QUANTA Lite® aPS/PT IgG ELISA (anti-fosfatidilserina e protrombina)
QUANTA Lite® aPS/PT IgM ELISA (anti-fosfatidilserina e protrombina)
Per uso diagnostico In Vitro
Complessità CLIA: elevata
Codice Prodotto: 708835, 708845
Uso previsto
I kit IgG aPS/PT QUANTA Lite® e/o IgM aPS/PT QUANTA Lite® sono dei dosaggi di immunoassorbimento enzimatico
semiquantitativo e qualitativo (ELISA) per la determinazione degli anticorpi di classe IgG e IgM al complesso di
fosfatidilserina/protrombina (PS/PT) nel siero o nel plasma, previstI per l’uso come ausilio nella diagnosi di alcuni disturbi
trombotici autoimmuni, come la sindrome da antifosfolipidi (APS) e dei disturbi secondari al lupus eritematoso sistemico o a
malattie lupus-simili, unitamente ad altri risultati clinici e di laboratorio.
Introduzione e descrizione del test
Gli anticorpi antifosfolipidi (aPL) rappresentano un vasto gruppo di immunoglobuline di notevole importanza clinica dovuta alla
loro associazione con la trombosi arteriosa e/o venosa, aborto spontaneo ricorrente, disturbi neurologici, ipertensione
1
polmonare e trombocitopenia . Gli anticorpi anticardiolipina (ACA) determinati da ELISA e l’anticoagulante del lupus (LA)
rilevato mediante test di coagulazione sono stati i test più affermati e standardizzati per la diagnosi della sindrome
antifosfolipidica (APS). La famiglia di aPL è stata recentemente allargata per includere un gruppo eterogeneo di autoanticorpi la
2-5
cui specificità è diretta contro le proteine legate ai fosfolipidi o contro il loro complesso con fosfolipidi .
Tra le proteine legate ai fosfolipidi, la più studiata è la β2-glicoproteina I (β2 GPI). La β2 GPI contiene gli epitopi criptici per il
legame ACA che vengono esposti quando la β2 GPI si lega ai fosfolipidi caricati negativamente come la cardiolipina o
immobilizzati sulle piastre in plastica ELISA irradiate6. Un certo numero di studi ha evidenziato la significatività dell’anticorpo
7-11
e
anti-β2 GPI mediante ELISA come dosaggio alternativo al test ELISA ACA convenzionale con una più elevata specificità
questo metodo è stato adottato dalla comunità clinica.
La protrombina (fattore II) è un’altra proteina legata ai fosfolipidi con un peso molecolare di 72.000, presente nel plasma
normale ad una concentrazione approssimativa di 2,5 μmol/L, che svolge un’attività procoagulante mediante un complesso
protrombinasi, attivando la conversione di fibrinogeno in fibrina12.
L’anticoagulante del lupus ha dimostrato di essere diretto contro le proteine multiple del plasma, incluse la β2 GPI e la
13,15
. Nel 1995, Arvieux et al16 hanno dimostrato la possibilità di rilevare gli aPT mediante ELISA in campioni positivi
protrombina
all’anticoagulante del lupus (LA) mediante piastre irradiate in modo simile al dosaggio anti-β2 GPI. È stata ipotizzata un’analogia
con l’anti-β2 GPI: gli aPT sono stati in grado di riconoscere gli epitopi criptici o i neoepitopi formatisi durante l’interazione della
protrombina con la superficie anionica.
Esistono alcuni rapporti relativi alla prevalenza di aPT in pazienti con anticorpi antifosfolipidi (aPL). Arvieux et al16 hanno
17
riportato una prevalenza del 55,4% in pazienti positivi al LA. Galli et al hanno riscontrato aPT nel 58% del pazienti con APS.
Petri et al hanno riscontrato preliminarmente che gli aPT hanno un potenziale valore predittivo per gli eventi trombotici in 100
pazienti con LES18. Horbach et al19 hanno studiato la significatività clinica degli aPT in 175 pazienti con LES, riscontrando che
gli aPT IgG e IgM erano più frequenti in pazienti con un’anamnesi di trombosi ed erano associati alla trombosi venosa, ma non a
quella arteriosa. I titoli degli aPT IgM sono risultati leggermente più elevati in pazienti con trombosi rispetto a pazienti senza
trombosi, mentre non risultavano differenze tra i due gruppi relativamente ai titoli degli aPT IgG. Vaarala et al20 hanno
dimostrato un valore predittivo pari a un aumento di 2,5 volte nel rischio di infarto miocardico o di morte cardiaca in uomini di
mezza età con livelli elevati di aPT.
L’associazione tra aPT e LA è stata ampiamente studiata. Nel 1988, Fleck et al21 hanno dimostrato la presenza di attività
dell’anticoagulante del lupus degli aPT. È stato inoltre dimostrato che gli anticorpi responsabili dell’attività di LA in certe
condizioni sperimentali si legano alla protrombina14,22. Inoltre, Bevers et al14 hanno dimostrato che la protrombina era
necessaria per l’espressione dell’attività di LA in 11/16 campioni di plasma positivi al LA impoveriti di ACA, con la conseguenza
che almeno il 69% dell’attività del LA dipende dagli anticorpi legati alla protrombina. Il meccanismo mediante il quale tali
anticorpi agiscono rimane oscuro. È stato ipotizzato che gli aPT inibiscano il rilascio di prostaciclina delle cellule endoteliali
mediato dalla trombina e che gli aPT inibiscano l’attivazione della proteina C2. Recentemente è stato ipotizzato che la
protrombina si leghi ai fosfolipidi anionici esposti sulle cellule endoteliali e che gli aPT attivino le cellule endoteliali e inducano le
sostanze procoagulanti attraverso la protrombina23.
Bertolaccini et al24 hanno esaminato la presenza di aPT IgG e IgM mediante ELISA in pazienti con LES. Tali anticorpi sono stati
riscontrati nel 28% dei pazienti con LES con un 18% di risultati positivi per IgG, un 14% di risultati positivi per IgM e con un 4%
di pazienti positivi a entrambi. In questo gruppo è stata riscontrata un’associazione tra la presenza di aPT e l’occorrenza di
eventi vascolari dal momento che il 53% dei pazienti con LES con aPT presentava un’anamnesi con un evento trombotico. In
24
questo studio è stata inoltre rilevata un’associazione degli aPT con la presenza di ACA e anti-β2 GPI, benché gli autori
affermino che il test ELISA aPT non deve essere considerato come un sostituto dei dosaggi di LA, ACA o β2 GPI convenzionali.
In questi ultimi anni è emerso un quadro più preciso relativamente alla rilevanza clinica degli anticorpi anti-aPT. Ora sappiamo
che gli anticorpi più strettamente associati con la sindrome antifosfolipidica e il LA sono realmente diretti verso un complesso di
fosfolipidi anionici quali la fosfatidilserina e la protrombina (PS/PT) piuttosto che la PT sola. Questi dati sono chiaramente
25
descritti in un articolo apparso recentemente su una rivista .
In un certo numero di studi è stato dimostrato che i dosaggi anti-PS/PT hanno una rilevanza clinica significativa e sono correlati
25-28
.
più strettamente con le caratteristiche cliniche della sindrome antifosfolipidica e l’anticoagulante del lupus
Principi della procedura
I kit IgG e IgM aPS/PT (anti-fosfatidilserina/protrombina) QUANTA Lite® sono immunodosaggi enzimatici (ELISA) per il
rilevamento degli anticorpi IgG e IgM nel siero o nel plasma umano al complesso di fosfatidilserina/protrombina mediante la
tecnica sandwich ELISA. I pozzetti delle piastre a micropozzetti in plastica vengono rivestiti con un complesso di PS/PT
purificato e quindi stabilizzati. In incubazione, il siero contenente anticorpi IgG o IgM anti-PS/PT si lega con la PS/PT. La
proteina non legata viene rimossa mediante lavaggio e nei pozzetti viene aggiunto un coniugato anti-IgG o IgM umane marcato
con perossidasi di rafano (HRP). Dopo l’incubazione, il coniugato non legato viene rimosso mediante lavaggio. Viene quindi
aggiunto un substrato di perossidasi, che subisce un cambiamento di colore in presenza dell’enzima del coniugato. Dopo aver
interrotto la produzione enzimatica del prodotto colorato, la presenza o assenza dell’anticorpo anti-protrombina viene
determinata spettrofotometricamente misurando e comparando l’intensità di colore che si sviluppa nei pozzetti del paziente con
quella di una curva di calibrazione a cinque punti.
1
Reagenti
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1.
Piastra di micropozzetti di polistirene ELISA rivestita di un antigene purificato, PS/PT, (12-1 x 8 pozzetti), con supporto
in involucro contenente un essiccante
ELISA Controllo negativo, 1 fiala di tampone contenente conservante e siero umano senza IgG anticorpi umani alla
PS/PT, prediluito, 1,2 ml
ELISA Controllo IgG aPS/PT, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgG anti PS/PT,
prediluito, 1,2 ml
ELISA Calibratore A IgG aPS/PT, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgG anti
PS/PT, prediluito, 1,2 ml
ELISA Calibratore B IgG aPS/PT, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgG anti
PS/PT, prediluito, 1,2 ml
ELISA Calibratore C IgG aPS/PT, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgG anti
PS/PT, prediluito, 1,2 ml
ELISA Calibratore D IgG aPS/PT, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgG anti
PS/PT, prediluito, 1,2 ml
ELISA Calibratore E IgG aPS/PT, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgG anti
PS/PT, prediluito, 1,2 ml
Coniugato a PS/PT IgG HRP (capra), anti IgG umane, 1 fiala – di colore blu contenente tampone, stabilizzanti proteici
e conservante, 10 ml
Diluente per campioni HRP Plus, 1 fiala – di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween
20, stabilizzanti proteici con calcio e conservante, 50 ml
Tampone di lavaggio HRP Plus, 1 fiala di concentrato 40x – di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata
con Tris, Tween 20 e calcio, 25 ml, Per istruzioni relative alla diluizione vedere la sezione dedicata ai metodi.
Cromogeno TMB, 1 fiala contenente stabilizzanti, 10 ml
Soluzione di arresto HRP, acido solforico 0,344M, 1 fiala – incolore
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Piastra di micropozzetti di polistirene ELISA rivestita di un antigene purificato, PS/PT, (12-1 x 8 pozzetti), con supporto
in involucro contenente un essiccante
ELISA Controllo negativo, 1 fiala di tampone contenente conservante e siero umano senza IgM anticorpi umani alla
PS/PT, prediluito, 1,2 ml
ELISA Controllo IgM aPS/PT, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgM anti PS/PT,
prediluito, 1,2 ml
ELISA Calibratore A IgM aPS/PT, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgM anti
PS/PT, prediluito, 1,2 ml
ELISA Calibratore B IgM aPS/PT, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgM anti
PS/PT, prediluito, 1,2 ml
ELISA Calibratore C IgM aPS/PT, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgM anti
PS/PT, prediluito, 1,2 ml
ELISA Calibratore D IgM aPS/PT, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgM anti
PS/PT, prediluito, 1,2 ml
ELISA Calibratore E IgM aPS/PT, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgM anti
PS/PT, prediluito, 1,2 ml
Coniugato aPS/PT IgM HRP (capra), anti IgM umane, 1 fiala – di colore verde contenente tampone, stabilizzanti
proteici e conservante, 10 ml
Diluente per campioni HRP Plus, 1 fiala – di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween
20, stabilizzanti proteici con calcio conservante, 50 ml
Tampone di lavaggio HRP Plus, 1 fiala di concentrato 40x – di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata
con Tris, Tween 20 e calcio, 25 ml, Per istruzioni relative alla diluizione vedere la sezione dedicata ai metodi.
Cromogeno TMB, 1 fiala contenente stabilizzanti, 10 ml
Soluzione di arresto HRP, acido solforico 0,344M, 1 fiala – incolore
Avvertenze
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AVVISO: questo prodotto contiene una sostanza chimica (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per campioni, nei
controlli, nei calibratori e nel coniugato nota allo Stato della California come causa di cancro.
Tutto il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione dei controlli per questo prodotto è stato testato ed è
risultato negativo alla presenza di anticorpi al virus dell'immunodeficienza umana (HIV), dell’antigene superficiale
dell’epatite B (HBsAg) e dell’epatite C (HCV) in base a metodi approvati dall’FDA. Nessun metodo di prova tuttavia può
offrire l'assicurazione completa dell’assenza del virus dell’HIV, HCV o altri agenti infettivi. Di conseguenza, ELISA
Controllo aPS/PT, ELISA Calibratori aPS/PT ed ELISA Controllo negativo devono essere trattati come materiali
potenzialmente infettivi29.
L’azoturo di sodio viene usato come conservante. L’azoturo di sodio è un veleno e può essere tossico se ingerito o
assorbito attraverso la pelle o gli occhi. L’azoturo di sodio può reagire con le tubature in piombo o rame e formare azidi
metalliche potenzialmente esplosive. Lavare i lavandini, se usati per lo smaltimento dei reagenti, con grandi volumi di
acqua per evitare l’accumulo di azide.
Il coniugato HRP contiene una sostanza chimica diluita velenosa/corrosiva che può essere tossica se ingerita in grandi
quantità. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la pelle e con gli occhi.
Il cromogeno TMB contiene un irritante che può essere pericoloso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la pelle.
Per evitare lesioni, evitare l’inalazione, l’ingestione o il contatto con la pelle e con gli occhi.
La soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione diluita di acido solforico. Evitare l’esposizione a basi, metalli
o altri composti che possono reagire con gli acidi. L’acido solforico è un veleno ed è corrosivo e può essere tossico se
ingerito. Per prevenire ustioni chimiche, evitare il contatto con la pelle e con gli occhi.
Utilizzare attrezzatura di protezione idonea quando si manipolano i reagenti forniti.
I reagenti rovesciati devono essere puliti immediatamente. Durante lo smaltimento delle scorie, rispettare tutti i
regolamenti ambientali federali, statali e locali.
2
Precauzioni
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3.
Questo prodotto è destinato a un uso diagnostico in vitro.
La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel sistema può causare risultati incoerenti.
Un lavaggio incompleto o inefficiente e un’insufficiente rimozione del liquido dalle strip di pozzetti ELISA causa scarsa
precisione e/o un elevato rumore.
L’adattamento di questo dosaggio all’uso con unità di sviluppo automatiche dei campioni e altri dispositivi per la
manipolazione dei liquidi, anche parziale, può produrre differenze nei risultati del test rispetto a quelli ottenuti
utilizzando la procedura manuale. È responsabilità di ogni laboratorio verificare che la procedura automatica dia
risultati dei test entro limiti accettabili.
Le prestazioni del dosaggio sono influenzate da molti fattori. Tra questi figurano la temperatura iniziale dei reagenti, la
temperatura ambiente, la precisione e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, l'accuratezza del lavaggio e della
rimozione del liquido dai micropozzetti delle strip ELISA, il fotometro usato per misurare i risultati e la lunghezza dei
periodi di incubazione durante il dosaggio. Per ottenere risultati accurati e riproducibili è necessario prestare grande
attenzione alla coerenza.
Si raccomanda un rigido rispetto del protocollo.
Una risigillatura incompleta della borsa con cerniera contenente le strip di pozzetti e gli essiccanti causa una
degradazione dell’antigene e una scarsa precisione.
Capacità di assorbimento eccessivamente basse possono essere osservate dopo due o più impieghi da un singolo
flacone di coniugato HRP nell’arco di un periodo di tempo. Per evitare che questo avvenga è importante seguire tutte
le procedure raccomandate per la manipolazione del coniugato HRP.
La contaminazione chimica del coniugato HRP può derivare da una pulizia o un risciacquo inadeguati dell’attrezzatura
o degli strumenti. I residui di comuni sostanze di laboratorio come la formalina, la candeggina, l’etanolo o un
detergente causano degradazione del coniugato HRP nel tempo. Risciacquare accuratamente tutta l’attrezzatura o gli
strumenti dopo l’uso di detergenti/disinfettanti chimici.
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Condizioni di conservazione
1.
Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8°C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se
conservati e maneggiati in accordo alle istruzioni.
Le strip di pozzetti rivestite con antigeni non utilizzate devono essere risigillate in modo sicuro nel sacchetto di
alluminio contenente i disseccanti e conservate a 2-8°C.
Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8°C.
2.
3.
Prelievo del campione
Questa procedura può essere eseguita con un campione di siero o plasma. L’aggiunta di azide o altri conservanti ai campioni
del test può influenzare negativamente i risultati. I campioni microbicamente contaminati, sottoposti a trattamento termico o
contenenti particolato visibile non devono essere usati. Evitare campioni o sieri lipemici o fortemente emolizzati. Il CLSI
(NCCLS) Document H18-A3 raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) conservare i campioni a
temperatura ambiente per un massimo di 8 ore; 2) se il dosaggio non verrà completato entro 8 ore, refrigerare il campione a 28°C; 3). se il dosaggio non verrà completato entro 48 ore, oppure per la spedizione del campione, congelare a -20°C o a una
temperatura inferiore. I campioni congelati devono essere miscelati dopo il decongelamento e prima di eseguire il test.
Procedura
Materiale fornito
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Piastra di micropozzetti ELISA aPS/PT IgG (12-1 x 8 pozzetti), con supporto
1,2 ml di ELISA Controllo negativo prediluito
1,2 ml di ELISA controllo IgG aPS/PT prediluito
1,2 ml di ELISA Calibratore A IgG aPS/PT prediluito
1,2 ml di ELISA Calibratore B IgG aPS/PT prediluito
1,2 ml di ELISA Calibratore C IgG aPS/PT prediluito
1,2 ml di ELISA Calibratore D IgG aPS/PT prediluito
1,2 ml di ELISA Calibratore E IgG aPS/PT prediluito
50 ml di diluente per campioni HRP Plus
25 ml di tampone di lavaggio HRP Plus, 40x concentrato
10 ml di coniugato IgG aPS/PT HRP, (capra), anti IgG umane
10 ml di cromogeno TMB
10 ml di soluzione di arresto HRP, 0,344M acido solforico
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Piastra di micropozzetti ELISA aPS/PT IgM (12-1 x 8 pozzetti), con supporto
1,2 ml di ELISA Controllo negativo prediluito
1,2 ml di ELISA controllo IgM aPS/PT prediluito
1,2 ml di ELISA Calibratore A IgM aPS/PT prediluito
1,2 ml di ELISA Calibratore B IgM aPS/PT prediluito
1,2 ml di ELISA Calibratore C IgM aPS/PT prediluito
1,2 ml di ELISA Calibratore D IgM aPS/PT prediluito
1,2 ml di ELISA Calibratore E IgM aPS/PT prediluito
50 ml di diluente per campioni HRP Plus
25 ml di tampone di lavaggio HRP Plus, 40x concentrato
10 ml di coniugato IgM aPS/PT HRP, (capra), anti IgM umane
10 ml di cromogeno TMB
10 ml di soluzione di arresto HRP, 0,344M acido solforico
Materiale aggiuntivo richiesto ma non fornito
Micropipette per l’erogazione di 5, 100, 200-300 e 500 µl
Punte per micropipette monouso
Provette per diluizione del campione del paziente, 4 ml di volume
Acqua distillata o deionizzata
Contenitore da 1l per il tampone di lavaggio HRP diluito
Lettore di micropiastre in grado di misurare l’assorbanza OD a 450 nm (e 620 nm per le letture a doppia lunghezza d’onda)
3
Metodo
Prima di iniziare
1.
2.
3.
4.
5.
Portare tutti i reagenti e i campioni a temperature ambiente (20-26 oC) e miscelare bene.
Diluire il Tampone di lavaggio HRP Plus nella misura di 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone di Tampone di
lavaggio HRP Plus a 975 ml di acqua distillata o deionizzata. Se durante questo periodo non viene eseguita l’analisi
dell’intera piastra, è possibile preparare una quantità minore aggiungendo 2,0 ml di concentrato a 78 ml di acqua
distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. Il tampone diluito è stabile per 1 settimana a 2 – 8°C.
Preparare una diluizione 1:101 di ogni campione del paziente aggiungendo 5 µl di campione a 500 µl di diluente per
campioni HRP Plus. I campioni diluiti devono essere usati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i calibratori
aPS/PT IgG o IgM aPS/PT, ELISA Controllo aPS/PT IgG o aPS/PT IgM ed ELISA Controllo negativo.
La determinazione della presenza o dell’assenza di anticorpi anti-fosfatidilserina/protrombina richiede due pozzetti per
ciascuno dei calibratori e controlli e uno o due pozzetti per ogni campione del paziente. Si consiglia di testare i
campioni in doppio.
Preparazione della curva standard: per i punti da A ad E della curva standard a 5 punti, utilizzare ELISA Calibratore AE IgG o IgM aPS/PT PREDILUITO direttamente dalla fiala. La curva standard a cinque punti ha il seguente valore
Punto
A
B
C
D
E
Unità
IgG o IgM PS/PT
150,0
75,0
37,5
18,75
9,4
ELISA Calibratore A IgG o IgM aPS/PT prediluito
ELISA Calibratore B IgG o IgM aPS/PT prediluito
ELISA Calibratore C IgG o IgM aPS/PT prediluito
ELISA Calibratore D IgG o IgM aPS/PT prediluito
ELISA Calibratore E IgG o IgM aPS/PT prediluito
Procedura del dosaggio
1.
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4.
5.
6.
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8.
TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26°C) PRIMA DI COMINCIARE
IL DOSAGGIO. Collocare il numero richiesto di micropozzetti/strip nel supporto. Riporre immediatamente le strip
non utilizzate nel sacchetto con l'essiccante e chiuderlo bene per ridurre al minimo l’esposizione al vapore
acqueo.
Aggiungere ai pozzetti 100 µL di ciascuno dei cinque calibratori, i campioni diluiti dei pazienti, ELISA Controllo negativo
e ELISA Controllo IgG aPS/PT o IgM aPS/PT. NOTA ELISA Calibratori IgG aPS/PT o IgM aPS/PT, Controllo IgG
aPS/PT o IgM aPS/PT ed ELISA Controllo negativo sono prediluiti e pronti all’uso. Coprire i pozzetti e incubare
per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione comincia dopo l’ultima
aggiunta.
Ciclo di lavaggio: aspirare completamente il contenuto di ogni pozzetto. Aggiungere a tutti i pozzetti 200-300 µl del
Tampone di lavaggio HRP Plus diluito quindi aspirare. Ripetere questa sequenza altre due volte per un totale di tre
lavaggi. Ribaltare la piastra e percuoterla delicatamente su materiale assorbente per rimuovere eventuale liquido
residuo dopo l’ultimo lavaggio. È importante svuotare completamente ogni pozzetto dopo ogni ciclo di lavaggio.
Rispettare la stessa sequenza di aspirazione impiegata per l’aggiunta del campione.
Aggiungere a ogni pozzetto 100 μL di coniugato aPS/PT IgG o aPS/PT IgM HRP. Il coniugato deve essere rimosso dai
flaconi in condizioni asettiche standard e impiegando buone tecniche di laboratorio. Estrarre dal flacone solo la quantità
di coniugato necessaria per il dosaggio . PER EVITARE UNA POTENZIALE CONTAMINAZIONE MICROBICA E/O
CHIMICA, NON REINTRODURRE MAI NEL FLACONE IL CONIUGATO NON UTILIZZATO. Incubare i pozzetti per
30 minuti come nel ciclo 2.
Ciclo di lavaggio: ripetere il punto 3.
Aggiungere a ogni pozzetto 100 µl di cromogeno TMB e incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente.
Aggiungere a ogni pozzetto 100 µl di soluzione di arresto. Per l'aggiunta della soluzione di arresto HRP rispettare la
stessa sequenza e la stessa tempistica utilizzate per il cromogeno TMB. Percuotere delicatamente la piastra con un
dito per miscelare accuratamente i pozzetti.
Leggere l’assorbanza (OD) di ogni pozzetto a 450 nm entro un’ora dall’arresto della reazione. Se si desiderano
misurazioni bicromatiche, come lunghezza d’onda di riferimento è possibile utilizzare 620 nm.
Controllo della qualità
1.
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3.
4.
ELISA Calibratori IgG aPS/PT o IgM aPS/PT, ELISA Controllo IgG aPS/PT o IgM aPS/PT ed ELISA Controllo negativo
devono essere analizzati con tutti i lotti di campioni per garantire che tutti i reagenti e tutte le procedure vengano
eseguiti correttamente.
Si noti che ELISA Calibratori IgG aPS/PT o IgM aPS/PT, ELISA Controllo IgG aPS/PT o IgM aPS/PT ed ELISA
Controlli negativi sono prediluiti e pertanto non controllano i metodi procedurali associati alla diluizione dei campioni.
È possibile testare controlli aggiuntivi attenendosi alle linee guida o ai requisiti delle normative locali e/o statali o di
organizzazioni accreditate. Sieri di controllo aggiuntivi idonei possono essere preparati suddividendo in aliquote
campioni di siero umano e conservandoli a < -20°C.
Affinché i risultati di test possano essere considerati validi, devono essere soddisfatti tutti i criteri seguenti. Se uno
qualsiasi di questi non viene soddisfatto, il dosaggio deve essere considerato non valido e deve essere ripetuto.
a.
L’assorbanza dell'ELISA Calibratore A aPS/PT IgG o aPS/PT IgM prediluito deve essere superiore
all’assorbanza dell’ELISA Controllo IgG aPS/PT o IgM aPS/PT prediluito che deve essere superiore
all’assorbanza dell’ELISA Controllo negativo prediluito.
b.
L’ELISA Calibratore A IgG aPS/PT o IgM aPS/PT prediluito deve avere un’assorbanza superiore a 1,0 mentre
l’assorbanza dell’ELISA Controllo negativo prediluito non può essere superiore a 0,2.
c.
L’assorbanza di ELISA Controllo IgG aPS/PT o IgM aPS/PT deve essere oltre due volte superiore rispetto a
ELISA Controllo negativo o superiore a 0,25.
d.
La concentrazione del Controllo ELISA deve rientrare nell’intervallo indicato sull’etichetta.
e.
Per indicazioni sulle corrette pratiche di controllo della qualità si raccomanda all’utente di fare riferimento a
CLSI (NCCLS) Document C24-A3.
Calcolo dei risultati
1.
2.
3.
4.
Determinare il valore medio per tutte le letture doppie.
Tracciare l’assorbanza media della curva del calibratore per il dosaggio delle IgG o IgM sulla scala logaritmica delle
relative concentrazioni. Utilizzare una linea del tracciato della curva best-fit. Altrimenti è possibile utilizzare un tracciato
log/log. Le unità PS/PT assegnate ai calibratori si possono trovare sulla fiala del calibratore.
Determinare la concentrazione non nota delle IgG o IgM PS/PT in unità IgG o IgM PS/PT dall’asse "X" leggendo la
corrispondente assorbanza sull’asse "Y".
Intervallo dei valori negativi da 0-30 unità. I risultati positivi sono superiori a 30 unità.
4
Interpretazione dei risultati
Il dosaggio ELISA è molto sensibile alla tecnica ed è in grado di rilevare persino differenze minime nelle popolazioni di pazienti. I
valori illustrati di seguito sono solo valori suggeriti. Ogni laboratorio deve definire il proprio intervallo normale in base alle
tecniche, ai controlli, all'attrezzatura e alla popolazioni di pazienti propri secondo le procedure consolidate. Quindi il campione
può essere classificato come negativo o positivo in base alla tabella riportata sotto.
Unita
≤ 30
> 30
Negativo
Positivo
1.
2.
3.
Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi anti IgG o IgM PS/PT e suggerisce la possibilità di alcuni disturbi
trombotici da malattie autoimmuni, come l’APS o quelli secondari al lupus eritematoso sistemico o altre malattie
trombotiche simili al lupus.
Un risultato negativo indica l’assenza di anticorpi IgG o IgM anti-PS/PT oppure la loro presenza a livelli inferiori al limite
di individuazione del cutoff del dosaggio.
Si suggerisce che i risultati riportati dal laboratorio includano la dichiarazione: “I seguenti risultati sono stati ottenuti con
il test ELISA IgG aPS/PT o IgM aPS/PT INOVA QUANTA Lite®. I valori IgG o IgM PS/PT ottenuti con metodi di
dosaggi provenienti da diversi produttori non possono essere utilizzati in modo intercambiabile.
Limiti della procedura
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
La rilevanza clinica degli anticorpi IgG o IgM anti-PS/PT in malattie diverse dal LES o dall’APS è attualmente in fase di
sperimentazione.
Quando vengono riscontrati titoli negative di IgG o IgM PS/PT in presenza di indicazioni cliniche, è indicata
l’esecuzione di un test dell’anticoagulante del lupus, dell’anticardiolipina, di anti-β2 o di altre ulteriori analisi.
La diagnosi non può essere formulata esclusivamente sulla base dei risultati di IgG o IgM PS/PT. Tali risultati devono
essere interpretati unitamente alla presenza di sintomi fisici.
Il trattamento non deve essere iniziato esclusivamente in base alla presenza di un titolo positivo di IgG o IgM PS/PT. È
necessario che siano presenti anche indicazioni cliniche di supporto.
È prevedibile che alcuni campioni possano risultare positivi all’anticardiolipina e/o all’anti-β2 GPI pur risultando negativi
alla IgG o IgM PS/PT. Il test anti-β2 GPI è un marker specifico di rischio trombotico. Il test dell’anticardiolipina può
produrre risultati falsamente positivi in seguito alla reattività incrociata con il dsDNA o con certi anticorpi anti-malattie
infettive. Allo stesso modo, i pazienti con APS possono risultare positivi alla PS/PT e negativi all’anticoagulante del
lupus, all’anticardiolipina o all’anti-β2.
Non sono stabilite prestazioni per matrici diverse dal siero o dal plasma.
Tali dosaggi sono per uso In Vitro
Caratteristiche specifiche delle prestazioni e studi clinici
Riepilogo degli studi clinici
Le prestazioni dei kit IgG aPS/PT QUANTA Lite® e IgM aPS/PT QUANTA Lite® sono state valutate in uno studio esterno e in
uno studio interno. I risultati combinati sono stati inseriti nelle tabelle riportate sotto.
Numero di positivi (%)
Gruppo di pazienti
N. di campioni
IgG PS/PT
Normali
247
Positivi al lupus
anticoagulante (LAC)
24
Sindrome da
antifosfolipidi (APS)
71
Artrite reumatoide
6
Morbo di Crohn
2
Colite ulcerosa
2
Celiaci
5
Negativi al LAC
8
Numero di positivi (%)
Malattia infettiva
(CMV, toxoplasmosi, rosolia, HSV,
HBV, HCV)
14
Sifilide
12
Positivi agli anticorpi anti-actina
1
H. pylori
2
IgM PS/PT
IgG e/o IgM
3 (1,2%)
4 (1,6%)
7 (2,8%)
21 (87,5%)
19 (79,2%)
24 (100%)
33 (46,5%)
0
0
0
0
0
34 (47,9%)
0
0
0
0
1 (12,5%)
48 (67,6%)
0
0
0
0
1 (12,5%)
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
L’uso combinato di IgG e IgM PS/PT ha consentito la rilevazione di tutti i 24 campioni positivi all’anticoagulante del lupus noti e il
67,6% dei pazienti con APS. Solo 3 dei 247 campioni normali e nessuno di altri 52 controlli di malattie sono risultati positivi con il
kit IgG per una specificità del 99% (3/299). Solo 4 dei 247 campioni normali e 1 dei 52 sieri di controllo sono risultati positivi con
il kit IgM per una specificità del 98,3% (5/299).
Concordanza clinica con β2 GPI
I kit IgG aPS/PT QUANTA Lite®e IgM aPS/PT QUANTA Lite® sono stati confrontati con dosaggi napprovati ai sensi del 510(k)
per il rilevamento di β2 GPI IgG e β2 GPI IgM. I campioni analizzati includevano 71 pazienti con APS, 24 campioni positivi
all’anticoagulante del lupus e 85 campioni normali per un totale di 180 campioni. I risultati sono riassunti qui di seguito.
IgG aPS/PT
+
IgG
+
38
10**
β2 GPI
16*
116
*Uno dei 16 è risultato positivo al LAC e gli altri 15 erano pazienti con APS
**Tutti e dieci provenivano dal gruppo di pazienti con APS
IgM
β2 GPI
IgM aPS/PT
+
+
28
25**
7*
120
5
*Uno di questi era un campione normale mentre 6 provenivano dal gruppo con APS
**Ventidue erano pazienti con APS e 3 erano positivi al LAC
L’accordo generale dei due kit IgG e IgM PS/PT rispetto ai kit β2 GPI è risultato dell’85,6% e dell’82,2%. La maggior parte dei
risultati discrepanti è dovuta alla maggiore sensibilità dei kit IgG e IgM PS/PT sia per i campioni positivi al LAC che
particolarmente per i pazienti con APS benché ci siano stati pazienti con APS risultati positivi a β2 GPI e negativi aPS/PT. I kit
IgG più IgM PS/PT hanno rilevato tutti i campioni positivi al LAC e la maggior parte dei pazienti con APS. È stato notato che la
gran maggioranza dei pazienti con APS è risultata positiva aPS/PT e/o a β2 GPI.
Confronto metodologico
I kit IgG e IgM aPS/PT sono stati confrontati con i kit IgG β2 GPI e IgM β2 GPI mediante un totale di 62 campioni per
il confronto IgG e di 63 campioni per il confronto IgM. I campioni selezionati hanno tutti prodotto valori entro il
range lineare del dosaggio. I risultati sono riportati sotto assieme alle concordanze positive, negative e relative
calcolate.
Positivo
13
6
19
65%
83,7%
77,8%
ELISA IgG ß2 GPI
Positivo
Negativo
Totale
Percentuale di accordo positivi
Percentuale di accordo negativi
Accordo relativo
ELISA IgG aPS/PT
Negativo
7
36
43
ELISA IgM aPS/PT
Positivo
ELISA IgG ß2 GPI
Positivo
Negativo
Totale
Percentuale di accordo positivi
Percentuale di accordo negativi
Accordo relativo
13
11
24
81,3%
76,6%
77,8%
Totale
20
42
62
Negativo
Totale
3
36
39
16
47
63
Precisione e riproducibilità
Sono stati analizzati otto campioni in sei replicati con ELISA IgG aPS/PT in sei giorni diversi. N. totale= 36. I risultati dei valori
delle unità sono sintetizzati sotto.
Valore delle unità di IgG
Sdev intra-dosaggio
%CV
Sdev inter-dosaggio
%CV
1,4
0,1
8,1
139,3
6,8
4,9
79,3
4,9
6,2
36,8
2,5
6,7
22,2
1,7
7,8
8,3
0,8
9,9
53,8
3,4
6,4
1,7
0,1
7,1
0,2
12,0
4,2
3,0
3,3
4,2
1,6
4,5
1,2
5,3
0,4
5,2
2,3
4,2
0,1
8,3
Altri otto campioni sono stati analizzati in sei replicati con ELISA IgM aPS/PT negli stessi sei giorni. N. totale= 36. I risultati dei
valori delle unità sono sintetizzati sotto.
Valore delle unità IgM
Sdev intra-dosaggio
%CV
3,1
0,2
5,8
153,2
5,9
3,8
75,8
3,3
4,4
36,0
1,7
4,6
18,2
0,7
3,8
9,8
0,6
6,3
58,2
2,6
4,5
3,2
0,2
6,4
Sdev inter-dosaggio
%CV
0,3
9,9
4,3
2,8
2,4
3,2
1,1
3,0
0,5
2,6
0,4
3,8
2,1
3,6
0,2
7,4
Range lineare
IgG aPS/PT: 5,1-150 unità
IgM aPS/PT: 3,6-150 unità
Per campioni con valori superiori a 150 unità, riportare i risultati come >150 unità o positivi. Per campioni con valori inferiori a
5,1 unità per IgG o 3,6 unità per IgM riportare i risultati come <5,1 o <3,6 o negativi.
QUANTA Lite è un marchio registrato di INOVA Diagnostics, Inc.
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6
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7
Fornitore:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
United States of America
Technical Service (U.S. & Canada Only) :
877-829-4745
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