
laddove queste erano poggiate direttamente sul terreno o semplicemente su un telo antialga ovvero
su un sottile strato di sabbia. Nei due vivai dove non sono stati riscontrati propaguli dei patogeni
(Tab. 1) le fitocelle erano poste su un terreno declive o baulato, coperto da uno spesso strato (10-15
cm) di ghiaia.
Tabella 1. Percentuale di campioni con propaguli di P. nicotianae e P. citrophthora e densità di
inoculo (DI) dei due patogeni in vivai della Puglia. Per ogni vivaio sono stati prelevati 15-20
campioni di terriccio da fitocelle scelte a caso in diversi lotti.
Campioni
Campioni
DI
DI
Vivaio
infestati
Media (*)
Vivaio
(%)
infestati
Media (*)
(%)
1
100
138,4 (6-378)
10
20
5,2 (1-37)
2
0
-
11
10
1,5 (2-7)
3
64
16,1 (2-102)
12
27
2,2 (5-17)
4
40
16,5 (14-48)
13
40
9,7 (2-100)
5
17
2,2 (4-18)
14
80
140,5 (3-524)
6
17
31,0 (5-186)
15
83
92,7 (12-156)
7
37
6,8 (3-59)
16
0
-
8
71
18,1 (2-56)
17
100
131,2 (13-318)
9
14
1,9 (3-17)
(*) Accanto a ciascuna media è riportato il numero minimo e il numero massimo di propaguli riscontrato nei
campioni esaminati.
Circa lo studio della dinamica di popolazione, sia nei terricci di fitocelle con arancio amaro
non innestato, sia in quelle con arancio amaro innestato con clementine, i valori più elevati di
propaguli di P. nicotianae (l’unica specie riscontrata nei 5 vivai) sono stati osservati a giugno 2000
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e a giugno 2001, mentre quelli più bassi si sono avuti nei mesi più freddi (Fig. 1A, B; Fig. 2); per i
terricci delle fitocelle ospitanti il clementine, i valori di DI a fine prova sono risultati, in genere, più
elevati rispetto a quelli con arancio amaro non innestato (Fig. 1A, B). La variazione stagionale di P.
nicotianae nel terreno dei vivai ha mostrato un andamento simile a quella riscontrata in campo
(Ippolito et al., 1992a), ma con valori di DI notevolmente più elevati. Condizioni edafiche più
favorevoli allo sviluppo del patogeno e, in particolare, le frequenti ed abbondanti irrigazioni cui
sono soggette le piante in vivaio potrebbero essere alla base delle più elevate infestazioni del
terreno (Ippolito et al., 1992b). Nella rizosfera di arancio amaro non innestato dei vivai 3, 4 e 5 il
numero dei propaguli del patogeno nel corso della prova è risultato relativamente più basso rispetto
a quello riscontrato nei vivai 1 e 2 (Fig. 1A). Anche in questo caso, analogamente a quanto
osservato nelle indagini sulla presenza dei due patogeni nei vivai, la più bassa popolazione e
fluttuazione nel tempo di P. nicotianae è risultata associata al buon isolamento delle fitocelle dal
terreno; infatti, queste erano poste su uno strato di sabbia di circa 15 cm (vivaio 3), su uno strato di
ghiaia di circa 10 cm non separato dal terreno (vivaio 4) o da questo separato mediante un telo
impermeabile (vivaio 5).
CONCLUSIONI
In quasi tutti i vivai agrumicoli visitati (88%) sono stati trovati propaguli di Phytophthora
spp. nel terreno, con valori di DI talvolta molto elevati. La presenza anche di pochi propaguli nel
pane di terra che accompagna le piante al momento del trapianto rappresenta una situazione di
pericolo che può avere gravi ripercussioni in campo (Menge e Nemec, 1997). In base alla
variazione stagionale dei propaguli del patogeno, il periodo più opportuno per la diagnosi di
Phytophthora spp. nei vivai agrumicoli è quello compreso tra maggio e ottobre. Al fine di evitare la
contaminazione delle fitocelle in vivaio, sembra di fondamentale importanza evitare il diretto
contatto di queste con il terreno sottostante. Altre norme di profilassi come uso di semi sani,
distanze di sicurezza da agrumeti limitrofi, igiene dei piazzali di preparazione dei terricci e dei
contenitori, ecc., non sono tuttavia da trascurare (Menge e Nemec, 1997).
Ringraziamenti
Si ringraziano il p.a. Sig. Vincenzo Maurantonio e il Sig. Giacomo De Francesco per la
collaborazione tecnica.
Progetto POM A32 “Norme fitosanitarie e commercializzazione delle produzioni vivaistiche”
Locorotondo (BA), 4 – 7 dicembre 2001
BIBLIOGRAFIA
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and Basilicata, Italy. EPPO Bulletin 20: 91-94.
Ippolito A., De Cicco V., Salerno M. 1991. Aspetti eziologici ed epidemiologici del marciume
radicale degli agrumi da Phytophthora spp. in Puglia e Basilicata. Phytopathologia
Mediterranea 30: 47-51.
Ippolito A., De Cicco V., Salerno M. 1992a. Seasonal variation in root infections and population
levels of Phytophthora spp. in citrus orchards of Apulia and Basilicata, Italy. Rivista di
Patologia Vegetale, Serie V, 2: 57-65.
Ippolito A., Lima G., Nigro F. 1992b. Influence of irrigation method on Phytophthora root rot of
citrus. Preliminary results. Phytopathologia Mediterranea 31: 170-174.
Ippolito A., Nigro F., Lima G. 1996. Efficacia di Fosetyl-Al e di Metalaxyl contro il marciume
radicale da Phytophthora spp. in piante di clementine innestate su arancio amaro. La Difesa
delle Piante 19(2-3): 81-88.
Magnano di San Lio G., Perrotta G. 1982. Determinazione quantitativa nel terreno di specie di
Phytophthora patogene per gli agrumi. Potenziale di malattia e densità d’inoculo.
Phytopathologia Mediterranea 21: 59-65.
Menge J.A. 1986. Use of new systemic fungicides on Citrus. Citrograph 71: 245-252.
Menge J.A. Nemec S. 1997. Citrus, pag. 185-227. In: Soilborne diseases of tropical crops (Hillocks
R.J., Waller J.M., coord.). Cab International, Wallingford, UK..
Salerno M., Cutuli G. 1992. Guida illustrata di patologia degli agrumi. Edagricole, Bologna, 212
pp.
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Locorotondo (BA), 4 – 7 dicembre 2001
V ivaio 1
V ivaio 2
V ivaio 3
V ivaio 4
V ivaio 5
250
200
150
DI
A
100
50
Vivaio 1
Vivaio 2
Vivaio 3
Vivaio 4
gi
u
ap
r
m
ag
m
ar
fe
b
ge
n
di
c
ot
t
no
v
se
t
ag
o
lu
g
gi
u
0
Vivaio 5
250
200
150
DI
B
100
50
0
giu
lug ago set
ott nov dic gen feb m ar apr m ag giu
Fig 1. Variazione stagionale della densità di inoculo (DI) di Phytophthora nicotianae nella rizosfera di
arancio amaro non innestato (A) e innestato con clementine (B) in cinque vivai agrumicoli pugliesi.
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70
60
50
U m idità relativa
T em peratura
100
80
40
60
30
40
20
10
0
20
Umidità Relativa (%)
Temperatura (°C) - Pioggia (mm)
P io ggia
0
Fig 2. Dati metereologici settimanali (temperatura media, umidità relativa e pioggia) registrati
in agro di Castellaneta (TA) nel periodo in cui sono state svolte le prove.
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Standardizzazione e validazione del protocollo ELISA per la diagnosi sierologica di CPsV
A.M. D’Onghia1, K. Djelouah1 e O. Potere2
Istituto Agronomico Mediterraneo, Valenzano, Bari
2
Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata, Università degli Studi di Bari
1
RIASSUNTO
Per la diagnosi massale del virus della psorosi (CPsV), è stato standardizzato un protocollo
del metodo sierologico ELISA, comparando diversi tessuti e organi della pianta, periodi di
campionamento, modalità di conservazione dei campioni; il protocollo diagnostico è stato poi
validato su piante infette con CPsV in vivaio e in campi commerciali.
Dall'indagine sperimentale è risultato che l’uso dei fiori, quando possibile, migliora notevolmente
sia per i tempi che per la facilità di esecuzione di tutte le fasi del protocollo, mantenendo un livello
alto di sensibilità del saggio.
SUMMARY
For a mass scale diagnosis of citrus psorosis virus (CPsV) an ELISA protocol was
standardized, comparing different plant tissues, sampling times and storage conditions for the
samples. The protocol was validated on CPsV infected plants in nurseries and commercial orchards.
The experimental tests showed that ELISA CPsV diagnosis can be improved by using flowers as
sampling tissue because of the rapid and easy procedure as well as the high sensitivity of the assay.
INTRODUZIONE
Diverse sono le malattie trasmissibili per innesto che colpiscono le specie agrumicole e fra
esse la psorosi ricopre un ruolo molto importante soprattutto nell’ambito del Mediterraneo. La
psorosi, seppur considerata meno preoccupante rispetto ad altre malattie degli agrumi, è comunque
causa di gravi danni a carico della pianta quali le forti desquamazioni corticali su tronco e rami
delle specie e varietà più suscettibili. Nella maggior parte dei casi la psorosi è latente e solo in
alcuni Paesi si diffonde in natura (Roistacher, 1993).
Negli ultimi anni è stato possibile identificare l’agente causale di questa malattia, citrus psorosis
virus (CPsV), appartenente al nuovo genere Ophiovirus (Milne et al., 2000), ed avvalersi di saggi
diagnostici alternativi alla tradizionale inoculazione per innesto su ospiti legnosi, quali
l’amplificazione genica (RT-PCR) e, soprattutto, le tecniche sierologiche ELISA e DTBIA
(Roistacher, 1993; Garcia et al., 1997; D’Onghia et al., 1998; Djelouah e D’Onghia, 1998; Alioto et
al., 1999; Potere et al., 1999; Djelouah et al., 2000; Legarreta et al., 2000; D’Onghia et al., 2001).
Con il recepimento della Direttiva comunitaria 93/48 sulla autocertificazione obbligatoria dei
materiali di propagazione delle piante da frutto (categoria CAC nel DM 14/4/97), per gli agrumi è
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prevista l’esenzione dalle principali malattie e/o patogeni pregiudizievoli della qualità, fra le quali
viene citata la psorosi.
Nell’ambito del progetto POM–A32 si è voluto quindi affrontare il problema della diagnosi di
questo virus, attraverso la standardizzazione e la validazione dei protocolli di diagnosi sierologica,
al fine di fornire indicazioni pratiche sulla esecuzione dei test. In particolare si è voluto assicurare
non solo un’elevata attendibilità del risultato ottenuto dall’applicazione dei protocolli standardizzati
e validati, ma anche la facilità della loro applicazione su larga scala a costi contenuti.
MATERIALI E METODI
Campionamento
La standardizzazione del protocollo ELISA, per la diagnosi massale di CPsV, è stata
condotta effettuando prelievi di organi o tessuti (fig. 1), durante le diverse stagioni dell’anno, su
alberi in campo e piantine in vivaio appartenenti a due genotipi infetti: il clementine “Fedele” e
l’arancio “Navelina” vecchio clone. Per ogni genotipo è stato individuato un campo commerciale di
età superiore ai 10 anni, all’interno del quale sono stati selezionati, sulla base dei risultati dei saggi
sia biologici su indicatori legnosi che sierologici (D’Onghia et al., 1998), 15 alberi infetti da CPsV
dislocati in zone diverse.
Nei campi commerciali, fatta eccezione per i fiori la cui raccolta si è svolta in un arco di tempo
circoscritto, le foglie sono state prelevate con cadenza mensile durante tutto l’anno.
Ogni volta sono stati raccolti 12 campioni per albero, tenendo conto sia dell’esposizione delle
branche secondo i quattro punti cardinali che delle diverse altezze della chioma.
In vivaio è stata costituita una parcella di 300 piante di clementine ‘Fedele’ e arancio ‘Navelina VC’
(150 per genotipo), di cui il 20% innestato con marze infette, provenienti dagli alberi in campo,
distribuite a random. Tutte le piante in vivaio sono state controllate sierologicamente nel corso
dell’anno, effettuando prelievi bimestrali, a partire dall’emissione dei primi germogli.
Inoltre, sono stati eseguiti 4 saggi ad intervalli trimestrali, utilizzando campioni misti costituiti da
diversi rapporti tra infetto e sano (1:2; 1:3; 1:4; …1:10).
Conservazione del campione
Al fine di poter determinare i tempi di conservazione del campione (foglie o fiori) sono state
effettuate diverse prove mantenendo il materiale a 4°C, -20°C e –70°C per intervalli di tempo
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diversi. I saggi sierologici sono stati eseguiti con cadenza giornaliera nel caso del materiale
conservato a 4°C, mentre per quello congelato con cadenza settimanale e mensile.
Diagnosi sierologica
I saggi sono stati condotti con la tecnica DAS-ELISA (Potere et al., 1999). La piastra è stata
sensibilizzata con una miscela di anticorpi monoclonali CPsV-specifici diluita 1: 1000 in tampone
di sensibilizzazione e posta ad incubare a 37°C per 2 ore; successivamente è stata sottoposta ai
lavaggi (per tre volte da tre minuti ciascuna con tampone di lavaggio). I campioni sono stati
preparati triturando i diversi tipi di tessuto o organo in tampone di estrazione alla diluizione di 1: 10
(0,5g di foglie o, nel caso del fiore, il pistillo intero) e successivamente sono stati riempiti due
pozzetti per ogni campione. L’ultima fila della piastra è stata utilizzata per gli estratti di due
testimoni positivi e del sano, oltre che per il tampone. Dopo una seconda incubazione, a 4° C per
tutta la notte, sono seguiti altri lavaggi e, nei pozzetti ben asciugati, è stato aggiunto l’anticorpo
monoclonale (MAb.PS29) coniugato alla fosfatasi alcalina diluito in tampone di coniugazione
(1:500). La piastra è stata lasciata in incubazione per due ore a 37 °C e, dopo il lavaggio, nei
pozzetti è stato aggiunto il substrato (1mg di paranitrofenil fosfato per ml di tampone specifico). La
reazione colorimetrica della piastra, a temperatura ambiente, è stata seguita ad intervalli di 15
minuti rilevando i valori di assorbanza a 405 nm mediante un fotometro (lettore ELISA).
Validazione del protocollo
Per la validazione del protocollo sono stati oggetto di saggio: (i) una collezione di diverse
fonti di psorosi di origine Mediterranea, già caratterizzata sia biologicamente che sierologicamente
(D’Onghia et al., 1998; Djelouah et al., 2000), costituita da 13 genotipi diversi; (ii) 300 piante di
clementine ‘Fedele’ e arancio ‘Navelina VC’ in vivaio; (iii) 2 campi commerciali, di circa 2 Ha
l’uno, delle stesse varietà.
La collezione e i 2 campi commerciali sono stati saggiati due volte nel corso dell’anno: in autunno,
utilizzando foglie mature, e in primavera, anche con i fiori; per le piante in vivaio sono stati
sottoposti al saggio in primavera i giovani germogli e in autunno le foglie mature.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Dalle prove condotte è emerso che la diagnosi sierologica mediante ELISA permette di
rilevare CPsV in tutti i periodi dell’anno, ma i migliori risultati si ottengono in primavera, facendo
uso dei fiori chiusi o, in assenza di fioritura, delle foglie mature. Anche per l’ELISA, come
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segnalato per il DTBIA (D’Onghia et al., 2001), si è evidenziata una maggiore sensibilità del saggio
sul pistillo rispetto al tessuto tradizionale rappresentato dalla foglia (fig.2).
Inoltre, si è visto che il campionamento effettuato nelle varie parti della chioma e nei diversi
orientamenti dell’albero non influenza l’esito del saggio.
Nel campionamento misto infetto/sano si è notato che nel caso delle foglie, il rapporto ideale è
limitato a 1: 2, mentre con i fiori si può anche arrivare a 1:4 senza perdere significativamente la
capacità di rilevare l’infezione.
Le modalità di conservazione possono condizionare notevolmente la riuscita del saggio: i
risultati migliori si sono avuti quando i campioni, appena raccolti, sono stati sigillati e posti in borse
refrigerate; le foglie sono state sistemate in buste di plastica, ben chiuse, contenenti carta umida,
mentre per i fiori è risultata più idonea la conservazione in piastre Petri opportunamente sigillate. Il
materiale così preparato può essere conservato a 4°C per almeno una settimana, nel caso delle
foglie, o, nel caso dei fiori, fino a 20 giorni. Si è constatato, inoltre, che il congelamento (da -70°C a
-20°C) rappresenta un ottimo metodo di conservazione per i fiori, che non perdono la capacità di
dare reazione in saggi sierologici per almeno un anno; non è, invece, una procedura idonea per le
foglie.
In conclusione, utilizzando i fiori, quando possibile, per la diagnosi immunoenzimatica di CPsV,
tutte le fasi del protocollo, dal campionamento alla conservazione e preparazione del campione,
sono notevolmente migliorate sia per i tempi che per la facilità di esecuzione, mantenendo un buon
livello di sensibilità del saggio. Tutto ciò consente di effettuare una programmazione dei saggi
durante il corso dell’anno e ottenere, a costi contenuti, un’ottima attendibilità del risultato del
saggio.
BIBLIOGRAFIA
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detection of citrus psorosis virus using polyclonal and monoclonal antibodies. Plant
Pathology 48: 735-741.
D’Onghia A.M., Djelouah K., Alioto D., Castellano M.A. e Savino V. 1998. Elisa correlates with
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Fig 1. Fiori chiusi e foglie mature raccolti per l'ELISA
Fig 2. Confronto in ELISA di diversi tessuti prelevati da 7 piante infette con CPsV
F: pistillo; L: foglia; S: picciolo; Buf: tampone; -: controllo sano
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Validazione della ibridazione molecolare per la diagnosi di viroidi degli agrumi
in pieno campo
1
A. Minafra1 , A.M. D’Onghia2 e K. Djelouah 2
Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata, Università degli Studi e
Centro di Studio del CNR sui Virus e Virosi delle Colture Mediterranee, Bari
2
Istituto Agronomico Mediterraneo, Valenzano, Bari
RIASSUNTO
È stata validata la diagnosi dei due principali viroidi degli agrumi (CEVd e CCaVd) per
ibridazione molecolare, con ribosonde marcate con digoxigenina, su piante naturalmente infette
allevate in pieno campo e da innesti in vivaio per una larga applicazione nella produzione di
materiale CAC. L’utilizzazione di estratti di RNA totale per la ibridazione ha permesso di rilevare
quantità minime di viroidi, direttamente da piante di allevamenti commerciali prive di sintomi.
SUMMARY
The diagnosis of the most important viroids of citrus (CEVd e CCaVd) by molecular
hybridization, using digoxigenin-labelled riboprobes, was validated on naturally infected, fieldgrown plants and nursery-grafted plants for a large scale application in CAC material production.
The use of total RNA extracts for the hybridization allowed the detection of minimal amounts of
viroid RNA, directly from symptomless plants in commercial orchards.
INTRODUZIONE
Gli agrumi sono soggetti a numerose malattie causate da viroidi, piccoli RNA circolari
capaci di replicarsi autonomamente nelle cellule delle piante ospiti (Semancik e Duran-Vila, 1991),
che si diffondono per innesto di materiale di propagazione infetto e tracce di succo infetto su
attrezzi da taglio non sterilizzati. Le malattie da viroidi che più pregiudicano lo stato sanitario e le
produzioni agrumicole sono l’esocortite (CEVd) e la cachessia-xiloporosi (CCaVd). L’esocortite è
latente sulla maggior parte delle specie di agrumi commerciali, mentre si manifesta con forti
fessurazioni corticali nelle combinazioni di innesto con il Poncirus trifoliata e i suoi ibridi,
causando anche riduzione di taglia. La cachessia produce, invece, alterazioni del legno e gommosi
soprattutto su mandarino e clementine (Albanese et al, 2000). La scarsa concentrazione di viroidi
nei tessuti e la conseguente difficoltà di rilevarne quantità apprezzabili nei saggi di laboratorio ha a
lungo favorito il saggio biologico mediante innesto su piante indicatrici legnose (Boscia et al.,
1999) che tuttavia richiede tempi, spazi e costi che rallentano la produzione e la
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commercializzazione di materiale certificato. Tuttavia, sin dalla metà degli anni ’80, applicazioni
della elettroforesi su gel di poliacrilammide hanno permesso di sfruttare particolari proprietà
strutturali dei viroidi per la loro separazione dalle complesse miscele di acido nucleico delle piante
infette (La Rosa e Albanese, 2000). Il saggio elettroforetico, pur fornendo una diagnosi accurata dei
viroidi presenti nel campione, richiede ancora una certa quantità di tessuto da analizzare e non è
proponibile un suo uso su vasta scala.
Lo sviluppo degli strumenti di indagine molecolare a partire dal clonaggio e sequenziamento
dei diversi viroidi degli agrumi, consente una diagnosi rapida ed estremamente sensibile e specifica.
L’amplificazione genica (RT-PCR) può discriminare fra diversi isolati della stessa specie di
patogeno, ma richiede una adeguata preparazione del campione per rimuovere i composti inibenti le
reazioni enzimatiche e può andare facilmente incontro a contaminazioni ( Yang et al., 1992; Levy et
al, 1994; Turturo et al., 1998). Un maggiore interesse, in quanto coniuga semplicità tecnica e
sufficiente sensibilità, ha incontrato la ibridazione molecolare dei viroidi, soprattutto con la
diffusione di ribosonde a marcatura non radioattiva (Podleckis et al., 1993; de Noronha Fonseca et
al., 1996; Palacio et al., 1999). L’ibridazione su “impronta di tessuto”, che semplifica estremamente
la preparazione del campione , ha però una sensibilità ridotta in piante allevate in pieno campo, in
cui la concentrazione dei viroidi è relativamente bassa, ed è consigliata solo dopo innesto
dell’isolato su Citrus medica (cv. ‘Etrog’). L’ibridazione di acido nucleico totale, rapidamente
estratto da ridotte quantità di tessuto infetto e deposto su membrana dopo parziale denaturazione,
incrementa la affidabilità della diagnosi conservando i vantaggi del metodo.
Il recepimento della Direttiva Comunitaria 93 / 48 sulla autocertificazione obbligatoria dei
materiali di propagazione delle piante da frutto (categoria “CAC”: Conformità Agricola
Comunitaria) nel DM 14.4.97 richiede la messa a punto di adeguati metodi di diagnosi che possano
operare su un largo numero di campioni provenienti da vivaio, con semplicità operativa e costi
contenuti. Per gli agrumi è richiesta, fra l’altro, l’esenza da infezioni di CEVd e CCaVd e quindi
nell’ambito del progetto POM -
A32 è stata affrontata la validazione della diagnosi tramite
ibridazione molecolare di questi due viroidi su piante naturalmente infette allevate in pieno campo e
da innesti in vivaio per evidenziare la possibilità di una sua larga applicazione nei programmi di
certificazione CAC.
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MATERIALI E METODI
Materiale vegetale
Sono state selezionate 5 piante adulte di C. sinensis cv. ‘Navelina’ e 6 di C. reticulata cv.
‘Fedele’ , allevate nell’agro di Palagiano, di cui era noto lo stato di infezione da CEVd e CCaVd
per i saggi biologici svolti in precedenza (Tab. 1). Fra l’estate del 1999 e la primavera del 2000
sono stati effettuati campionamenti a distanza di tre mesi raccogliendo almeno 5 foglie mature ed
espanse da diverse porzioni della chioma. Nell’inverno del 1999 è stato anche costituito in vivaio un
lotto di 300 piante sane delle cv, “Navelina “ e “Fedele” e di 20 piante innestate con materiale
infetto da viroidi degli stessi genotipi. Ancora con campionamenti trimestrali, a partire da marzo
2000, sono state raccolte foglie da una singola pianta sana o infetta, o si è raccolta una miscela di
foglie da cinque o dieci piante, di cui una sola infetta. I campioni sono stati conservati a 4°C ed
estratti entro le 24h oppure congelati a –70°C.
Estrazione dell’acido nucleico e preparazione delle membrane
Circa 100 mg di tessuto per campione, ottenuti tagliando con una lama una sottile striscia da
ciascuna foglia, vengono omogeneizzati con 1ml di tampone di estrazione (De Paulo e Powell,
1995), dopo polverizzazione in azoto liquido o alternativamente in un estrattore a vibrazione (Mixer
Mill 300; Retsch). A 750 µl di questo estratto si aggiungono 100µl di SDS 10% e si incuba per
15min a 70°C. Dopo l’ aggiunta di 200ul di potassio acetato 5M , si conserva il tubo in ghiaccio per
circa 10 min ed infine si centrifuga a 14.000rpm per almeno 5min. 500ul di supernatante possono
essere precipitati subito in etanolo con aggiunta di 0.1 vol di sodio acetato (3M pH5.5) oppure
dopo una ulteriore estrazione con un ugual volume di fenolo-cloroformio. Dopo una incubazione a
–20°C per una notte l’acido nucleico totale viene centrifugato e risospeso in 100µl di acqua
distillata sterile. 25-30µl di estratto (che corrispondono a circa 15mg di tessuto) vengono
addizionati ad un egual volume di soluzione di denaturazione (100mM NaOH, 5mM EDTA) per
qualche minuto a temperatura ambiente e subito deposti su membrana di nylon ( Hybond N+; AP
Biotech), imbevuta con SSC20x (1x: 0.15M NaCl, 0.015M sodio citrato, pH 7), in pozzetti circolari
di 5mm di diametro con l’ausilio di un apparato per aspirazione sotto vuoto (Vacusystems; ABN).
La membrana viene bagnata ancora con SSC20x, brevemente asciugata ed esposta a luce
ultravioletta per 3min e ibridata subito o conservata a temperatura ambiente.
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Preparazione della sonda e ibridazione molecolare
I plasmidi utilizzati per la sintesi delle ribosonde sono stati gentilmente forniti dalla prof. R.
La Rosa (Università di Catania): pSP65 contenenti le copie di cDNA di CEVd (variante ‘d’,
Visdaver e Symons, 1985) e HSVd (isolato ‘cucumber’, Sano et al., 1984). Le ribosonde sono
marcate con digoxigenina-UTP (DIG RNA labeling kit, Roche); una aliquota viene osservata dopo
migrazione in gel di agarosio e diluizioni decimali, deposte su membrana e rivelate da una reazione
immuno-enzimatica, vengono comparate a marker commerciali per quantificarle ed evidenziarne la
diluizione limite. Le membrane sono state pre-ibridate per 30min in 3-5ml di Dig-granules buffer
(Roche) a 56°C in un forno da ibridazione (Hybaid) e 10-25ng/ml di sonda vengono aggiunti
incubando ancora a 56°C per 12h. Dopo i lavaggi (effettuati a 68°C) e un trattamento con RNAsi A
per rimuovere la sonda non ibridata, la presenza di digoxigenina viene rilevata con un anticorpo
coniugato con fosfatasi alcalina e successiva incubazione con substrato chemioluminescente
(CSPD, Roche). La membrana viene esposta per 1–3h ad un film radiografico (XR-E-30, Fuji) che
viene sviluppato per evidenziare le macchie di ibridazione.
RISULTATI E CONCLUSIONI
La ibridazione molecolare con sonde a RNA complementare, marcate con digoxigenina e
rilevate con chemioluminescenza, si è dimostrata efficace nel diagnosticare la presenza di CEVd e
CCaVd in tessuti di agrumi allevati in pieno campo. La Fig. 1 mostra l’ibridazione a macchia di una
stessa serie di campioni ibridati con entrambe le sonde. L’ipotesi di una diversa distribuzione del
viroide sui quadranti della chioma non sembra essere consistente, in quanto il segnale è
sostanzialmente omogeneo ed in funzione della complessiva concentrazione nella pianta. Infatti,
dopo i primi campionamenti in cui sono state analizzate separatamente le diverse porzioni della
pianta, si è raccolto un unico campione per pianta (5-10 foglie da cui ricavare i 100mg da estrarre).
Una maggiore importanza assumono invece l’epoca del campionamento e la consistenza del
materiale vegetale. Sebbene sia stato sempre possibile rilevare la presenza dei viroidi ad ogni
campionamento stagionale, segnali di ibridazione più intensi sono stati ottenuti generalmente ad
inizio autunno, successivamente all’accumulazione estiva del viroide nei tessuti, da foglie mature
ma non disidratate. Le foglie primaverili più giovani risultano invece maggiormente ricche in
polisaccaridi e gomme che tendono a ridurre l’intensità del segnale.
L’ibridazione effettuata sui campioni provenienti da vivaio offre un quadro di risultati più
erratici. Si è ottenuto nella maggior parte dei casi (oltre il 70%) un segnale positivo di ibridazione
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anche da diluizioni di una foglia infetta su 5 o 10 foglie sane, ma talvolta sono risultati negativi
anche campioni presuntivamente infetti saggiati singolarmente. La presenza di questi falsi negativi
può essere imputabile sia allo scarso sviluppo raggiunto dalle piantine successivamente all’innesto
che ai limiti intrinseci ad un ridotto numero di campioni saggiati.
Il metodo di estrazione utilizzato permette di manipolare un numero elevato di campioni in
tempi rapidi (25-30 in meno di 3h) senza l’utilizzo di solventi organici: l’eliminazione del lavaggio
con fenolo-cloroformio riduce ulteriormente i tempi di estrazione e non altera l’intensità del segnale
(non mostrato). Un preliminare confronto fra il metodo di estrazione con SDS-potassio acetato ed
un altro che prevede una microcromatografia su particelle di silice (Foissac et al., 2000) dimostra
che un più consistente segnale è ottenibile con il primo metodo (Fig. 2, c vs. d). È stata anche
saggiata la sensibilità del metodo nell' individuare i viroidi a partire da quantità minime di tessuto
infetto. La minima quantità di estratto contenente CEVd che reagisce con la sonda è di 3µl, che
corrispondono a 1.5 mg di tessuto (Fig. 2). Per quanto riguarda la denaturazione dell’acido nucleico,
la Fig. 3 dimostra la superiorità della denaturazione alcalina a temperatura ambiente di un estratto
contenente CCaVd rispetto all’incubazione con formaldeide a temperatura più elevata (7%
formaldeide in 6x SSC, per 15min a 70°C).
L’utilizzazione di estratti purificati per la ibridazione anziché estratti grezzi (de Noronha
Fonseca et al., 1996) o impronte di tessuto (Palacio et al., 1999) ha permesso di poter rilevare
quantità minime di viroidi, dell’ordine di centinaia di picogrammi, direttamente da specie
commerciali di agrumi allevate in pieno campo e assolutamente asintomatiche mentre i citati lavori
suggerivano l’inoculazione della fonte su cedro ‘Etrog’ per un preventivo aumento del titolo che li
rendesse rilevabili.
Nella serie di ibridazioni su piante infettate da uno solo o da nessuno dei due viroidi, è
evidente l’assenza sia di ibridazione aspecifica con componenti della pianta che di reazione
incrociata fra i viroidi, che pure condividono alcuni frammenti di sequenza altamente conservati.
Ciò comporta che, ai fini di un programma di certificazione che richieda comunque l’esenza delle
piante propagate da entrambi questi patogeni, è possibile, se non auspicabile, l’uso di una miscela di
ribosonde che, senza discrimine, testimoni uno stato sanitario complessivo di sanità o infezione.
Nell’ambito della certificazione per il materiale CAC, ciò che occorre garantire è la sostanziale
esenza da determinati patogeni sia delle piante madri (portaseme e portagemma) che della
produzione vivaistica commerciale. La disponibilità quindi di un sistema di diagnosi multipla, che
rilevi sensibilmente più patogeni contemporaneamente nello stesso saggio, non può che offrire un
vantaggio nel ridurre tempi di lavorazione e costi.
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Tabella 1. Lista delle piante infette da viroidi utilizzate nella prova.
CEVd
CCaVd
Mandarino “Fedele”
1 p 20
4 p 15
4 p 35
7 p 21
10 p 1
10 p 5
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
Arancio “Naveline”
9p1
13 p 1
13 p 5
13 p 10
13 p 15
+
+
-
+
+
+
+
+
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A
B
Fig.1 – Ibridazione a macchia con ribosonde marcate con digoxigenina e rilevate con
chemioluminescenza su acidi nucleici totali estratti da agrumi provenienti da pieno campo: (A)
CEVd e (B) HSVd. L’equivalente di 25mg di tessuto sono stati caricati in ogni pozzetto dopo
denaturazione con NaOH-EDTA. In alcuni campioni vi è una ibridazione differenziale ai due
viroidi, in altri è presente la doppia infezione. Esposizione di 1h.
1
2
3
Fig. 2. Ibridazione di diluizioni crescenti di acido nucleico totale di agrumi sani e infetti da
CEVd. (1) estratto di pianta sana col metodo De Paulo e Powell (1995); (2) estratto di pianta
infetta col metodo Foissac et al., 2000); (3) estratto da pianta infetta col metodo De Paulo e
Powell. Diluizioni da sinistra: 20, 12.5, 7.5, 3.75, 1.5 mg di tessuto caricato per pozzetto.
A
B
Fig.3. Ibridazione di estratti di acido nucleico di piante infette da CCaVd denaturati con
formaldeide–SSC a 70°C (A) e con NaOH-EDTA a temperatura ambiente (B). Esposizione di
1h.
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Miglioramento della diagnosi sierologica di Citrus psorosis virus (CPsV) e di Citrus tristeza
virus (CTV)
A.M. D’Onghia1, K. Djelouah1 e O. Potere2
1
2
Istituto Agronomico Mediterraneo, Valenzano, Bari
Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata, Università degli Studi, Bari
La tristezza e la psorosi sono considerate le più importanti malattie da virus, fra quelle che
colpiscono le specie agrumicole, perché largamente diffuse ed altamente dannose (Roistacher,
1991).
Tra i saggi diagnostici, alternativi alla tradizionale inoculazione per innesto su ospiti legnosi,
le tecniche sierologiche ELISA e DTBIA sono risultate sicuramente le più valide in termini di
affidabilità, di modalità e tempi di esecuzione, nonché di rapporto costi benefici (Bar Joseph et al.,
1979; Cambra et al., 1991; Garnsey et al., 1993; Garcia et al., 1997; D’Onghia et al., 1998;
Djelouah e D'Onghia, 1998; Alioto et al., 1999; Potere et al., 1999; Djelouah et al., 2000; Cambra
et al., 2000; D’Onghia et al., 2001).
Gli agenti causali delle due malattie, CTV e CPsV, appartenendo a generi diversi,
closterovirus (Kitajiama et al., 1964) e ophiovirus (Milne et al., 2000), e possedendo peculiari
caratteristiche di diffusione all’interno dell’ospite, per il campionamento a fine diagnostico
impongono l’utilizzazione di espianti diversi. Per CTV si utilizzano i tessuti floematici, ed in
particolare il peduncolo, per CPsV, invece, le foglie mature. Entrambi i tessuti sono considerati i
più adatti per l’elevata concentrazione virale nei periodi autunnali e primaverili, ossia quando le
medie stagionali di temperatura rimangono entro valori compresi tra 18-24°C.
Successivamente si è notato che l’ovario è l'organo nel quale entrambi i virus sono maggiormente
concentrati e che garantisce risultati particolarmente soddisfacenti sia con la tecnica ELISA che con
quella del DTBIA.
Al fine di garantire l’assenza di questi patogeni pregiudizievoli della qualità sia nella fase di
produzione del materiale di propagazione “certificato” (categoria virus esente o virus controllato) e
CAC (Conformità Agricola Comunitaria nel DM 14/4/97), che nella fase di controllo e
monitoraggio di questi patogeni, relativamente agli areali agrumicoli, si è voluto procedere alla
messa a punto ed omologazione di un protocollo di diagnosi sierologica di facile ed economica
applicazione che consenta di individuare entrambi i virus con un’elevata attendibilità del risultato.
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L’analisi è stata condotta prelevando in primavera sia fiori chiusi che foglie da due
collezioni di fonti di CTV e di CPsV mantenute in serre a rete (Tab.1). In particolare, da ogni
accessione sono stati raccolti circa 50 campioni per espianto (fiori e foglie).
Successivamente si è fatto ricorso alla tecnica del DTBIA su ovario per entrambi i virus. In
alternativa ai fiori, sono stati utilizzati i peduncoli fogliari nel saggio DTBIA per CTV (Garnsey et
al., 1993) e le foglie mature nel saggio DAS-ELISA per CPsV (Potere et al., 1999). Come controlli
negativi sono stati impiegati gli stessi tessuti prelevati da piante sane.
Per la diagnosi di CTV è stato impiegato il kit commerciale della Plantprint (Spagna), mentre per
CPsV l’anticorpo MAb Ps29 prodotto localmente presso il DPPMA ed il kit commerciale
dell’Agritest (Italia), rispettivamente per DTBIA e DAS-ELISA.
Dalle prove effettuate, risultati molto soddisfacenti sono stati ottenuti utilizzando l'ovario e
la tecnica DTBIA per la diagnosi sierologica di CPsV e di CTV. In assenza dei fiori, CTV può
essere ancora diagnosticato mediante il DTBIA utilizzando il peduncolo, mentre per CPsV l’unica
alternativa è data dall’impiego del DAS ELISA sulle foglie mature.
È evidente la maggiore sensibilità dell’organo fiorale rispetto al tessuto tradizionale oltreché la
facilità di campionamento che consente di utilizzare un solo espianto per la diagnosi di entrambi i
virus. Come già riportato nei lavori precedenti (D’Onghia et al., 2001), il fiore può essere
conservato congelato a – 20°C e processato in qualsiasi momento dell’anno senza alterare
minimamente i risultati. Inoltre, le membrane impresse possono essere conservate per diversi mesi
prima di essere analizzate.
In conclusione, laddove è possibile utilizzare il fiore come organo per la diagnosi, si può
applicare la tecnica del DTBIA sia per CTV che per CPsV. Infatti, così procedendo si conseguono
risultati quali una più rapida esecuzione del campionamento e del saggio ed un conseguente
contenimento dei costi.
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Progetto POM A32 “Norme fitosanitarie e commercializzazione delle produzioni vivaistiche”
Locorotondo (BA), 4 – 7 dicembre 2001
Tabella 1. Accessioni di CPsV e CTV in collezione.
Specie/cultivar
Arancio dolce
Navel
Navel
Navelina V.C.
Navelina comune
Navelina comune
Washington Navel
Valencia
Shamouti
Mandarino e mandarino simili
Mandarino comune
Mandarino comune
Clementine comune
Clementine comune
Clementine comune rosso
Clementine Gentile
Satsuma
Tangerina
Altri agrumi
Pompelmo rosso
Pompelmo comune
Pomelo
C. Excelsa
Accessioni
N°
CPsV
Origine
2
1
5
5
1
2
1
1
USA
Libano
Italia
Italia
Libano
Libano
USA
Libano
1
1
1
1
1
2
2
1
Spagna
Libano
Italia
Libano
Italia
Italia
Italia
USA
1
2
2
1
Italia
USA
USA
USA
CTV
Arancio dolce
Washington Navel
Navel
Valencia
Shamouti
Mandarino e mandarino simili
Clementine
Limoni
Limone rugoso
Limone Meyer
Altri agrumi
Pompelmo Shaddock
Pompelmo comune
Kumquat
3
1
1
3
Libano
Palestina
Palestina
1 Libano, 2 Palestina
2
1 Libano, 1 Palestina
1
5
Italia
3 Albania, 1 Cina, 1 Italia
1
2
1
Egitto
1 Albania, 1 Libano
Italia
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Il virus della psorosi degli agrumi (CPsV): diagnosi sierologica e studio di variabilità.
M. Malfitano, E. Ragozzino, D. Alioto
Dipartimento Arboricoltura, Botanica e Patologia vegetale, Università degli Studi di Napoli
La psorosi è una delle più gravi e diffuse malattie degli agrumi trasmissibile per
innesto (Roistacher, 1993). Il probabile agente causale della malattia è il virus della psorosi
(CPsV), un virus filamentoso appartenente al genere Ophiovirus (Milne et al., 2000). Per
molti anni la diagnosi della malattia è stata effettuata mediante l’innesto su piante
indicatrici. L’applicazione di metodi sierologici (DAS e TAS ELISA) ha notevolmente
migliorato la diagnosi consentendo l’analisi di numerosi campioni in breve tempo ed a
costi contenuti, con possibilità di differenziare ceppi virali usando anticorpi monoclonali
(D’Onghia et al. 1998; Potere et al., 1999; Alioto et al., 1999, 2000; Djelouah et al., 2000).
Una tecnica alternativa all’ELISA, impiegata con successo nella diagnosi di
numerosi virus è il DTBIA (immunoimpronta di tessuto), tecnica più semplice, rapida ed a
basso rischio di contaminazione, in quanto richiede una bassa manipolazione dei campioni
(Lin et al., 1990; Makkouk et al., 1996; Garnsey et al., 1993).
Per valutare l’affidabilità del DTBIA nella diagnosi del CPsV e determinarne le
possibili limitazioni stagionali, dieci alberi, in cui era già stata previamente riscontrata la
presenza del CPsV, sono stati campionati in diversi periodi dell’anno. In ciascuno di essi
sei foglie adulte e sei giovani germogli, sono stati raccolti da ogni albero ed analizzati in
TAS ELISA secondo la metodica descritta da Alioto et al. (1999), impiegando l’antisiero
policlonale e monoclonale A322 e 13C5, forniti dall’Istituto di Fitovirologia Applicata,
CNR, Torino. Contemporaneamente gli stessi campioni sono stati analizzati in DTBIA con
l’antisiero 13C5 secondo la seguente procedura. Sezioni di foglie adulte e di giovani
germogli sono state appoggiate su membrane di Nylon, successivamente trattate con una
soluzione di tampone fosfato contenente 2% di Triton X-100 e 5% di latte scremato per 60
min. Le membrane sono state incubate per 90 min con l’anticorpo 13C5 diluito 1/10.000 in
tampone fosfato addizionato con il 5% di latte scremato. Le membrane sono state
successivamente trattate per 90 min con un anticorpo coniugato con fosfatasi alcalina
(Alkaline phosphatase coniugates of antimouse IgG-Sigma) diluito 1/20.000. La presenza
di particelle virali nell’impronta di tessuto è stata rilevata con il substrato cromogeno
NBT/BCIP e con il substrato chemioluminescente CSPD.
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I risultati ELISA indicano che la presenza del virus è diagnosticabile in tutti i
periodi dell’anno considerati, indipendentemente dal tipo di tessuto preso in esame, anche
se la concentazione virale è generalmente più bassa nelle foglie adulte rispetto ai germogli
giovani. La diagnosi del virus in DTBIA varia invece con la stagione e con il tipo di
tessuto impiegato per preparare l’impronta. La maggior parte delle impronte ottenute dai
giovani germogli in estate e tutte quelle ottenute in primavera danno una reazione positiva,
mentre la reazione delle impronte da foglie adulte risulta essere più variabile e talvolta
nessuna delle impronte reagisce positivamente con l’anticorpo (Tab.1).
La diagnosi immunoenzimatica effettuata su 53 piante di agrumi di varietà distinte,
dislocate in differenti aree della Campania, con l’impiego di 22 anticorpi monoclonali
forniti dal Centro di Studio sui Virus e le Virosi delle Colture Mediterranee, CNR, Bari
(Djelouah et al., 2000) e uno fornito dall’Istituto di Fitovirologia Applicata, CNR, Torino
(Alioto et al., 1999), ha rilevato una variabilità genetica del virus, evidenziata dalla
presenza di 9 distinti profili di reazione (Tab.2), seguendo la metodica descritta da Alioto
et al. (1999).
Tale variabilità è stata confermata a livello molecolare, esaminando il gene che codifica
per la proteina capsidica del virus mediante la metodica SSCP (polimorfismi
conformazionali della singola elica) (Alioto et al., 2001) (Fig. 1).
Bibliografia
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Locorotondo (BA), 4 – 7 dicembre 2001
Tabella 1. Confronto fra TAS-ELISAa e DTBIAb per la diagnosi del CPsV in piante di pieno campo, usando tessuti diversi in stagioni diverse.
INVERNO
ALBERI
AA
B
T
M1
M2
C
A
W1
W2
W3
S
a
PRIMAVERA
ESTATE
Foglie adulte
Germogli giovani
Foglie adulte
TAS-ELISA DTBIA
TAS-ELISA DTBIA
TAS-ELISA DTBIA
NT
1,980±0,209
2,921±0,359
3,195±0,794
2,885±0,483
2,376±0,589
2,112±0,172
2,003±0,439
1,811±0,205
2,441±0,339
0,005±0,001
0,505±0,208
0,725±0,156
0,611±0,147
0,618±0,255
0,787±0,502
0,327±0,129
0,908±0,077
0,422±0,094
0,432±0,163
0,463±0,157
0,007±0,003
0,051±0,027
0,140±0,044
0,116±0,035
0,126±0,043
0,103±0,003
0,091±0,027
0,153±0,036
0,154±0,045
0,090±0,022
NT
0,002±0,001
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
NT
NT
6/6
6/6
5/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
4/6
0/6
1/6
0/6
3/6
2/6
0/6
5/6
0/6
1/6
Germogli giovani
TAS-ELISA
DTBIA
0,960±0,462
0,612±0,223
0,881±0,388
0,602±0,185
0,692±0,176
0,895±0,232
0,516±0,084
0,934±0,183
0,543±0,225
0,401±0,104
0,004±0,003
5/6
6/6
6/6
6/6
4/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
Foglie adulte
TAS-ELISA DTBIA
0,154±0,088
0,248±0,070
0,176±0,112
0,308±0,120
0,255±0,138
0,078±0,026
0,344±0,125
0,153±0,062
0,198±0,163
0,097±0,009
0,004±0,003
I campioni i cui valori di densità ottica (D.O.) risultavano almeno tre volte superiori al D.O. del controllo sano erano considerati positivi ed
utilizzati per calcolare la media dei valori D.O. riportati in tabella. Questi erano ottenuti dalla media dei valori D.O. di due pozzetti per
campione, sottraendo il valore medio del controllo negativo e dividendo per il valore medio del controllo positivo.
b
Numero di campioni positivi in DTBIA rispetto al numero di campioni positivi in TAS-ELISA.
Le cultivar analizzate erano: Arancio amaro (AA), Arancio dolce “Biondo comune”, “Tarocco” e “Washington Navel” (B, T e W), Clementina
“Monreale” e “Comune” (M e C), Mandarino “Avana” (A). Sano (S).
1/6
6/6
4/6
6/6
3/6
1/6
6/6
6/6
6/6
5/6
Progetto POM A32 “Norme fitosanitarie e commercializzazione delle produzioni vivaistiche”
Locorotondo (BA), 4 – 7 dicembre 2001
Progetto POM A32 “Norme fitosanitarie e commercializzazione delle produzioni vivaistiche”
Locorotondo (BA), 4 – 7 dicembre 2001
Tabella 2. Profili di reazione tipici ottenuti saggiando 53 alberi in TAS-ELISA (Triple Antibody Sandwich-ELISA) con 23 anticorpi monoclonali
(Mabs). I campioni erano considerati positivi (+) quando la lettura a 405 nm, era almeno tre volte il valore del controllo negativo incluso nella stessa
piastra. I campioni negativi sono stati indicati come (-).
Mabs
Sierotipo PS1
A
+
B
C
D
+
E
+
F
G
+
H
I
-
PS4 PS6 PS7 PS8 PS11 PS13 PS14 PS15 PS17 PS18 PS21 PS22 PS23 PS24 PS25 PS26 PS27 PS28 PS29 PS31 PS34 2A3
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
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1
2
3
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7
8
9
Figura 1. Profili SSCP di isolati di CPsV appartenenti a
differenti sierotipi. L’analisi riguarda il frammento
corrispondente ai nucleotidi 66-740 del gene che codifica per la
proteina capsidica. Corsia 1, NA1 (A); corsia 2, NA37 (D);
corsia 3, NA42 (E); corsia 4, NA10 (G); corsia 5, NA88 (I);
corsia 6, NA5 (B), corsia 7, NA89 (H); corsia 8, NA8 (F);
corsia 9, NA6 (C). Le lettere maiuscole in parentesi indicano il
sierotipo, la sigla NA seguita dal numero si riferisce all’isolato
considerato.
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Protocollo per gli accertamenti sanitari degli organismi patogeni di qualità
degli agrumi
K. Djelouah, A. M. D’Onghia, A. Ippolito, G. Romanazzi, L. Schena, N. Trisciuzzi,
N. Vovlas
Progetto POM A32 “Norme fitosanitarie e commercializzazione delle produzioni vivaistiche”
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I. FUNGHI
INTRODUZIONE
La corretta identificazione dei patogeni pregiudizievoli la qualità del materiale di
propagazione è fondamentale per l’applicazione del D.M. del 14 aprile 1997. Di seguito si riportano
i rilievi e/o gli accertamenti di laboratorio standardizzati per ognuno dei patogeni considerati
nell’elenco definito all’interno del Progetto (D’Onghia et al., 2001). Gli accertamenti di laboratorio
sono stati riservati a quei patogeni che, potendo infettare le fonti e il relativo materiale di
propagazione anche in forma asintomatica, possono sfuggire alle sole osservazioni visive, nonché ai
patogeni terricoli identificabili esclusivamente mediante tecniche di laboratorio.
I rilievi visivi, da effettuarsi sia sulle fonti di approvvigionamento sia sul materiale prodotto
in vivaio, avranno periodicità annuale e saranno effettuati in concomitanza con il periodo di
massima espressione sintomatologica della malattia. Gli accertamenti di laboratorio sono stati
previsti sulle fonti di approvvigionamento e sulle piante madri a cadenza tale da garantirne la sanità,
sul terreno del vivaio prima dell’impianto e sui substrati colturali.
Marciume radicale e gommosi del colletto
Tra i patogeni fungini del materiale di propagazione agrumicolo, l’allegato II del D.M.
14/04/97 fa riferimento al genere Phytophthora senza alcuna distinzione delle specie coinvolte. La
proposta elaborata nell’ambito dell’attività svolta nel Progetto POM A32, invece, definisce le specie
maggiormente dannose per gli agrumi, ossia Phytophthora nicotianae e P. citrophthora,
responsabili del marciume radicale e della gommosi del colletto. Il protocollo prevede il rilievo dei
propaguli di P. nicotianae e P. citrophthora nel terreno, all’impianto del vivaio, e nei substrati
colturali ogni qualvolta si prepari una nuova miscela. La diagnosi di questi patogeni può essere
effettuata mediante isolamento in piastra su substrato semiselettivo o mediante ELISA. Queste
tecniche consentono di accertare la presenza dei patogeni sia nei tessuti infetti, sia nel terreno.
L’isolamento su substrato semiselettivo fornisce una misura quantitativa del numero di propaguli di
Phytophthora nicotianae e P. citrophthora nel terreno e sulle radichette; tale tecnica permette
l’identificazione morfologica delle specie coinvolte e fornisce una risposta nell’arco di 4-8 giorni.
La diagnosi mediante ELISA, invece, sebbene non riesca a discriminare la specie coinvolta,
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fornisce una risposta in tempi più brevi (da 20 minuti a 24 ore) e, limitatamente ad alcuni kit, può
essere effettuata anche in campo.
Malattia
Agenti
Marciume radicale e gommosi del colletto
Phytophthora nicotianae Breda de Haan, P. citrophthora (Sm. et Sm.) Leonian
Tipo di diagnosi Isolamento su terreno di coltura semiselettivo, ELISA
Isolamento su terreno di coltura semiselettivo
Affidabilità del
saggio
Matrice
Ottima
Terreno
Da inizio primavera a metà autunno
Epoca di
campionamento
I campioni, raccolti in sacchetti in polietilene sterili, devono essere conservati a
Modalità di
conservazione
temperatura ambiente e analizzati nell’arco di 4-7 giorni
Protocollo
adoperato
Diagnosi di Phytophthora spp. nel terreno mediante isolamento su substrato
semiselettivo (Allegato 1)
Nel substrato selettivo possono crescere anche funghi appartenenti a generi
Note e
limitazioni d’uso
affini come Pythium, Mortierella, ecc., pertanto è necessario effettuare delle
subculture per l’identificazione della colonia
ELISA
Affidabilità del
saggio
Disponibilità di
corredi di
anticorpi sul
mercato
Matrice
Buona
Discreta
Terreno
Da inizio primavera a metà autunno
Epoca di
campionamento
I campioni, raccolti in sacchetti in polietilene sterili, devono essere conservati a
Modalità di
conservazione
temperatura ambiente e analizzati nell’arco di 4-7 giorni
Diagnosi di Phytophthora spp. mediante ELISA (Allegato 2)
Protocollo
adoperato
In caso di risposta positiva, tale tecnica non riesce a distinguere la specie di
Note e
limitazioni d’uso
Phytophthora coinvolta
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Mal secco
Il D.M. del 14 aprile 1997 non prevede la diagnosi per Phoma tracheiphila, agente del “mal
secco” degli agrumi, poiché il patogeno è un organismo da quarantena; tuttavia, in considerazione
della possibilità di diffusione attraverso il materiale di propagazione e della frequenza con cui sono
state rinvenute piante infette in vivaio, si è ritenuto opportuno includere questo patogeno fra i
microrganismi per i quali è necessario effettuare la diagnosi sulle piante capostipiti e sulle piante
madri nei controlli sanitari per la produzione di materiale di categoria C.A.C. Tale diagnosi è
effettuata mediante isolamento del patogeno su terreno di coltura.
Malattia
Mal secco
Agenti
Phoma tracheiphila (Petri) Kanc. et Ghik.
Tipo di diagnosi Isolamento su terreno di coltura semiselettivo
Isolamento su terreno di coltura semiselettivo
Affidabilità del Ottima
saggio
Porzioni di tessuto xilematico prelevato da rami, branche o tronco
Matrice
Marzo-maggio e settembre-ottobre
Epoca di
campionamento
I campioni, raccolti in sacchetti in polietilene sterili, devono essere conservati a
Modalità di
conservazione
bassa temperatura e analizzati nell’arco di 4-7 giorni
Protocollo
adoperato
Diagnosi di Phoma tracheiphila nei tessuti legnosi mediante isolamento in
piastra su substrato semiselettivo (Allegato 3)
Possibilità di contaminazione del substrato qualora non si operi in asepsi
Note e
limitazioni d’uso
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PROTOCOLLI
Allegato 1
Diagnosi di Phytophthora spp. nel terreno
mediante isolamento su terreno di coltura semiselettivo
a) Prelievo dei campioni di terreno
1) individuare la forma e la superficie dell’appezzamento da sottoporre ad accertamento;
2) definire lo schema di prelievo dei campioni secondo percorsi preordinati dipendenti dalla
forma dell’appezzamento (ad es. a W, a doppio W, a Z, a X, etc.), in modo tale da non
escludere settori dal prelievo e da effettuare un campionamento sistematico-randomizzato,
ossia prelievo del campione ad intervalli regolari di n metri;
3) dopo aver allontanato uno strato superficiale di circa 5 cm, prelevare il campione di terreno
fino ad una profondità massima di 20-25 cm, servendosi di apposite sonde;
4) per ogni ettaro di terreno da sottoporre ad accertamento sanitario, prelevare almeno 10
campioni di circa 1 kg, costituiti ciascuno da 10 subcampioni;
5) nel caso dei terricci in vivaio, prelevare da punti diversi della massa 1 campione di circa 1
kg, costituito da 10 subcampioni, ogni 5 m3;
6) sistemare i terreni o i terricci in buste di plastica per il trasporto in laboratorio e conservarli a
temperatura ambiente fino al momento dell’analisi.
b) Lavorazione dei campioni in laboratorio
7) mescolare accuratamente i campioni nelle stesse buste ove sono contenuti;
8) setacciare i campioni con vaglio a maglie di 2 mm;
9) pesare due aliquote da 10 g di terra fina e porli in beute da 100 ml;
10) prelevare una aliquota da 20 g per la determinazione del peso secco (mediante essiccazione
in stufa a 105°C per 24 ore);
11) diluire in agar acqua (0,1%) ciascuna aliquota da 10 g in rapporto 1/10 (p/v);
12) porre in agitazione la sospensione per 3 min mediante un agitatore magnetico;
13) pipettare 1 ml della sospensione in 10 piastre Petri (Ø 90 mm) contenenti 12,5 ml di un
substrato selettivo (Masago et al., 1977; Ippolito et al., 1991) (Allegato 1-A);
14) incubare le piastre in termostato al buio alla temperatura di 19±1°C;
15) contare le colonie di Phytophthora spp. dopo 4 e 8 giorni di incubazione. La densità di
inoculo (DI) di Phytophthora spp. nel terreno viene espressa come numero di propaguli per
grammo di terreno secco.
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Locorotondo (BA), 4 – 7 dicembre 2001
Allegato 1-A
Substrato semiselettivo per Phytophthora spp. (Masago et al., 1977)
1) porre in un cilindro da litro 17 g di corn meal agar e portare al volume di 900 ml con acqua
distillata;
2) sterilizzare in autoclave a 1 atm per 20 min a 121°C;
3) raffreddare il substrato in bagno termostatato a 45-50°C;
4) aggiungere 100 ml di una soluzione antibiotica, contenente 27 mg di nystatin, 59 mg di
PCNB, 27 mg di benomyl, 14 mg di rifampicina, 580 mg di ampicillina, ognuno dei quali
sciolto in 20 ml di acqua distillata, e 0,25 ml di hymexazol;
5) agitare e dosare in piastre Petri con diametro di 90 mm (12,5 ml/piastra).
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Allegato 2
Diagnosi di Phytophthora spp. mediante ELISA
Il seguente protocollo è utile nella diagnosi di Phytophthora spp. sulla terra fina, ottenuta
per setacciamento del campione di terreno attraverso un vaglio con maglie di 2 mm. Un
miglioramento della sensibilità si ottiene utilizzando per la diagnosi i residui organici surnatanti,
ricavati ponendo in agitazione in matracci frangiflusso (270 rpm per 10 minuti) 100 g di terreno,
sospesi in 200 ml di acqua distillata (Romanazzi et al., 2001). I kit disponibili sono
commercializzati dalle Ditte Agdia e Loewe.
Procedura:
1) numerare i campioni da saggiare e predisporre lo schema della loro distribuzione nella piastra,
includendo in ogni prova almeno un paio di campioni sicuramente infetti e altrettanti
sicuramente sani;
2) frantumare 1 g di terreno in azoto liquido;
3) sospendere il frantumato in 10 ml del tampone di estrazione;
4) filtrare la sospensione;
5) avviare la sensibilizzazione della piastra distribuendo in ciascun pozzetto 100 µl di IgG diluite
in tampone di sensibilizzazione, seguendo le indicazioni del fornitore;
6) coprire le piastre con apposito coperchio e incubare per 4 ore a 37°C;
7) eseguire cinque lavaggi con tampone di lavaggio;
8) seguendo lo schema predeterminato, distribuire in ciascun pozzetto 100 µl della sospensione del
campione corrispondente;
9) coprire le piastre con apposito coperchio e incubare per una notte a 4°C;
10) eseguire cinque lavaggi con tampone di lavaggio;
11) distribuire 100 µl della sospensione di IgG coniugate con fosfatasi alcalina, diluite in tampone
di coniugazione come indicato dal fornitore;
12) coprire le piastre con apposito coperchio e incubare per 4 ore a 37°C;
13) eseguire cinque lavaggi con tampone di lavaggio;
14) distribuire in ogni pozzetto 100 µl di P-nitrofenil-fosfato (1 mg/ml) disciolto, pochi minuti
prima dell’utilizzo, in tampone per il substrato, accertandosi che il contenitore per la soluzione
sia privo di impurità;
15) lasciar sviluppare la reazione colorimetrica (viraggio a color giallo) a temperatura ambiente per
0,5 - 2 ore;
16) effettuare la lettura dei valori di assorbanza dei singoli pozzetti della piastra, ad intervalli di
circa 30 minuti, mediante un fotometro (lettore di piastre ELISA) a 405 nm. Si considerano
infetti i campioni con una assorbanza uguale o superiore alla somma tra la media delle letture
fotometriche relative ai testimoni non infetti e il triplo della loro deviazione standard (Sutula et
al., 1986).
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Allegato 3
Diagnosi di Phoma tracheiphila nei tessuti legnosi
mediante isolamento in piastra su substrato semiselettivo
a) Prelievo dei campioni legnosi
1) ispezionare tutte le piante fonti di approvvigionamento nel campo per accertare la presenza di
eventuali sintomi: clorosi delle foglie apicali, defogliazione, disseccamento dei rametti, dei
rami, colorazione rosa salmone dello xilema da poco infetto, etc. La diagnosi deve essere
effettuata su tutte le piante capostipiti e, annualmente, sul 10% delle piante madri;
2) sulle piante madri individuare il 10% delle piante da sottoporre ad accertamento diagnostico,
includendo quelle mostranti eventuali sintomi; le rimanenti dovranno essere individuate
secondo percorsi preordinati dipendenti dalla forma dell’appezzamento (ad es. a W, a doppio
W, a Z, a X, etc.), in modo tale da non escludere settori dal prelievo e saggiare tutte le piante
nell’arco di 10 anni;
3) da ciascuna branca principale prelevare 10-15 rametti; in presenza di sintomi prelevare
materiale non completamente disseccato;
4) sistemare i campioni raccolti per ciascuna pianta in buste di plastica numerate e trasportarli
in contenitori refrigerati.
b) Lavorazione dei campioni in laboratorio
5) disinfestare superficialmente i rametti mediante immersione in una soluzione di ipoclorito di
sodio all’1% per 30 s;
6) risciacquare abbondantemente i rametti in acqua sterile e lasciarli ad asciugare in ambiente
asettico;
7) sempre operando in condizioni di asepsi, allontanare la corteccia e gli strati più superficiali
del tessuto legnoso;
8) prelevare porzioni del tessuto xilematico e seminarle in piastre contenenti agar-patataglucosio addizionato di sostanze antibiotiche (Allegato 3-A); nel caso di rami con sintomi,
prelevare le porzioni di xilema dalla zona di confine tra la parte sana e quella disseccata;
9) incubare le piastre in termostato a 23±1°C e verificare periodicamente la crescita di eventuali
colonie fungine a partire dalla porzione di legno seminata; solitamente per P. tracheiphila
sono necessari 4-8 giorni di incubazione, al termine dei quali può essere possibile identificare
il patogeno sulla base delle caratteristiche morfologiche (aspetto e colore della colonia,
presenza di fialidi e fialoconidi, dimensione e forma dei picnidi e picnoconidi, etc.).
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Allegato 3-A
Preparazione del substrato semiselettivo per l’isolamento di P. tracheiphila
da tessuto legnoso (agar-patata-glucosio + antibiotici)
Materiale occorrente
200 g di patate;
20 g di glucosio;
20 g di agar;
250 mg di streptomicina solfato;
250 mg di ampicillina;
Acqua distillata fino ad 1 litro.
Procedura:
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
pelare e tagliare a cubetti le patate;
cuocere le patate in 600-700 ml di acqua distillata, in autoclave a 0,5 atm (110°C) per 10
min, ovvero su fiamma a 60°C per 1 ora;
filtrare il brodo ottenuto su un doppio strato di garza;
aggiungere il glucosio e l’agar;
portare a volume 900 ml;
sterilizzare ad 1 atm (121°C) per 20 min;
stabilizzare il substrato in bagno termostatato a 45-50°C;
aggiungere 100 ml di una soluzione antibiotica in acqua distillata sterile contenente 250
mg di streptomicina solfato e 250 mg di ampicillina;
agitare e dosare in piastre Petri con diametro di 90 mm (12,5 ml/piastra).
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BIBLIOGRAFIA
D’Onghia A.M., Ippolito A., Vovlas N., Savino V., 2001. Punti critici degli agrumi. In: Atti del
convegno Progetto POM A32 - I risultati di due anni di attività. Termoli, 1-2 marzo, 18 pp.
Ippolito A., De Cicco V., Salerno M., 1991. Aspetti eziologici ed epidemiologici del marciume
radicale degli agrumi da Phytophthora spp. in Puglia e Basilicata. Phytopathologia
Mediterranea 30: 47-51.
Masago H., Yoshikawa M., Fukada M., Nakanishi N., 1977. Selective inhibition of Pythium spp.
from soils and plants. Phytopathology 67: 425-428.
Romanazzi G., Nigro F., Schena L., Ligorio A., Pentimone I., Ippolito A., 2001. Impiego di kit
commerciali ELISA nella diagnosi di Phytophthora spp. agenti del marciume radicale degli
agrumi. Atti XIV Convegno Nazionale di Micologia, Selva di Fasano, Fasano (BR), 22-27
ottobre, 7. Micologia Italiana (in stampa).
Sutula C.L., Gillet J.M., Morrissey S.M., Ramsdell D.C., 1986. Interpreting ELISA data and
establishing the positive-negative threshold. Plant Disease 70: 722-726.
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II. NEMATODI
INTRODUZIONE
Per l’accertamento della presenza di nematodi fitoparassiti in un ambiente agrario e la
successiva determinazione della specie, fondamentale importanza rivestono la raccolta e l’esame
diagnostico di laboratorio dei campioni di terreno e delle parti
della pianta
infestati. La
conoscenza, quindi del comportamento biologico dei nematodi e del loro rapporto con le diverse
parti della pianta ospite è basilare per una corretta estrazione quantitativa e qualitativa.
CAMPIONAMENTO E METODI DI ESTRAZIONE
I campioni di vegetali e/o di terreno da analizzare, costituiti da sub-campioni prelevati a caso
(almeno 10 campioni finali per una superficie di 1 ha), devono essere posti in sacchetti di
polietilene e conservati, in attesa di essere esaminati, in cella frigorifera a 4–6°C per evitare
alterazioni (schiusa delle uova, morte delle larve, ecc.).
PRELIEVO E COMPOSIZIONE DEL CAMPIONE
Per il campionamento dei nematodi delle piante arbore (endoparassiti migratori e sedentari,
semi-endoparassiti e vettori di virus vegetali), ogni momento richiesto per un controllo fitosanitario
risulta adatto. Il campione (1-2 kg circa), prelevato dalla rizosfera della pianta ospite ad una
profondità di 5-40 cm, deve essere preferibilmente composto da radici capillari e terreno
circostante.
METODI DI ESTRAZIONE DEI NEMATODI DALLE RADICI
I nematodi fitoparassiti, in genere, possono invadere varie parti della pianta ospite. Nelle radici
di piante da frutto vari stadi di sviluppo di nematodi endoparassiti e semi-endoparassiti possono
essere presenti in varie fasi del loro sviluppo e possono essere estratti con il metodo della
omogeneizzazione.
Questo metodo è generalmente usato per estrarre i vari stadi di sviluppo di
nematodi sia endo- che semi-endo parassiti sedentari (Meloidogyne spp.e Tylenchulus
semipenetrans) e endo-parassiti migratori (Pratylenchus spp.).
Le attrezzature necessarie sono:
- un comune frullatore;
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- due setacci con maglie da 710 e 40 µm, rispettivamente.
Le varie fasi si possono riassumere così:
riduzione delle radici in pezzi da 1-1,5 mm;
frantumazione delle radici (10 g. circa in 100 ml di acqua) con il frullatore;
filtrazione della sospensione ottenuta attraverso i due setacci, posti l’uno sull’altro, con
maglie da 710 e 40 µm e successiva raccolta di nematodi e residui vegetali in sospensione
acquosa;
osservazione microscopica della sospensione ed identificazione dei nematodi.
La sospensione di nematodi, ottenuta con il metodo sinora descritto, può essere resa più limpida
con una opportuna centrifugazione.
METODI DI ESTRAZIONE DEI NEMATODI DAL TERRENO
I nematodi fitoparassiti possono essere presenti nel terreno sotto forma di uova, larve
infestanti, stadi larvali intermedi e adulti.
I nematodi liberi nella rizosfera possono essere recuperati con il metodo del travaso e con il metodo
della centrifugazione.
Travaso o setacciamento
Sono richiesti alcuni secchi da 5-6 litri e una serie di setacci con maglie di varia apertura
per raccogliere gli esemplari di tutte le dimensioni.
Le varie fasi dell’estrazione possono essere così riassunte:
sospensione in acqua di circa 1 kg di terreno;
uno o due travasi della sospensione in secchi successivi, osservando brevi pause per favorire
la decantazione dei residui terrosi più grossi;
filtrazione della sospensione attraverso 2 setacci da 710 e 40 mm per raccogliere i nematodi e
particelle terrose;
osservazione microscopica del campione.
Centrifugazione
Questo metodo è molto indicato per la raccolta di nematodi liberi attivi e passivi presenti nel
terreno. Le attrezzature che occorrono sono:
centrifuga con contenitori da almeno 500 ml;
rimescolatore (agitatore) a vibrazione.
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Procedimento:
sospendere il campione di terreno da esaminare in 4-5 litri di acqua;
concentrare attraverso un setaccio detriti organici e nematodi in modo da ottenere un
campione di 400 –500 ml, aggiungendo 10-20 g di caolino;
centrifugare per 3-5 minuti a 2500 giri;
eliminare il supernatante;
sospendere nuovamente il residuo (detriti e nematodi ) in una soluzione di solfato di magnesio
avente una densità di 1,2 (465 g di prodotto commerciale per litro di acqua), mediante un
agitatore;
centrifugare nuovamente per 2-3 minuti a 2000 giri/min.;.
recuperare i nematodi filtrando il supernatante attraverso un setaccio di 5 µm;
osservazione microscopica della sospensione.
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III.VIRUS
INTRODUZIONE
Secondo quanto previsto dal D.M. del 14/4/97, i controlli sanitari per la costituzione e
l'allevamento delle fonti di approvvigionamento ed in vivaio devono essere tali da garantire
l'assenza degli organismi nocivi e delle malattie che interessano la qualità. La non univoca
interpretazione di questo Decreto ha reso necessario, attraverso il progetto POM A32, la messa a
punto di un protocollo dei punti critici, in cui particolare attenzione è stata posta proprio sulle
modalità di campionamento e di saggio per la determinazione dello stato sanitario del materiale di
propagazione iniziale e sui controlli da adottare per consentirne la conservazione in sanità. Si è
inoltre cercato di semplificare la fase degli accertamenti sanitari sia nel numero di interventi sia per
le tecniche diagnostiche da adottare.
Dal protocollo si evince che nonostante l’esistenza di consolidate tecniche di laboratorio
molto avanzate ed ampiamente applicate per rapidità e facilità di esecuzione, la trasmissione per
innesto su ospiti legnosi costituisce ancora un passaggio obbligato nella diagnosi rivolta alla
costituzione delle fonti di approvvigionamento iniziali di agrumi, poiché ancora presenti malattie
virali delle quali si ignora l’agente causale. Inoltre, va anche ribadito che in commercio sono
disponibili corredi diagnostici non sempre in grado di fornire risultati attendibili (Roistacher, 1991).
Alla luce di quanto detto si è ritenuto utile fornire una breve descrizione dei patogeni e delle
malattie citate nel protocollo e dei metodi di diagnosi da utilizzare fornendo alcune indicazioni sulla
loro affidabilità oltreché applicabilità.
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CTV (virus della tristeza degli agrumi)
CTV è sicuramente uno dei patogeni più temibili degli agrumi. Esso viene trasmesso da
diverse specie di afidi vettori, tra i quali Toxoptera citricida, il più efficiente ma non ancora
presente nel Mediterraneo, e Aphis gossipii, responsabile della diffusione della malattia in Spagna
(1956) e in Israele (1970).
Il quadro sintomatologico dipende dal ceppo virale e dalla specie ospite. Il sintomo tipico di
deperimento fulminante della pianta è causato dal ceppo “quick decline”, che colpisce tutte le
varietà se in combinazione d’innesto con l’arancio amaro. La butteratura del legno è un’altra forma
della stessa malattia, che induce questo sintomo soprattutto su pompelmo e su alcuni portinnesti;
infine “il giallume dei semenzali” rappresenta sicuramente il ceppo più distruttivo che provoca forte
nanismo e morte della pianta.
CTV si trasmette per innesto su ospiti legnosi. La limetta è l’indicatore universale, mentre
l’arancio Madame vinous, l’arancio amaro e il pompelmo Duncan consentono di evidenziare la
presenza di uno dei tre ceppi del virus. L’esito diagnostico dell’indexaggio biologico si ottiene
nell’arco di 2 mesi di tempo.
Tra le diverse tecniche di laboratorio disponibili per l’accertamento del CTV, l’ELISA e il
DTBIA sono quelle più largamente utilizzate perché in grado di rilevare il virus con elevata
attendibilità attraverso i tessuti fiorali o, in loro assenza, attraverso il peduncolo fogliare.
Il saggio biologico e quello sierologico sono entrambi indispensabili per operare una diagnosi
accurata nella fase di produzione del materiale ‘sano’. I controlli sanitari previsti per questo virus
sul materiale in certificazione potranno invece essere esclusivamente sierologici.
Agente
Disponibilità di corredi di
anticorpi sul mercato
Tipo di tessuto
Epoca di campionamento
Modalità di conservazione
Protocollo adoperato
Note e limitazioni d’uso
CTV (virus della tristeza degli agrumi)
Elevata
Espianti di fiori chiusi (ovario e pistillo) o peduncolo fogliare
Primavera (Fioritura)
Fiori chiusi asciutti in Piastre Petri a
• 4° C fino a 1 mese
• –20° –70°C fino a 1 anno
Foglie in buste di plastica a 4°C fino a 1 settimana
DAS-ELISA (Allegato 1)
DTBIA (Allegato 2)
È preferibile usare l’espianto fiorale ossia l’ovario nel
caso del DTBIA ed il pistillo nel caso dell’ELISA.
CPsV (virus della psorosi degli agrumi)
Virus spesso presente in forma latente, CPsV induce la tipica desquamazione corticale su
arancio dolce, mandarino e mandarino simili. Le scolorazioni perinervali sui giovani germogli
primaverili sono abbastanza diffuse, mentre rara è la sintomatologia di maculatura anulare sulle
foglie mature sui frutti. Alcuni ceppi di CPsV si trasmettono meccanicamente, anche se con
difficoltà, su ospiti erbacei (Chenopodium amaranticolor e C. quinoa).
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I saggi sierologici ELISA e DTBIA sono ad elevata affidabilità e consentono di effettuare
rapidamente diagnosi su larga scala. Sono da preferirsi i tessuti fiorali, ossia il pistillo nel caso
dell’ELISA e l’ovario in quello del DTBIA. In assenza dei fiori si possono usare foglie mature, ma
soltanto in ELISA.
Il saggio biologico si effettua per innesto di corteccia o gemma su Dweet tangor e arancio
Navelina o Madame vinous.
Agente
Disponibilità di corredi di
anticorpi sul mercato
Tipo di tessuto
Epoca di campionamento
Modalità di conservazione
Protocollo adoperato
Note e limitazioni d’uso
CPsV (virus della psorosi degli agrumi)
Discreta
Espianti di fiori chiusi (ovario e pistillo) o foglie mature
Primavera (Fioritura)
Fiori chiusi asciutti in Piastre Petri a
• 4° C fino a 1 mese
• –20° –70°C fino a 1 anno
Foglie e talee in buste di plastica a 4°C fino a 1 settimana
DAS-ELISA (Allegato 1)
DTBIA (Allegato 2)
È preferibile usare l’ovario nel caso del DTBIA ed il
pistillo nel caso dell’ELISA.
CIVV (virus della variegatura infettiva degli agrumi)
La variegatura infettiva è una malattia, poco diffusa, che interferisce raramente sullo
sviluppo e sulla produttività delle piante e sulle caratteristiche organolettiche dei frutti. È un virus
che si manifesta prevalentemente sul limone con i sintomi tipici di bollosità e di variegatura delle
foglie. Si trasmette meccanicamente su ospiti erbacei, in particolare su Vigna unguiculata,
utilizzando foglie giovani possibilmente con sintomi. Nel saggio biologico, per innesto di corteccia
o gemma, conviene utilizzare sia il cedro Etrog che il limone Eureka. Il saggio sierologico ELISA
non è molto affidabile ed in commercio è disponibile solo un kit di anticorpi monoclonali.
Agente
Disponibilità di corredi di
anticorpi sul mercato
Tipo di tessuto
Epoca di campionamento
Modalità di conservazione
Protocollo adoperato
Note e limitazioni d’uso
CIVV (virus della variegatura infettiva degli agrumi)
Scarsa
Pistillo di fiori chiusi o foglie giovani
Primavera (Fioritura)
Fiori chiusi asciutti in Piastre Petri a
• 4° C fino a 1 mese
• –20° –70°C fino a 1 anno
Foglie e talee in buste di plastica a 4°C fino a 1 settimana
DAS-ELISA (Allegato 1)
Il kit attualmente disponibile in commercio non è molto
affidabile.
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CCaVd (citrus cachexia viroid)
CCaVd è presente nella maggior parte degli agrumeti poiché trasmissibile attraverso gli
attrezzi di taglio. I danni che può provocare su mandarino e mandarino-simili, in particolare sul
tangelo Mapo che ne è particolarmente suscettibile, sono la butteratura del legno e l’impregnazione
di gomma nello spessore della corteccia. Come tutti i viroidi si replica molto bene nel cedro Etrog
mantenuto ad alte temperature e la diagnosi si basa essenzialmente sull’utilizzo del sPAGE e
dell’ibridazione molecolare (Dot blot).
Agente
Disponibilità di corredi
diagnostici sul mercato
Tipo di tessuto
Modalità di conservazione
Protocollo adoperato
Note e limitazioni d’uso
CCaVd (Citrus cachexia viroid)
Disponibili per sPAGE
Foglie
Foglie in buste di plastica a 4°C fino a 1 settimana
sPAGE (Allegato 3)
Dot Blot (Allegato 4)
Per l’elettroforesi è necessario replicare il viroide in vivo
utilizzando il cedro Etrog allevato a 34°C.
CEVd (citrus exocortis viroid)
CEVd, anch’esso largamente diffuso, causa danni molto gravi solo se colpisce il trifogliato
ed i suoi ibridi o la limetta. I sintomi tipici sono le fessurazioni verticali della corteccia, al di sotto
della quale possono riscontrarsi impregnazioni gommose, sviluppo ridotto e scarsa produttività delle
piante infette. Questo viroide, del quale si conoscono ceppi a diversa virulenza, si trasmette
meccanicamente o per innesto su cedro Etrog, inducendo prevalentemente l’epinastia delle foglie.
Le piante di Etrog inoculate devono essere mantenute ad alte temperature (32-35°C) ed i sintomi
compaiono sui giovani germogli dopo circa tre settimane.
È indispensabile utilizzare il saggio elettroforetico (sPAGE) per evidenziare la presenza non
solo del CEVd, ma anche degli altri viroidi degli agrumi e se si intende produrre una fonte iniziale
‘sana’. Per gli accertamenti sanitari di routine è sufficiente il saggio di ibridazione molecolare (Dot
blot).
Agente
Disponibilità di corredi
diagnostici sul mercato
Tipo di tessuto
Modalità di conservazione
Protocollo adoperato
Note e limitazioni d’uso
CEVd (Citrus exocortis viroid)
Disponibili per sPAGE
Foglie
Foglie in buste di plastica a 4°C fino a 1 settimana
SPAGE (ALLEGATO 3)
Dot Blot (Allegato 4)
Per l’elettroforesi è necessario replicare il viroide in vivo
utilizzando il cedro Etrog allevato a 34°C.
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Allegato 1
DAS-ELISA (Clark e Adams, 1977)
1. Assegnare a ciascun campione da saggiare un’apposita numerazione e predisporre lo
schema della loro distribuzione nella piastra su apposita scheda. Accertarsi di includere
nello schema, come testimoni, anche alcuni campioni (almeno due) sicuramente infetti ed
altrettanti sicuramente sani;
2. preparare i campioni da saggiare omogeneizzando i tessuti con mortaio e pestello, o altra
idonea apparecchiatura meccanica, in presenza di tampone di estrazione (in rapporto di
circa 1:10 peso/volume), trasferire il succo in provette e lasciare decantare a 4°C;
3. avviare la sensibilizzazione della piastra distribuendo in ciascun pozzetto 100 µl di IgG
purificate diluite in tampone di sensibilizzazione, seguendo le indicazioni del fornitore;
4. coprire la piastra con apposito coperchio o film adesivo e porla in camera umida;
5. incubare 2 h a 37 °C o 16 h a 4 °C;
6. eseguire tre lavaggi di 3 min. ciascuno con tampone di lavaggio;
7. seguendo lo schema predeterminato, distribuire in ciascun pozzetto 100 µl di succo, privo
di sedimenti, del campione corrispondente;
8. coprire la piastra con apposito coperchio o film adesivo e porla in camera umida;
9. incubare a 4 °C per tutta la notte;
10. eseguire tre lavaggi di 3 min. ciascuno con tampone di lavaggio;
11. distribuire 100 µl della soluzione di IgG coniugate con fosfatasi alcalina, diluite in
tampone di coniugazione come indicato dal fornitore;
12. coprire la piastra con apposito coperchio o film adesivo e porla in camera umida;
13. incubare 2 h a 37°C o 16 h a 4 °C;
14. eseguire tre lavaggi di 3 min. ciascuno con tampone di lavaggio;
15. distribuire 100 µl per pozzetto di P-nitrofenil-fosfato disciolto (1 mg/ml), pochi minuti
prima dell'utilizzo, in tampone substrato (accertarsi che il contenitore utilizzato per
disciogliere il substrato sia assolutamente privo di impurità);
16. lasciar sviluppare la reazione colorimetrica (viraggio a color giallo) a temperatura
ambiente per circa 0,5 – 2 ore;
17. effettuare la lettura dei valori di assorbanza dei singoli pozzetti della piastra, ad intervalli
di 30 min., mediante un fotometro (lettore di piastre ELISA) a 405 nm;
In caso di momentanea indisponibilità del lettore è possibile bloccare la reazione mediante
ulteriore distribuzione di 25 µl di NaOH 3,0 M per pozzetto.
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Composizione dei tamponi
PBS
8 g NaCl
0,2 g KH2PO4
2,9 g Na2HPO4 x 12 H2O (1,15 g se anidro)
0,2 g KCl
0,2 g NaN3
H2O distillata fino a 1 lt
pH 7,4
Tampone di lavaggio (washing buffer)
1,0 lt PBS
0,5 ml Tween 20
pH 7,4
Tampone di coniugazione (conjugate buffer)
1 lt PBS
0,5 ml Tween 20
20 g Polivinilpirrolidone, MW 24.000
2 g Sieroalbumina bovina (BSA)
pH 7,4
Tampone di sensibilizzazione (coating buffer)
1,59 g Na2CO3
2,93 g NaHCO3
0,2 g NaN3
H2O distillata fino a 1 lt
pH 9,6
Tampone di estrazione (extraction buffer)
1 lt PBS
0,5 ml Tween 20
20 g Polivinilpirrolidone, MW 24.000
pH 7,4
Tampone substrato (Substrate buffer)
97 ml Dietanolammina
0,2 g NaN3
HCl fino a pH 9,8
a volume di 1lt con acqua distillata
Attrezzature necessarie
Premesso che attualmente l’industria è in grado di fornire apparecchiature che consentono la
parziale automazione di tutte le operazioni ELISA, di seguito vengono indicate le
apparecchiature e strumentazioni ritenute più importanti o indispensabili (queste ultime in
corsivo).
Piastre in Polistirene a 96 pozzetti
Mortai e pestelli
Vetreria (cilindri, beute)
Pipette graduate (mono e multicanali)
Agitatori magnetici
pH-metro
Frigorifero e congelatore
Incubatore (a 37 °C)
Lettore di piastre
Apparecchiature per la estrazione dei campioni (presse, trapani, ecc.)
Bi-distillatore
Fra i reagenti ricordiamo:
anticorpi monoclonali e/o policlonali
prodotti chimici comuni per la preparazione di soluzioni e tamponi
enzimi (se si effettua direttamente la coniugazione)
substrati
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Gli anticorpi possono essere acquistati presso ditte commerciali. Fra esse ricordiamo: Agdia,
Agritest, Bioreba AG, Boehringer, Direction des Domaines Agricoles-UCP (Marocco), Loewe
Biochemia GmbH e Biorad (ex-Sanofi Diagnostic Pasteur), Real Durviz.
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Allegato 2
DTBIA (D’Onghia et al., 2001)
1- Assegnare a ciascun campione da saggiare un’apposita numerazione e predisporre lo schema
della loro distribuzione su una membrana di nitrocellulosa su apposita scheda; nello schema
sono inclusi, come testimoni, anche alcuni campioni (almeno due) sicuramente infetti ed
altrettanti sicuramente sani.
2- Preparare i campioni eseguendo due impronte di ovario per espianto su una membrana di
nitrocellulosa (tipo BioRad 45 µm).
3- Lasciare le membrane ad asciugare per almeno mezz’ora (la membrana può essere
conservata per diversi mesi).
Da questo punto è preferibile mettere la membrana in un contenitore ad agitazione a bassa
velocità.
4- Incubare le membrane per 2 ore a temperatura ambiente o 16 ore a 4°C, in una soluzione
acquosa di BSA (Sieroalbumina bovina) all’1%.
5- Eseguire tre lavaggi di 3 min. ciascuno con tampone di lavaggio (PBS con 0,05% di Tween
20).
6- Incubare la membrana per 3 ore a temperatura ambiente in tampone di coniugazione
contenente anticorpi monoclonali coniugati alla fosfatasi alcalina alla diluizione indicata dal
fornitore.
7- Eseguire tre lavaggi di 3 min. ciascuno con tampone di lavaggio (PBS con 0,05% di Tween
20).
8- Porre la menbrana in una soluzione di sviluppo con BCIP-NBT (una tavoletta di Sigma fast
BCIP NBT in 10 ml di acqua distillata) fino alla comparsa della colorazione del controllo
positivo. Accertarsi che il contenitore utilizzato per disciogliere il substrato sia
assolutamente privo di impurità.
9- Bloccare la reazione colorimetrica sciacquando la membrana in acqua.
10- Osservare la membrana con l’ausilio di un binoculare (ingrandimento 10x-20x).
Per la diagnosi di CTV è stato impiegato il kit commerciale della Plantprint (Spagna), per CPsV
l’anticorpo monoclonale dell’Agritest (Italia).
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Allegato 3
sPAGE
Estrazione e Purificazione
1. Prelevare 5 gr di foglie giovani di Etrog allevato a 34°C;
2. triturare i campioni in azoto liquido, dapprima in mortai sterili e poi con Mulinex, versare il
contenuto in becker sterile, da porre su agitatore magnetico, con 20 ml di tampone di
estrazione (tris-HCl 0,4 M pH 8.9, SDS 1%, EDTA 5 mM pH 7,00), 20 ml di fenolo pH 7.5,
quindi lasciare in agitazione per 10 min. a temperatura ambiente;
3. versare il contenuto dei becker in bottiglie di policarbonato da 250 ml e centrifugare a 8.000
giri per 10 min. a 20°C;
4. prelevare il sovranatante, inserirlo in becker pulito ed aggiungere 10 ml di fenolo + 10 ml di
cloroformio e lasciare in agitazione per 5-10 min. a temperatura ambiente;
5. versare il contenuto dei becker nelle bottiglie di policarbonato e centrifugare a 8.000 giri a
temperatura ambiente per 10 min.;
6. prelevare il sovranatante (circa 20 ml) e versarlo in becker puliti - portare a 100ml con: 10
ml di STE 10X + 35 ml di etanolo (35%) + circa 35 ml di acqua distillata sterile + 1 gr di
cellulosa CF11 (1gr ogni 10 gr di tessuto di partenza);
7. agitare 2-3 ore lentamente a temperatura ambiente o meglio overnight;
8. centrifugare il contenuto del becker a 8.000 giri a temperatura ambiente per 10 min. e
scartare il sovranatante;
CF11 cellulose chromatography
1. Lavaggio per più volte delle provette con STE 1X + il 35% di etanolo centrifugando a
8.000 giri a 4°C per 5 min.;
2. versare la soluzione equilibrata con 35% di etanolo in STE 1X per fare la colonna di
cellulosa CF11;
3. lavare la colonna cromatografica con STE 1X + il 35% di etanolo;
4. lavare la colonna cromatografica con 1 ml di STE 1X;
5. eluire con un volume di STE 1X pari a 3-4 volte il volume della cellulosa CF11;
6. al volume raccolto aggiungere 3 volumi di etanolo + 0,1 volume di sodio acetato 3M pH
5,5;
7. conservare a –20 o –70°C;
8. centrifugare più volte a 10.000 giri a 4°C per 30 min., eliminando il sovranatente;
9. asciugare le provette su carta assorbente per. 30 min;
10. risospensione del pellets con circa 1,5 ml di acqua sterile (volume finale 2 ml) ed
aggiungere 1 volume di una soluzione di K2HPO4 2,5 M pH 8 + 1 volume di
metoxietanol, agitare e centrifugare a 7.000 giri a 4°C per 5 min.;
11. recuperare il sovranatante ed ad 1 volume di fase acquosa 1/20 di sodio acetato di 3 M
pH 5,5 e 1/20 di Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide e lasciare 5 min. in ghiaccio;
12. centrifugare a 7.000 giri a temperatura ambiente per 15 min.;
13. asciugare il pellets, risospenderlo in 200 ul di acqua sterile e conservare a –70 o a –20
°C;
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Diagnosi dei viroidi attraverso i seguenti gel in sequenza:
1. polyacrilammide gel non denaturante pH 7,2
2. polyacrilammide gel denaturante pH 6,5
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Allegato 4
Protocollo standardizzato per la diagnosi di viroidi degli agrumi mediante ibridazione
molecolare con ribosonde marcate con digoxigenina.
Uso
Il protocollo descritto é stato sviluppato per la diagnosi dei principali viroidi degli agrumi (citrus
exocortis viroid , CEVd, citrus cachexia viroid, CCaVd)
Il protocollo é stato validato nel corso di test effettuati presso il Dipartimento di Protezione delle
Piante e Microbiologia Applicata (Università degli Studi) e Centro di Studio del CNR sui Virus e le
Virosi delle Colture Mediterranee (Bari), adoperando isolati virali di differente provenienza
geografica, mantenuti in campo su piante infette di diverse specie di agrumi (arancio dolce,
mandarino).
Limitazioni d’uso
La scarsa concencentrazione dei viroidi in oggetto nella pianta infetta e eventuali variazioni del loro
titolo nel corso della stagione vegetativa possono ridurre sensibilmente la diagnosi. Pertanto, un
risultato negativo non garantisce l’esenza del viroide in esame nella pianta, ma piuttosto l’inabilità
di diagnosticarlo nel substrato e con il metodo utilizzato.
Le sonde utilizzate sono state clonate da Istituti di ricerca che possiedono una larga esperienza nel
campo delle malattie da viroidi. Esse rappresentano la copia fedele di DNA (DNA complementare)
di uno specifico isolato, reputato essere il piu' "universale" e diffuso.
Sonde
Le sonde sono state fornite gentilmente dalla Prof.ssa R. La Rosa (Università di Catania). Si tratta
di plasmidi (vettori di trascrizione pSP65) contenenti:
a)copia intera del CEVd, variante "d" (Visdaver e Symons, Nucleic Acid Research, 13,
2907-2920);
b) copia intera di hop stunt viroid , isolato "cetriolo" (Sano et al., Nucleic Acid Research, 12,
3427-3434). Il viroide della cachexia-xiloporosi appartiene al gruppo II dei viroidi degli agrumi ed
é sostanzialmente un ceppo di HSVd.
Le sonde descritte nel protocollo sono risultate specifiche per la diagnosi di alcuni viroidi degli
agrumi. Data la conservazione di frammenti di sequenza fra viroidi dello stesso gruppo tassonomico
(quali sono la maggior parte di quelli che infettano gli agrumi), un debole risultato positivo
(utilizzando le sonde separatamente su di uno stesso campione) potrebbe essere dovuto ad una
reazione incrociata (rilevamento di differenti viroidi che condividono la stessa regione conservata ).
Abbreviazioni usate nel testo
cDNA
DNA complementare
NTPs
ribonucleotidi
NaCl
sodio cloruro
NaOH
sodio idrossido
LiCl
litio cloruro
SDS
sodio dodecil solfato
Tris
tris-idrossimetil-amminometano
EDTA
acido etilendiamminotetracetico (sale bisodico)
CSPD/CDP Star*
substrato chemioluminescente per la fosfatasi alcalina
DIG
digoxigenina
UTP
uracil trifosfato
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SN
TE
RNasi
µl
supernatante
Tris -EDTA
ribonucleasi
microlitro
Breve sintesi del protocollo di diagnosi
Questo protocollo descrive un metodo di diagnosi che permette di rilevare alcuni importanti
viroidi degli agrumi, fino ad una sensibilità dell'ordine della decina di picogrammi di RNA, in
estratti di acido nucleico totale provenienti da circa 10-25 mg di tessuto fogliare o floematico.
L'RNA totale viene estratto mediante una precipitazione differenziale in potassio acetato,
dopo una frammentazione fisica e chimica delle cellule in un tampone di lisi e la successiva
denaturazione della frazione proteica. L'acido nucleico viene lavato con fenolo-cloroformio e infine
precipitatato in miscela idroalcolica.
L'RNA viene denaturato in 50mM sodio idrossido, aliquotato su membrane di nylon e
ibridato con una sonda costituita da RNA complementare a singola elica, marcato, in
corrispondenza del residuo UTP, con digoxigenina. Quest'ultima molecola viene poi individuata
incubando con uno specifico anticorpo, coniugato con fosfatasi alcalina che a sua volta,
idrolizzando un opportuno substrato chemioluminescente, permette la emissione di fotoni catturati
da una pellicola autoradiografica.
Strumentazione necessaria
Il protocollo è stato sviluppato adoperando la seguente strumentazione:
Aspiratore a 96 pozzetti sotto vuoto (vacu-blot)
Incubatore rotante per ibridazione
Omogeneizzatore-estrattore a vibrazione per microtubi
Termoblocchi a temperatura costante
Agitatore per microtubi (vortex)
Microcentrifuga da banco
Micropipette tarate
Refrigeratore (+4°C)
Stufa per sterilizzazione
Autoclave per sterilizzazione
Bagnomaria termostatato
Cappa a flusso laminare per batteriologia
Incubatore-agitatore per colture batteriche
Cassetta per esposizione autoradiografica
Vaschetta per elettroforesi orizzontale
Alimentatore per elettroforesi (200V)
Transilluminatore UV
Reagenti e soluzioni
Kit di trascrizione e marcatura
"Dig RNA labelling (SP6/T7)"
(ABN ; BioRad)
(Hybaid)
(Mixer Mill 300, Retsch)
(Flow)
(Brown)
Fornitore o preparazione
Roche (cd 1175025)
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Enzimi
HindIII
HincII
RQ1 DNAse
RNAsi A (10mg/ml)
Proteinase K (5mg/ml)
Tampone di estrazione per RNA :NaCl 100mM, Tris 100mM pH 8.0, EDTA 5mM
SDS 10%
LiCl 4M
etanolo 100%
potassio acetato (KOAC) 5M
ammonio acetato 5M
sodio acetato 3M pH 5.5
fenolo saturato con acqua e neutralizzato con Tris pH8
cloroformio
EDTA-bisodico 0.5M pH 8.0
soluzioni di sviluppo e fissaggio per autoradiografia (Kodak)
soluzione nutritiva per batteri 'Luria -Bertani' :tryptone 10g/l, estratto di lievito 5g/l, NaCl 5 g/l
soluzione per lisi batterica: saccarosio 8%, Tris-HCl 20mM,pH8.0, EDTA 50mM, Triton X-100
0.5%
lisozima 20mg/ml
ampicillina 200mg/ml
acqua RNAsi-free
etidio bromuro 10mg/ml
agarosio 1.2% in TBE
tampone elettroforetico (TBE: 100mM Tris, pH8.3, 100mM acido borico, 2.5mM EDTA)
colorante per elettroforesi :glicerolo 30%, bromofenolo blu 0.01% in Tris 10mM, EDTA 1mM
SSC 20X :0.15M NaCl, 0.015M sodio citrato tribasico, pH7.0
tampone della fosfatasi alcalina :100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100mM NaCl, 50mM MgCl2:
tampone maleico:0.1M acido maleico, 0.15M NaCl, pH7.5, aggiustare il pH con NaOH concentrato
Consumabili vari
Membrana Nylon per ibridazione : Hybond N+ (AP Biotech)
Provette da microcentrifuga da 1,5 ml
Puntali per pipette
Lastre autoradiografiche : Fuji HR E-30
Tubi sterili monouso (1.5, 2.0, 15 ml)
Protocollo
1. Preparazione della sonda marcata
Tutti i passaggi di coltura batterica devono essere effettuati necessariamente sotto la cappa a flusso
laminare, usando plastica sterile monouso.
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1.1 Coltura batterica
- Conservazione dei batteri - I plasmidi sono stati inseriti in Escherichia coli (ceppo DH5α). Dopo
la crescita in brodo nutritivo, con ampicillina (100µg/l), 800µl di coltura si aggiungono a 200µl di
glicerolo sterile. I tubi vanno mescolati delicatamente e conservati in freezer a -80°C.
- Preparazione delle piastre agarizzate - Sciogliere i componenti del brodo LB in acqua bidistillata.
Aggiungere agar alla concentrazione 15g/l. Sterilizzare in autoclave alla temperatura di 121°C per
20min. Far raffreddare in bagnomaria a 55°C per 15min. Aggiungere, sotto cappa, la dose di
ampicillina per la concentrazione finale di 100µg/l. Versare circa 20 ml in piastre Petri di plastica
sterile. Far solidificare le piastre, tenendole aperte sotto cappa, per qualche minuto. Chiuderle in
busta di plastica e conservarle in refrigeratore a +4°C. Le piastre sono utilizzabili per circa 30
giorni , si consiglia di prepararne piccole quantità (100-200ml).
- Coltura su piastra agarizzata - Una piccola quantità di batteri ancora congelata va prelevata con
un'ansa sterile e diffusa sulla superficie della piastra. La stessa va incubata a 37°C per circa 12-16h,
poi chiusa con Parafilm e conservata a +4°C. La coltura su mezzo agarizzato va rinnovata ogni 3040 giorni.
- Coltura liquida - Una colonia batterica isolata va prelevata con ansa sterile e inoculata in due ml
di brodo LB (con ampicillina 100µg/l) in tubo sterile chiuso. Incubare per 12-16h in agitazione (250
rpm) a 37°C.
- Lisi delle cellule batteriche ed estrazione dei plasmidi - Aliquotare la coltura arricchita in due
microtubi. Centrifugare alla massima velocità per 1min. Rimuovere il supernatante (sterilizzarlo in
autoclave o aggiungere 20% ipoclorito di sodio) e far drenare i tubi su carta. Aggiungere 350 µl di
tampone di lisi e 20µl di lisozima. Agitare e risospendere. Incubare in acqua bollente per 45" e
immediatamente porre in ghiaccio per 2min. Centrifugare per 15-20 min alla massima velocità.
Rimuovere il pellet con stuzzicadenti (sterilizzati in autoclave). Aggiungere 200µl di fenolo
neutralizzato e 200µl di cloroformio. Agitare vigorosamente e centrifugare per 3min alla massima
velocità. Prelevare il SN e aggiungere 125µl di ammonio acetato e 1ml di etanolo assoluto freddo.
Agitare e centrifugare alla massima velocità per 5min. Eliminare il SN e aggiungere, senza
disturbare il pellet, 1ml di etenolo 70% freddo. Centrifugare nuovamente per 2' con la stessa
orientazione del tubo. Eliminare il SN e, dopo aver fatto asciugare il pellet per qualche minuto,
risospendere in 100µl di TE ed 1µl RNAsi A (10mg/ml).
- Digestione enzimatica dei plasmidi - Leggere allo spettrofotometro una diluizione del plasmide
estratto 1:25 in acqua alla lunghezza d'onda di 260 e 280nm. Utilizzare il volume contenente 2.53.0 µg di DNA, aggiungere 10µl del tampone dell'enzima e due unità di enzima (Hind III per
HSVd , HincII per CEVd). Portare a 100µl di volume finale e agitare. Incubare a 37°C per 2h.
Aggiungere 10µl STE 10x, 5µl SDS 10% e 2µl proteinase K. Incubare per 30min a 37°C. Incubare
a 70°C per 10min. Aggiungere 100µl di fenolo e 100µl di cloroformio. Agitare e centrifugare alla
massima velocità per 3min. Recuperare il SN e precipitarlo con 10µl di sodio acetato e 300µl di
etanolo freddo. Incubare a -80°C per 1h o a -20°C per una notte.
1.2 Trascrizione e marcatura
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- Centrifugare i tubi alla massima velocità per 15min. Rimuovere il SN, lavare come in (4.1/1.4)
con etanolo 70%, e asciugare il pellet. Risospendere in 10-15µl di acqua RNAsi-free. Leggere allo
spettrofotometro per conoscere la concentrazione del DNA.
Aggiungere al volume corrispondente ad 1µg:
2µl di nucleotide mix,
2µl di reaction buffer,
1µl di RNAse inhibitor,
portare a 18µl di volume con acqua RNAsi-free
aggiungere
2µl di enzima SP6 RNA polymerase.
- Incubare per 2h a 37°C. Aggiungere 1µl di enzima RQ1 DNAse , continuare l'incubazione a 37°
per altri 30min.
- Aggiungere 2µl di EDTA 0.2M, 2µl di LiCl 4M e 75µl di etanolo assoluto freddo. Incubare 1h a 80°C, oppure , per lunga conservazione, a -20°C.
- Risospensione e conservazione - Centrifugare i microtubi alla massima velocità per 20min.
Rimuovere il SN e lavare con etanolo70% freddo come in (1.4). Asciugare il pellet e risospenderlo
in 100µl di acqua RNAsi-free. Conservare a -20°C . La sonda é stabile per almeno 3 mesi.
1.3 Elettroforesi di controllo
E' opportuno controllare una aliquota di miscela di marcatura alla fine delle incubazioni.
- Aggiungere, ad 1µl di miscela di trascrizione, 2µl di colorante per elettroforesi.
- Far migrare in gel di agarosio orizzontale (1.2 % agarosio in TBE 1x) per 45min a 100 V costanti.
Caricare un marker a peso molecolare noto, tipo DNA del batteriofago λ tagliato con l'enzima di
restrizione HindIII. Esistono inoltre diverse preparazioni commerciali di marker di RNA a basso
peso molecolare.
- Colorare con etidio bromuro (100µg/ml in acqua) per 5min e osservare su transilluminatore UV.
Il kit commerciale per la trascrizione contiene una preparazione di RNA trascritto a concentrazione
nota da far comigrare per stimare con discreta approssimazione la quantita' di ribosonda trascritta
durante la reazione.
- Si puo' conservare una foto del gel, avendo a disposizione una fotocamera per istantanee Polaroid
o una camera digitale a fuoco fisso, utilizzando i filtri per ultravioletto consigliati dalla ditta
fornitrice.
2. Estrazione degli acidi nucleici da tessuto vegetale
2.1 Raccolta e conservazione dei campioni
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È consigliabile raccogliere almeno 3-4 rametti di 5 cm di lunghezza da diversi quadranti della
pianta.
Evitare le foglie piccole, molto giovani e semi-erbacee, poiche' la concentrazione dei viroidi e'
bassa ed e' invece elevato il contenuto in polisaccaridi che possono interferire con la estrazione e
successiva analisi degli acidi nucleici. Sono preferibili foglie mature e completamente espanse.
Conservare il campione in sacchetti di plastica numerati per campo, filare e postazione. Tenere i
sacchetti chiusi in contenitori refrigerati con borse termiche ghiacciate, ma non in diretto contatto
con le stesse. Appena i campioni giungono in laboratorio, conservarli a 4°C.
Eseguire le procedure di estrazione degli acidi nucleici entro le 24h dalla raccolta dei campioni.
Qualità e grado ottimale di conservazione del materiale da estrarre, soprattutto nella stagione estiva,
sono estremamente critici per la riuscita dell'analisi. Da materiale che abbia subito, anche per poche
ore, temperature ambientali o parziale disidratazione, la estrazione di RNA totale può risultare
inefficace ai fini della ibridazione molecolare.
2.2 Preparazione del campione
Prelevare (con una lama da bisturi che verrà pulita ogni volta) da più foglie dei diversi rametti delle
piccole strisce di tessuto fogliare, in modo che il campione di circa 100 mg sia rappresentativo di
più porzioni di pianta. Si possono utilizzare anche frammenti di piccioli fogliari e tessuto
floematico. E' conveniente conservare qualche campione della stessa quantità (che potrà essere
analizzato in seguito) in bustine di alluminio, opportunamente corredata di informazioni, in
ultrafreezer a -70°C.
2.3 Estrazione dei campioni
(protocollo semplificato da Depaulo e Powell, 1995; Plant disease 79: 246-248).
- Polverizzare il campione (0.1g) in mortaio di porcellana aggiungendo la quantità sufficiente di
azoto liquido (circa 20-30ml) accertandosi che non ci siano pezzi di tessuto integri. Utile e rapida
alternativa é rappresentata da un estrattore a vibrazione, in cui si dispongono microtubi da 2ml
contenenti 1ml di tampone, il tessuto vegetale da estrarre e 2-3 microsfere metalliche da 3mm di
diametro (nel nostro laboratorio é in funzione il Mixer Mill 300, Retsch).
- Prelevare immediatamente la polvere con una spatolina metallica e versarla in un tubo da
microcentrifuga (1.5ml) con 1ml di tampone di estrazione. Agitare su vortex per 20". Disporre in
ghiaccio. Nel caso dell'uso di estrattore a vibrazione, l'omogeneizzazione avviene già in presenza
del tampone.
- Appena finito di macerare un lotto di campioni (meglio processarne 10-12 per volta), aggiungere
150µl di SDS 10%. Agitare e disporre a 70° per 15min.
- Aggiungere 250µl di potassio acetato 5M e incubare in ghiaccio per 10min.
- Centrifugare per 10min in microcentrifuga alla massima velocità (12-14k rpm).
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- Trasferire 500µl di supernatante in tubo pulito e aggiungere 250µl di fenolo neutro* e 250µl di
cloroformio. Agitare per 20" e centrifugare 3min alla massima velocità.
- Trasferire nuovamente il supernatante in tubo pulito ( facendo attenzione di non disturbare
l'interfacie di proteine denaturate) e aggiungere 40µl di sodio acetato 3M pH 5.5 e 1ml di etanolo
assoluto freddo. Agitare e conservare a -20° per 12h.
* Il fenolo in cristalli va disciolto a 50°C in un volume uguale di acqua sterile e conservato in
refrigeratore a 4°C. Neutralizzare piccole aliquote di uso settimanale (50ml), aggiungendo un
ugual volume di Tris 0.5M pH 8, agitare per qualche minuto e, eliminando la prima frazione
acquosa, sostituire con Tris 0.1M pH 8. Conservare in refrigeratore.
2.4 Denaturazione e disposizione su membrana
- Centrifugazione e risospensione
- Centrifugare i tubi alla massima velocità per 10min.
- Rimuovere il supernatante e asciugare brevemente, capovolgendo i tubi su carta pulita.
- Aggiungere ai tubi 500µl di etanolo al 70% freddo, senza disturbare il pellet.
- Centrifugare nuovamente nella stessa orientazione per 2min.
- Rimuovere accuratamente il supernatante e far asciugare i tubi capovolti per qualche minuto.
- Risospendere agitando in 100µl di acqua sterile o nuclease-free. Per una lunga conservazione é
opportuno riprecipitare una aliquota con sodio acetato e etanolo, oppure tenere i tubi a -70°C. Se
invece i campioni vanno saggiati entro pochi giorni, conservare a -20°C.
2.4.1 Preparazione della membrana
- Ritagliare un foglio di membrana di nylon (Hybond N+, AP Biotech) della dimensione desiderata
(circa 1cm2 per campione) e bagnarlo brevemente in 2X SSC. Bagnare anche due fogli di carta
3MM (Whatman).
- Disporre carta da filtro e membrana su un apparecchio per dot-blot sotto vuoto ( BioRad o ABN).
Applicare una pompa da vuoto e aspirare brevemente il liquido in eccesso.
2.4.2 Denaturazione e assorbimento dei campioni
- Prelevare 5-25µl di acido nucleico per campione estratto. Aggiungere in un tubo un ugual volume
di miscela di denaturazione (100mM sodio idrossido, 5mM EDTA). Tenere pochi minuti (necessari
a preparare tutti i campioni) a temperatura ambiente.
- Aliquotare la miscela nei pozzetti tenendo l'apparecchio in aspirazione.
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- Quando tutto il liquido é stato assorbito sulla membrana, smontare l'apparecchio e bagnare per
pochi secondi la membrana in 2xSSC.
- Far assorbire l'eccesso di liquido con carta da filtro e avvolgere la membrana in film plastico
trasparente. Disporre, con il lato delle macchie di estratto rivolto in basso, sulla superficie di un
transilluminatore UV e esporre ai raggi UV per 3'.
- Conservare la membrana in carta da filtro, oppure disporla immediatamente nel tubo di
ibridazione e bagnarla con la miscela di ibridazione.
3. Ibridazione
3.1 Preibridazione
- Preparare la soluzione di ibridazione aggiungendo 64ml di acqua sterile alla polvere contenuta in
una bottiglia di DIG Easy Hyb Granules (Roche, cd.1796895) per ricostituire 100ml agitando per
almeno 30'. Conservare a temperatura ambiente.
- Disporre la membrana in un tubo cilindrico da ibridazione (Hybaid) e aggiungere 3-5ml di
soluzione. Incubarea 56°C per 30min - 2h.
3.2 Ibridazione
- Scongelare una aliquota di ribosonda da cui prelevare circa 10-25ng per ml di soluzione di
ibridazione. Mescolare 500µl di tale soluzione in un microtubo e incubare la sonda a 70°C per 2'.
- Aggiungere immediatamente la sonda al restante volume di pre-ibridazione e continuare
l'incubazione alla stessa temperatura per 12-16h.
3.3 Lavaggio
- Rimuovere con una pinzetta la membrana dal tubo e portare l'incubatore a 68°C. La membrana
viene lavata 2 volte per 10’ in 2xSSC, 0.1% SDS a temperatura ambiente in un contenitore di
plastica o vetro pulito con volume sufficiente a bagnare bene tutta la superficie (circa 50ml) su di un
agitatore orbitale.
- Lavare la membrana 2 volte per 15' in tubo di ibridazione pulito con 0.1xSSC , 0.1%SDS a 68°C.
Usare un volume di lavaggio di circa 100ml per tubo e membrana.
- Incubare la membrana in 2xSSC contenente 1µg/ml di RNAsi A per 30' in agitazione a
temperatura ambiente. Lavare per 5' con 50ml di 2xSSC.
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4 Rilevamento della sonda marcata
4.1 Bloccaggio e reazione dell'anticorpo anti-DIG
- Lavare la membrana con 50 ml di tampone di lavaggio maleico contenente 0.3% Tween-20 per 5'
in agitazione.
- Incubare per almeno 30' in agitazione con tampone di bloccaggio (tampone maleico, senza
Tween-20, ma con reagente di bloccaggio 1%).
Il reagente di bloccaggio si prepara sciogliendo al 10% il preparato (Roche, cd. 1096176) in
tampone maleico, si autoclave in piccole aliquote e si conservacongelato a -20°C.
- Diluire 1µl di anticorpo anti-DIG coniugato con fosfatasi alcalina (Roche, 1093274) in 10 ml di
tampone di bloccaggio. Disporre la membrana in una bustina di plastica con i 10ml di soluzione e
chiudere con un saldatore termico. Incubare per 30' a temperatura ambiente con agitazione
sostenuta. Evitare bolle d'aria o formazione di schiuma nella bustina che riducano il contatto del
liquido con la membrana.
- Rimuovere la membrana dalla bustina e lavarla 2 volte per 15' in tampone di lavaggio su agitatore.
4.2 Rilevamento chemioluminescente
- Incubare la membrana per 2' in tampone della fosfatasi alcalina.
- Disporre la membrana su film plastico e aggiungere sulla superficie 1ml di substrato, preparato
diluendo 10µl di CSPD (Roche, cd. 1655884) in 1ml di tampone della fosfatasi. Bagnare bene la
membrana da entrambi i lati per 5'. Rimuovere l'eccesso di liquido appoggiando un angolo su carta
da filtro.
- Avvolgere la membrana in film plastico e tenerla in carta d'alluminio al buio a 37°C per circa 15'
per attivare l'enzima.
L'uso di CDP-Star (Roche, cd. 1685627) come substrato non necessita di questo passaggio a 37° ,
nè della presenza di MgCl2 nel tampone.
- Esporre in camera oscura la membrana ad un film radiografico (Fuji, HR E-30) per 1-3h dentro
una cassetta a tenuta di luce.
- Sviluppare il film con comuni soluzioni di sviluppo e fissaggio fotografico per 3-5 minuti fino ad
ottenimento del contrasto desiderato.
Note:
1) Le soluzioni di lavaggio delle membrane devono essere diluite in acqua distillata, non
necessariamente sterile. Usare recipienti sufficientemente larghi, lavati con detergente e acqua
distillata.
2) Per ulteriori dettagli e analisi dei risultati (troubleshooting ) si rimanda al manuale sulla
ibridazione chemioluminescente della Roche Diagnostics.
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5. Analisi dei risultati
I segnali di ibridazione (macchie nere sulla lastra esposta e sviluppata) rappresentano altrettanti
campioni positivi. In generale l'intensità di segnale é proporzionale alla concentrazione di RNA
bersaglio nel tessuto estratto nonché alla maggiore o minore omologia del viroide presenti nei
campioni vegetali con la sonda.
E' necessario includere per ogni lotto di estrazione e ibridazione, nelle quantità e diluizioni di
estratto omogenee con gli altri campioni da saggiare:
i) almeno un campione sicuramente sano (precedentemente controllato anche via indexaggio
biologico su indicatore legnoso);
ii) almeno un campione sicuramente infetto (preferibilmente foglie sintomatiche di cedro Etrog
infetto da CEVd e/o CCaVd o estratti da ospiti erbacei degli stessi, es. Ginura aurantiaca o
Cucumis sativus).
Potrebbe essere aliquotato su membrana, dopo opportuna denaturazione con NaOH-EDTA, una
quantità (200-500ng) di plasmide (DNA doppia elica) che porta la sequenza clonata del viroide.
Per verificare la sensibilità di rilevamento della ibridazione si possono utilizzare aliquote a
concentrazione nota del viroide purificato (eluito da gel di poliacrilammide dopo separazione
elettroforetica oppure RNA trascritto dallo stesso plasmide) e diluito fino alla concentrazione limite
mediamente attesa (dell'ordine di centinaia o decine di picogrammi).
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Boehringer Mannheim Biochemica.
Progetto POM A32 “Norme fitosanitarie e commercializzazione delle produzioni vivaistiche”
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