Scuola SuperioreMedico Tecnica Formazione Tecnico in Analisi Biomediche Anno:2012‐2013 Nuovo test di screening rapido per la messa in evidenza dei micobatteri del complesso tubercolare e della resistenza alla rifampicina nell’espettorato tramite GeneXpert Autore: Cuccu Luciana Maria Sede: Ospedale Regionale di Mendrisio Referenti: Dr.ssa Franca Baggi ‐ Dr.Franco Keller
Abstract
Introduzione:
La tubercolosi si sta ripresentando interessando anche la Svizzera. Per i casi registrati in Ticino si tratta per lo più di immigranti soggiornanti nel Centro Asilanti di Chiasso la cui gestione è presa a carico dall’Ospedale Beata Vergine Mendrisio. Lo scopo di questo lavoro di diploma è rispondere all’esigenza di una diagnostica più veloce che migliori la gestione dei casi e aiuti il contenimento delle spese sanitarie, introducendo un nuovo test di screening rapido per la messa in evidenza dei micobatteri del complesso tubercolare, agenti eziologici della malattia. Introduction: Tuberculosis disease is coming back, also in Switzerland. In Ticino the majority of registered cases are found among immigrants that stay in the center for asylum seekers in Chiasso. These tuberculosis cases are principally treated by the Regional Hospital of Mendrisio. The purpose of this Diploma Work is improve the management of these disease cases and help to contain the healthcare costs, by introducing a new rapid screening test that can detect the m. tuberculosis complex and also the Rifampicina resistance. Materiale e metodi: Sono stati analizzati 18 campioni tra: sedimenti di espettorato, lavaggi e aspirati, forniti dal Servizio di Microbiologia Eolab(SMIC), con GenExpert Dx System utilizzando il kit MTB‐Rif Xpert®. Il principio utilizzato dall’analisi è una PCR real‐time che permette la detezione dei micobatteri del complesso tubercolare e la resistenza alla rifampicina. I risultati ottenuti sono stati paragonati con i precedenti della microscopia diretta, della coltura e dove disponibile della PCR real‐time Roche utilizzati presso lo SMIC Materials and methods 18 different samples of: sputum sediment, washing and aspirations , supplied by the microbiology service of Eolab,were analyzed with GenExpert Dx System using the kit MTB‐
Rif Xpert. Employing PCR real‐time, this test detected the presence of m. tuberculosis complex and also mutations that cause a Rifampicina resistance. Rifampicina is an antibiotic used in the treatment of tuberculosis disease. The results obtained with this new test were finally compared with the previous results from direct microscopy, culture and Roche PCR made use of by the microbiology service of Eolab. Risultati Dal paragone dei risultati emerge che il nuovo test di screening rapido MTB‐Rif Xpert®è in grado dettetare la presenza del micobatteri del complesso tubercolare in tutti i casi con microscopia e coltura positiva costituendo un analisi con elevata sensibilità diagnostica. Rispetto alla PCR Roche è invece leggermente meno sensibile per via della soglia di detezione più alta. Non si presentano casi di falsi positivi. Results By comparing the results it can be seen that this new rapid screen test detected the presence of m. tuberculosis complex every time that is positive in microscopy and culture, showing an high diagnostic sensitivity. It is slightly less sensitive in comparison to PCR Roche because of the higher detection threshold. No false negative case were found. Conclusioni Il test MTB‐Rif Xpert® proposto come screening rapido presenta un’ottima sensibilità diagnostica presentandosi adatto allo scopo diagnostico per cui era previsto,fornendo un primo risultato in meno di due ore. La validazione è riuscita e l’obiettivo è stato raggiunto.
Conclusion The MTB‐Rif Xpert®test can well be used as a screening test because it has an high diagnostic sensitivity, demonstrating its suitability for the use for which it was planned. With this test it’s now possible to have a first result in less than 2 hours and so the aim of the study was reached. Sommario
Abstract ................................................................................................................................................... 0 1 Introduzione: ................................................................................................................................... 2 1.1 I micobatteri: agente eziologico della tubercolosi .................................................................. 2 1.2 Classificazione dei micobatteri ................................................................................................ 3 1.3 La Tubercolosi ......................................................................................................................... 3 1.3.1 Scoperta .......................................................................................................................... 3 1.3.2 Vie di trasmissione .......................................................................................................... 3 1.3.3 Fasi cliniche della malattia .............................................................................................. 4 1.3.4 Complicazioni della tubercolosi ...................................................................................... 4 1.4 Epidemiologia della tubercolosi .............................................................................................. 6 1.4.1 Incidenza ......................................................................................................................... 6 1.4.2 Mortalità .......................................................................................................................... 6 1.4.3 Trattamento .................................................................................................................... 7 1.4.4 Resistenze antibiotiche della tubercolosi ........................................................................ 7 1.4.5 La tubercolosi nel territorio svizzero ............................................................................... 7 1.4.6 Rischio di contrarre la tubercolosi .................................................................................. 8 1.5 Diagnostica .............................................................................................................................. 9 1.5.1 Biosicurezza ..................................................................................................................... 9 1.5.2 Test diagnostici classici .................................................................................................. 10 1.5.3 Altri test ......................................................................................................................... 13 1.5.4 Test molecolari .............................................................................................................. 13 2 Motivazione della scelta del lavoro di diploma ............................................................................. 15 3 Obiettivo ........................................................................................................................................ 15 4 Test MTB‐RIF Genexpert ............................................................................................................... 16 5 4.1 Cappa a flusso laminare ........................................................................................................ 16 4.2 GeneXpert ............................................................................................................................. 17 4.3 Descrizione dell’analisi .......................................................................................................... 17 4.4 PCR real‐time ......................................................................................................................... 18 4.5 Regione di resistenza per la rifampicina ............................................................................... 19 Materiali e metodi ......................................................................................................................... 20 5.1.1 Campioni clinici ............................................................................................................. 20 5.1.2 Materiali non forniti nel kit ........................................................................................... 20 5.1.3 materiale del kit ............................................................................................................ 21 5.2 Controlli di qualità ................................................................................................................. 21 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 5.3 Principio della procedura ...................................................................................................... 21 5.4 Procedimento ........................................................................................................................ 21 5.5 Lettura del risultato ............................................................................................................... 23 5.6 Limitazioni del metodo .......................................................................................................... 25 5.7 Sensibilità rispetto al Gold Standard ..................................................................................... 25 5.8 Sensibilità analitica ................................................................................................................ 25 6 Validazione .................................................................................................................................... 25 7 Risultati .......................................................................................................................................... 26 8 7.1 Discussione ............................................................................................................................ 26 7.2 Conclusioni ............................................................................................................................ 28 Bibliografia .................................................................................................................................... 29 1 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 1 Introduzione:
1.1 Imicobatteri:agenteeziologicodellatubercolosi
Il Mycobacterium è un microrganismo della famiglia delle Mycobateriacee. Esistono oltre 20 specie di micobatteri patogeni per l’uomo; alcune sono considerate sempre patogene altre sono patogene opportunisticamente, spesso in pazienti immunocompromessi, ed infine specie saprofitiche che sono per lo più micobatteri ambientali, raramente patogene per l’uomo. Questi microrganismi hanno una forma bacillare, sono lunghi da 2 a 4 µm e larghi da 0,2 a 0,4 µm. Si possono rilevare delle variazioni morfologiche dovute a influssi esterni come la coltura, dove i micobatteri hanno la tendenza ad accorciarsi ed assumere una forma piuttosto cocco‐bacillare, mentre quelli estratti da pazienti con prolungato trattamento spesso si ritrovano frammentati come a formare delle catenelle di granuli. Hanno un metabolismo aerobio e microaerofilo, necessitano solo di piccole quantità di ossigeno per la sopravvivenza. Essendo batteri immobili non sono in grado di muoversi; sono anche sprovvisti di capsula e non sono in grado di produrre spore. Le caratteristiche principali che li distinguono sono: Lentezza replicativa: il loro ciclo replicativo ha la durata di circa 20 ore, tempo in cui un comune battere come l’E.coli raggiunge 4000 copie circa. Questa sua caratteristica spiega quindi la tempistica molto lunga per la sua coltura. Bisogna comunque accennare l’esistenza di alcuni micobatteri a crescita più rapida, che non hanno particolari esigenze nutritive e sono in grado di crescere anche su terreni aspecifici. Composizione ad alto contenuto lipidico: essi sono ricchi di fosfolipidi, acidi micolici e cere, quasi tutti legati a proteine e polisaccaridi. Lo strato di peptidoiglicano cui sono legati polisaccaridi a lunga catena può causare la formazione di granulomi. I fosfolipidi contribuiscono alla formazione di necrosi caseose ed il fattore cordale presente in alcuni micobatteri costituisce un fattore di virulenza che è in grado d’inibire la migrazione dei neutrofili. L’alcool‐acido resistenza: questa caratteristica è dovuta all’elevata quantità di lipidi della membrana batterica. I micobatteri non si colorano bene con la colorazione di Gram, mentre trattengono molto bene coloranti acquosi in soluzione di fenolo. Il fenolo ha la funzione di facilitare l’entrata dei coloranti nella parete cellulare. Tali coloranti a base fenolica non vengono eliminati dal trattamento decolarante con miscela alcol‐acido. (1) 2 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 1.2 Classificazionedeimicobatteri
All’interno della grande famiglia dei micobatteri si applica una principale distinzione che ha lo scopo di dividere i micobatteri in grado di causare una tubercolosi e quelli che non sono in grado di causare tale malattia. Si hanno quindi secondo la classificazione del Bergey’s Manual due principali categorie: ‐
Micobatteri del complesso tubercolare (M.tubercolosis complex) M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis B.C.G.(ceppo vaccinale) ,M.caprae, M. africanum e M.pinnipedi. ‐
MOTT (Mycobacteria Other Than Tuberculosis) Anche chiamati atipici ovvero micobatteri diversi da quelli del complesso tubercolare. Fra i MOTT sono di particolare interesse clinico: il M. leprae che causa la lebbra; i M. avium complex responsabili d’infezioni polmonari e linfoadeniti, il M. kansasii responsabile anch’esso d’infezioni con localizzazioni polmonari ed altre sedi, ed infine il M. marinum che crea ulcerazione e lesioni superficiali cutanee. Per i MOTT vi è un’altra classificazione: la Runyon che fa capo a caratteristiche cromogene e di velocità di crescita. (1) 1.3 LaTubercolosi
1.3.1
Scoperta
Fu il biologo tedesco Robert Koch a scoprire la tubercolosi, da egli deriva anche la seconda nomina attribuita al M. tubercolosis: “bacillo di Koch”. Ne annunciò la scoperta il 24 marzo del 1882. Lo identificò, dopo diversi tentativi di colorazioni su un espettorato di un paziente affetto da tubercolosi e mediante osservazione al microscopio ne scopri la forma bacillare. Egli fu anche in grado di isolarlo e coltivarlo per estrarne successivamente la proteina della tubercolina. Fu così lui a scoprire che l’agente eziologico della tubercolosi era il micobatterio. 1.3.2
Vieditrasmissione
La trasmissione della tubercolosi avviene principalmente per via aerogena. Per infettarsi un individuo deve inalare particelle di aerosol contenti i bacilli tubercolari. La diffusione di tali particelle avviene attraverso colpi di tosse, starnuti emessi da una persona infetta ed infettiva, quindi portatrice di una tubercolosi “aperta” e perciò in grado di trasmetterla. La prova di una tubercolosi aperta è costituita dalla presenza di micobatteri nell’espettorato. Ovviamente se i micobatteri presenti nell’espettorato sono morti, come può capitare in pazienti già trattati e guariti, il pericolo d’infettarsi venendo in contatto con essi è nullo. Le particelle tubercolari quindi, fluttuano sospese nell’aria in goccioline di 1‐5 µm e possono essere inalate da altri individui sani. Queste goccioline una volta inalate raggiungeranno gli alveoli del nuovo ospite. 3 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 La probabilità di essere infettati dipende principalmente dalla concentrazione di micobatteri nell’aria dal tempo d’esposizione e dalla situazione immunitaria della persona che viene in contatto con queste particelle. (2) 1.3.3
Fasiclinichedellamalattia
Una volta che i micobatteri inalati raggiungono il parenchima alveolare danno una lesione di tipo essudativo dove i macrofagi alveolari fagociteranno i micobatteri(risposta immunitaria aspecifica). Se questo tipo di lesione non riesce ad evadere il sistema immunitario andrà incontro ad una guarigione spontanea senza conseguenze. L’infezioneprimaria: si sviluppa invece quando la sola risposta immunitaria aspecifica non riesce a risolvere l’infezione. Così raggiunto un certo numero di macrofagi infetti, in cui i micobatteri riescono a sopravvivere protetti dalla loro parete, tra la seconda ed ottava settimana dal contagio, entra in atto la risposta immunitaria cellulo‐mediata che porta alla formazione del granuloma. Il granuloma è strutturato in: una parte centrale formata da cellule giganti polinucleate che contengono i micobatteri fagocitati, poi vi è una parte intermedia costituita da cellule epiteliodi disposte a raggiera che fungono da isolamento della parte centrale, ed infine il tutto è avvolto da uno strato periferico di fibroblasti, linfociti e monociti. Quando successivamente lo strato periferico viene avvolto da tessuto fibroso e la zona centrale incorre in necrosi caseosa, questa struttura prende il nome di tubercolo. A questo punto il tubercolo può rimanere circoscritto ed andare incontro a calcificazione, contenente ancora all’interno micobatteri in grado di riattivarsi anche a distanza di anni; oppure la necrosi caseosa può fuoriuscire per via della rottura del tubercolo e dare luogo ad una cosi detta cavità tubercolare. Queste due strutture sono diagnosticabili con una radiografia toracica. L’infezionepost‐primariaoriattivazione: può essere causa di reinfezione esogena da un nuovo ceppo, riattivazione di micobatteri tubercolari del complesso primario oppure riattivazione di granulomi formatisi nell’infezione primaria. I sintomi sono una continua tosse per settimane o mesi, spesso nei fumatori passa inosservata. A livello di laboratorio segnali tipici che dovrebbero far pensare ad tubercolosi sono: un aumento della proteina C‐reattiva, una leucocitosi spesso accompagnata da monocitosi ed uno stato anemico. (2) 1.3.4
Complicazionidellatubercolosi
Le complicazioni che si possono verificare in seguito ad una tubercolosi sono: Latubercolosiextra‐polmonare: ha una frequenza maggiore nei bambini piuttosto che negli adulti. Si tratta di una delocalizzazione dei batteri tubercolari, spesso per via ematica o linfatica, che raggiungendo altri organi possono dare luogo a queste forme particolari di tubercolosi. 4 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 Le tipiche forme di tubercolosi extra‐polmonari sono: ‐
Linfadenite tubercolare caratterizzata da ingrossamento spesso indolore dei linfonodi. Si manifesta principalmente nei linfonodi cervicali e sottomandibolari e meno frequente quelli della zona mediastinica e retroperitoneale. ‐
Tubercolosi pleurica dovuta dalla diffusione d’un infiltrato polmonare, a volte la diffusione raggiunge la pleure per via ematica. ‐
Tubercolosi urogenitale non sempre causa di una tubercolosi primaria. Infatti nel trattamento del carcinoma vescicale viene usato il M. B.C.G del ceppo vaccinale che favorisce la desquamazione dell’epitelio vescicale riducendo l’entità del tumore. In questo caso si tratta di una tubercolosi urogenitale terapeutica indotta e che non è conseguenza di una tubercolosi primaria con delocalizzazione. ‐
Tubercolosi ossea più frequente nei pazienti anziani ‐
Meningite tubercolare anch’essa delocalizzazione del battere. Come sintomo della patologia si manifesta febbre ed alterazione rapida dello stato generale del paziente Latubercolosimiliare: è una forma di tubercolosi extra‐polmonare molto particolare con prognosi negativa, con difficile risoluzione anche con trattamento. Colpisce soprattutto persone con un sistema immunitario indebolito. Prende il nome “miliare” perché la caratteristica di tale malattia è un polmone che nella radiografia si presenta tappezzato di numerosi piccoli granuli della grandezza di un chicco di miglio. A causa di una mancata risposta immunitaria efficiente i micobatteri riescono a raggiungere le vie linfatiche ed attraverso esse giungono nei linfonodi ed in tutto l’organismo. Si può parlare di una sorta di setticemia tubercolare Figura 1: radiografia paziente con tubercolosi miliare con conseguenze gravissime per il paziente. Nella radiografia di fianco sono ben evidenziabili i numerosi focolai che si sono formati a causa di questa diffusione batterica. (2) 5 Lavorro di diplomaa 2013 CCuccu Lucian
na Maria
SSMT‐TAB3
3 1.4 Epidemiiologiade
ellatuber colosi
La tubercolosi rim
mane oggi gio
orno un probblema d’interesse mondiale, costituissce la second
da causa di o subito dopo
o l’HIV. L’Orgganizzazione
e Mondiale della Sanità(O
OMS) ha dich
hiarato morte nel mondo
TS( program m to stop tu
ubercolosis l’emeergenza globale tubercolosi già nel 19993. Col proggramma DOT
diffussion), propossto dall’OMSS(sigla inglesee WHO‐Worrld Health Organisation), il quale com
mprende delle linee guida per la gestione, la diagnoosi, la cura e la registrazione dei casi,, ci furono già dei cospicui progresssi con un successo di curaa del’85%. Ovviamente aumentano i casi dichiara
ati, che nque milioni quell’anno, casi che sen
nza queste nu
uove linee guuida son sare
ebbero stati arrivaano fino a cin
portaati alla luce. N
Nel 2006 si ssviluppa un nnuovo progettto “the stop
p TB strategyy” che per il 2
2015 preveede la riduzio
one del 50% della compaarsa di nuovi casi e la dim
minuzione deelle morti, in rapporto ai dati rregistrati nel 1990. L’OMS, sempre inn prima linea nella lotta a
alla tubercoloosi, ha registtrato tra il 2010 e il 2011 una diminuzion
ne del 41% ddella mortalittà, prospetta
ando un buoono scenario per il del traguardo
o prefissato eentro il 2015
5. (3) raggiungimento d
1
1.4.1
Incidenzza
Stimaare l’incidenzza della tuberrcolosi, cioè nuovi casi l’anno, non è sem
mplice, per via deella concentrrazione della malattia in ccerte aree 2011la geogrrafiche. Nel 2
stimaa è di 8,7 milioni di nuovi casi, quindii una uenza di 125 casi su frequ
100'0000 abitanti: il 59% dei casi ssi registra in A
Asia, il 26% iin Africa, meentre in Figura 2:inciddenza TBC nel m
mondo anno 20
011
Europ
pa si ha il 4,3
3 % dei casi. Di questi 8,77 milioni di nuovi casi circca 1,2 milionni sono HIV positivi. (3) 1.4.2
2
Mortalittà
Nel 2011 si stimano 1,4 milio
oni di morti l’anno per tu
ubercolosi, i dati mostranno una mortalità di 20 dei pazienti H
HIV positivi. RRispetto al 1990 c’è perssone su 100'000 abitanti, tenendo coonto anche d
stata anche una riduzione de
ella mortalit à del 41%; in
n America la riduzione deella mortalità
à ha opi prefissati per il 2015( mortalità<50
0% rispetto a
ai dati regist rati nel 1990
0).Il calcolo ragggiunto gli sco
dellaa mortalità eequivale al numero di moorti sul nume
ero di malati l’anno. (3) 6 Lavorro di diplomaa 2013 1.4.3
3
CCuccu Lucian
na Maria
SSMT‐TAB3
3 Trattam
mento
Il tratttamento per la cura dellla tubercolossi prevede una fase inziale con utilizzzo di una com
mbinazioni con p
più farmaci tu
ubercolari, con lo scopo di ridurre drrasticamente
e il numero ddi micobatterri presenti. Succeessivamente si attua un ttrattamento a lungo term
mine per elim
minare tutti ii micobatterii residui. Primaa di iniziare il trattamentto si dovrà inndentificare iil microrganismo ed effetttuare i test di sensibilità ai farm
maci antitube
ercolari. Que sti farmaci aantitubercola
ari di prima liinea sono l’issoniadzide ee he hanno fun
nzione batte ricida, uccido
ono il battere; l’etambuttolo che funzziona come la rifaampincina ch
batteeriostatico, contenendo la replicazionne dei micob
batteri presen
nti ed il piraddzinamide ch
he in assocciazione ai prrecedenti aiu
uta ad abbreeviare i tempi della durata terapeutic a. (2) 1.4.4
4
Resisten
nzeantibiottichedella tubercolossi
Una d
delle problem
matiche che oggi interesssa il trattamento delle tu
ubercolosi è la resistenza
a antibiotica che ccerti ceppi tu
ubercolari sviiluppano nei confronti dii medicamen
nti della prim
ma linea. Si trratta di resisttenze all’ison
niadzide, rifa
ampicina, etaambutolo e p
pirazinamide
e. Queste ressistenze venggono diagn
nosticate con
n test di senssibilità, che ppossono prevvedere un ultteriore chiarrimento con l’utilizzo di analissi genetiche.. Le resistenzze si riscontrrano maggiorrmente in pa
azienti: già trrattati in precedenza, proveenienti dall’eestero o con età superiorre ai 65 anni. Le principali resistenze sono quella all’iso
oniadzine ed alla rifampicina. Per queesti pazienti andrà appliccato un protoocollo terape
eutico differrente che andrà scelto dii caso in casoo. (2) 1.4.5
5
Latuberrcolosineltterritoriossvizzero
Semp
pre più bassi i numeri di ccasi di tuberccolosi in Svizzzera, solo ne
el 2009 si ripporta un lieve
e aumento con 5556 casi di tu
ubercolosi, da
a ricondurree ad un’ondata migratoria
a provenientte dal corno dell’Africa. Rimane comunqu
ue in calo il n
numero di tu bercolosi traa gli originari della Svizzeera, mentre d
dal 1996 le otiche registrrate rimangoono pressoch
hé invariante
e con una preevalenza della resisttenze antibio
resisttenza all’ison
niadzine. Dai dati raccoltii tra il 2005 e
e il 2009 eme
erge che nel 71% dei cassi di tuberrcolosi si trattta di person
ne nate all’esstero o di nazzionalità stra
aniera. (2)
7 Lavorro di diplomaa 2013 CCuccu Lucian
na Maria
SSMT‐TAB3
3 È ino
oltre dimostrrata una corrrelazione tra richieste d’aasilo e casi di tubercolosii, nel 2009 sii parla di 91 casi d
di tubercolossi su 159 rich
hieste d’asiloo e rifugiati. C
Confrontando malati di tuubercolosi svvizzeri e quelli stranieri si delinea una discrepanza in base all’e
età: 67 anni n
nei casi d’origgine Svizzera
a e 33 nei di migranti. Q
Questo è da ricondurre aalle condizion
ni socio‐econ
nomiche diffeerenti; oggi ggiorno in casi d
Svizzeera il rischio di venire in contatto conn la tubercolosi è basso rrispetto a qu ello che si prresenta nei paesii in via di svilluppo da dovve provengo no la maggio
oranza dei migranti. In svvizzera sono piuttosto le perso
one anziane a presentare
e tubercolosii poiché nellaa loro giovinezza erano ddecisamente più a rischiio di contrarre la malattia
a infatti spessso si tratta d
di casi di riatttivazione, tippici nelle con
ndizioni in cui il sistema imm
munitario divventa meno eefficiente come l’avanzarre dell’età (22). Dal grafico sopra che riporta l’età e l’origiine dei malatti di tubercolosi tra il 20005 e il 2009 ssi può olosi tra gli sttranieri l’età in cui si ha p
più frequenzza della mala
attia e nella vederre che nei caasi di tuberco
giovin
nezza tra i 20
0 ed i 40 ann
ni (2). 1.4.6
6
Rischiod
dicontrarrrelatuberccolosi
Magggiormente in
nfettivi sono i pazienti chee presentano
o un espetto
orato sponta neo o indottto positivo per laa microscopia. Vivere in a
ambienti dovve vi è una p
persona infetttiva aumentta di molto la
a possibilità di con
ntrarre la maalattia per co
ontagio. La pprobabilità dii essere conttagiati è propporzionale alla durata d’esp
posizione ad ambienti con pazienti in fetti. Tra tuttti i tipi di tub
bercolosi soloo quella polm
monare preseenta la possib
bilità di conttagio. Un altoo rischio di contrarre la m
malattia è la condizione d’imm
munosoppreessione, tra q
questi casi soono molto no
oti quelli di pazienti HIV ppositivi, poiché nelle loro ccondizioni la malattia è in
n grado di prrogredire. An
nche i bambiini al di sottoo dei 5 anni ssono una categgoria a rischio
o. (2) Rimane quindi im
mportante l’in
ndagine ambbientale, che indentifica ii casi d’infeziione tuberco
olare.
8 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 1.5 Diagnostica
1.5.1
Biosicurezza
Prima di parlare concretamente dei vari test diagnostici è importante interrogarsi sulle misure di sicurezza da intraprendere all’interno del laboratorio. Trattare materiale infetto da micobatteri del complesso tubercolare richiede l’utilizzo di misure di sicurezza diverse rispetto al normale trattamento di materiale biologico per la determinazione indiretta della malattia tramite sierologia. I batteri vengono suddivisi in quattro classi di rischio: Agente biologico di gruppo 1 Un agente che con poca probabilità è causa di malattie nell’uomo (nessuno o basso rischio individuale e o negli animali. collettivo) Agente biologico di gruppo 2 Un agente patogeno che può causare malattie nell’uomo o negli (moderato rischio individuale, limitato animali, ma che è poco probabile che costituisca un serio pericolo rischio collettivo) per chi lavora in laboratorio, per la comunità, per il bestiame e per l’ambiente. Le esposizioni in laboratorio possono causare patologie, ma sono disponibili trattamenti efficaci e misure preventive e il rischio di diffusione è limitato. Agente biologico di gruppo 3 Un agente patogeno che usualmente causa gravi patologie (elevato rischio individuale, basso rischio nell’uomo o negli animali e costituisce un serio rischio per i collettivo) lavoratori. Difficilmente si propaga nella comunità e comunque sono disponibili efficaci misure terapeutiche e preventive. Agente biologico di gruppo 4 Un agente patogeno che normalmente provoca gravi patologie (elevato rischio individuale e collettivo) nell’uomo e negli animali, costituisce un serio rischio per i lavoratori e può propagarsi rapidamente nella comunità. Non sono di norma disponibili efficaci misure terapeutiche e preventive. Il micobatterio fa parte della classe III della classificazione degli agenti biologici a rischio d’infezione. Un battere di classe III può causare malattie gravi in soggetti umani e costituisce un serio rischio per i lavoratori; l’agente biologico può propagarsi nella comunità, ma di norma sono disponibili efficaci misure profilattiche o terapeutiche. Dopo questa classe ne segue solo una: la quarta con rischi maggiori, dove sono classificati microrganismi che causano malattie per cui odiernamente non sono disponibili cure, come ad esempio l’HIV. Si deve quindi pensare al livello di biosicurezza d’applicare nel laboratorio diagnostico. Per il trattamento di espettorati senza coltura basta un livello di biosicurezza 1 o 2, come sono attrezzati già il laboratori dell’Ente, quindi anche quello dell’Ospedale Regionale di Mendrisio. 9 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 Solo in caso di coltura sarà necessario avere un livello di biosicurezza 3 che prevede un’aria dedita solo per tali manipolazioni con accesso controllato , ventilazione a pressione negativa senza riciclo d’aria, cappe di sicurezza come il livello due. (4) 1.5.2
Testdiagnosticiclassici
Di regola uno dei primi esami diagnostici che si esegue davanti ad un sospetto di tubercolosi è la radiografia polmonare accompagnata da esami di batteriologia. La radiografia polmonare permette di identificare alterazioni polmonari ed indurre quindi a proseguire l’indagine medica. Generalmente l’immagine radiologica positiva va di pari passo con la successiva identificazione della presenza di micobatteri tubercolari nella batteriologia. Le lesioni tipiche riscontrabili sono le caverne e le lesioni da tubercolosi miliare. A causa delle lesioni aspecifiche, che possono esserci anche se non si tratta di tubercolosi, essa non può costituire da sola un mezzo diagnostico. La batteriologia si base sull’esaminazione di materiale clinico sospetto per presenza di micobatteri. I materiali indagati sono molteplici. Si tratta principalmente di espettorato spontaneo o indotto, ma si può eseguire una ricerca di micobatteri su liquido di lavaggio ed aspirato bronchiale, urina, puntati, secreti, pus, dializzato, linfonodi, liquor, succo gastrico (tipicamente nei bambini),biopsie, feci, sangue e midollo osseo. I materiali non sterili dovranno subire un processo di decontaminazione ed arricchimento prima di essere inseminati su terreni di cultura. I campioni dovranno subire dei pretrattamenti. Questi pretrattamenti sono: la decontaminazione e la digestione: ‐
La fluidificazione che consiste nel sciogliere lo sputo in modo da ottenere un campione più fluido e meglio maneggiabile. Generalmente si usa della sputolisina. ‐
La decontaminazione prevista per i materiali che in origine non sono sterili per la presenza della flora batterica residente. ‐
La risospensione dopo centrifugazione in tampone fosfato Il materiale può essere anche concentrato tramite centrifugazioni. Una volta fissato il materiale sul vetrino si potrà procedere con le colorazioni. (2) Microscopia delle colorazione dei micobatteri A causa dell’alcol‐acido resistenza, non si utilizza la colorazione di Gram per identificare microscopicamente i micobatteri. Sono necessarie delle colorazioni speciali Attualmente al servizio di microbiologia Eolab sono utilizzate due colorazioni specifiche per questo tipo di batteri: Ziehl‐
Nielsen ed auramina. 10 Lavoro di diploma 2013 ‐
Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 Colorazione Ziehl‐Nielsen: mette in evidenza i bacilli alcol‐
acido resistenti. Viene adagiata la soluzione di fucsina sul vetrino e successivamente scaldando a fiamma il preparato si creano dei pori nella parete dei micobatteri e il colorante riesce cosi a penetrare nella parete batterica. Segue una Figura3:http://www.oocities.org/gbruno
_2000/mico.htm decolorazione con alcol‐acido e una colorazione di contrasto con blu di metilene. I batteri alcol‐acido resistenti risulteranno colorati di rosso, mentre i batteri che non possiedono tale resistenza assumeranno una colorazione blu come si vede dall’immagine accanto. ‐
Colorazione fluorocromica con Auramina: questa è una colorazione in fluorescenza. I preparati andranno dunque osservati sotto microscopio a fluorescenza. Il limite di questa tecnica è la rilevabilità a concentrazioni di almeno 10’000 bacilli per millilitro. Con questa colorazione i Figura4:http://www.lung.ca/tb/images/full
_archive/107_bacillus.jpg bacilli risulteranno colorati di giallo su uno sfondo nero, mentre gli altri batteri non saranno visibili (microscopio a fluorescenza). Il vantaggio della colorazione ad auramina è che aumenta la possibilità di visualizzare anche pochi micobatteri poiché solo loro emettono fluorescenza mentre la flora residente,che è presente normalmente negli espettorati,non emettendo fluorescenza, non costituisce intralcio nella visualizzazione. Nell’osservazione microscopica dei preparati colorati con le colorazioni sopracitate si darà un valore in base alla quantità di micobatteri riscontrabili: pochissimi, pochi, alcuni, numerosi e numerosissimi. Questo valore costituisce il risultato dell’analisi microscopica. 11 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 Coltura: è complementare all’osservazione microscopica sia perché la coltura permette la valutazione di vitalità dei micobatteri sia perché se la quantità di micobatteri presenti nell’espettorato fosse cosi bassa da non essere visibile nella microscopia in coltura moltiplicandosi sarebbe evidenziabile la loro presenza. Si possono verificare casi in cui campioni con una microscopia negativa siano positivi per la coltura. Esistono terreni di coltura: ‐
Solidi: tubi contenti il terreno. Vengono utilizzati due tipi differenti di terreni: il Löwenstein‐
Jensen ed il Colestos. Una volta inseminati i terreni vengono incubati a 37° per otto settimane in posizione orizzontale, per favorire l’inseminazione dell’intera superfici. I tappi a vite dei tubi vengono aperti leggermente per far entrare l’anidride carbonica (che è presente tramite bombola nell’incubatore) poiché ne favorisce la crescita dei micobatteri. ‐
Liquidi: contengono antibiotici con arricchimento di crescita. L’antibiotico aiuterà a non far crescere rimasugli della flora residente. Questi tubi di terreno liquido vengono incubati in un apparecchio, il MGIT, il quale con lettura fotometrica segnalerà la presenza di una crescita nelle successive otto settimane d’incubazione. Il MGIT viene utilizzato anche per testare le sensibilità antibiotiche dei micobatteri resistenti. Il principio di lettura è sempre fotometrico. La coltura può positivizzarsi anche dopo una settimana, tutto dipende dalla quantità di micobatteri inseminati e dalla loro vitalità e velocità di crescita. Per ogni coltura positiva viene poi effettuata una colorazione di Gram ed un Ziehl‐Nielsen per essere certi di avere una crescita micobatterica ed escludere un’eventuale crescita di altri batteri che si trovavano nel materiale, flora residente del luogo di prelievo del campione. Crescite aspecifiche saranno comunque di rilevanza clinica nel caso il materiale di partenza doveva presentarsi fisiologicamente sterile. I test di sensibilità agli antibiotici vengono effettuati sempre tramite MGIT. Il MGIT è un apparecchio che funziona come incubatore a 37°C per le provette contenti i campioni in coltura liquida; esso è in grado di rilevare l’anidride carbonica prodotta dall’utilizzo di ossigeno dei micobatteri poiché marcata radioattivamente. Quando si trova la coltura positiva si può procedere anche ai test di resistenza antibiotica sempre tramite MGIT. Questo consente di fornire al medico informazioni importanti per la scelta del trattamento farmacologico per la terapia di pazienti affetti da tubercolosi. La microscopia e la coltura costituiscono ancora oggi il Gold‐Standard per la ricerca dei micobatteri tubercolari. Come Gold Standard s’intendono le analisi atte ad eliminare dubbi che possono sorgere 12 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 con altre analisi. Quindi per la rilevazione dei micobatteri l’analisi più efficace ed efficiente è la microscopia con la coltura. (5) (6). 1.5.3
Altritest
oltre alla batteriologia classica sono disponibili: ‐
Test della tubercolina È un intracutaneo, viene iniettata della tubercolina, si formerà una bolla ed a seconda della presenza o meno di anticorpi contro questa proteina del micobatterio si svilupperà una zona indurità. La lettura del test avviene dopo 72 ore e si misura questo indurimento in termini di millimetri. Sono noti falsi positivi da infezione con micobatteri ambientali e precedente vaccino con ceppo BGC. Questo perché la positività al test indica solo che il paziente è venuto in contatto con il micobattere e che ne ha una memoria immunologica. ‐
IGRA (Interferon Gamma Release Assays) Questo test si basa sulla produzione di Interferone Gamma da parte dei linfociti T stimolati con dopo incubazione con tre antigeni di Mycobacterium tuberculosis: ESAT‐6, CFP‐10 e TB7.7. Il vantaggio di questi test è l’assenza di falsi negativi da vaccino con BGC. o da infezioni con altri micobatteri non tubercolari. Attualmente i più comuni IGRA test sono: il QuantiFERON‐TB® Gold In‐Tube ed il T‐SPOT.TB® (2) (5) 1.5.4
Testmolecolari
I test di biologia molecolare con ricerca del materiale genetico tubercolare costituiscono oggi un complementare ai gold standard della batteriologia classica. Sono dei metodi PCR cioè di amplificazione genetica. Sono meno sensibili ma altamente specifici. Purtroppo con un’analisi di questo tipo non si verifica la vitalità dei micobatteri, ciò significa che potrebbero essere trovati anche micobatteri morti. Questi utilizzano la tecinica PCR e Real Time PCR. 1.5.4.1 PCRePCR‐real‐time.
La tecnica PCR consiste nell’utilizzare una coppia di primer ed una DNA polimerasi per amplificare un segmento specifico di DNA. Si susseguiranno dei cicli termici che consistono in una fase di denaturazione del DNA a temperatura elevata, una fase di appaiamento dei primer, a temperatura inferiore rispetto alla denaturazione ed una fase di estensione del filamento a singola catena del DNA con una temperatura intermedia. L’amplificazione sarà esponenziale. La real‐time PCR utilizza delle sonde a fluorescenza, rileva e quantifica un segnale di fluorescenza, che direttamente proporzionale alla quantità di materiale amplificato, ciò permette di monitorare l’amplificazione durante i cicli. La quantità di target è inversamente proporzionale al numero di cicli necessari al rilevamento del 13 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 segnale fluorescente soglia definito anche CT (threshold cycle). Threshold Cycle è il numero del ciclo in cui la fluorescenza diventa positiva e quindi rilevabile. Poiché il CT viene determinato durante la fase esponenziale di amplificazione, il risultato è di gran lunga più affidabile di quello ottenibile in end‐point con la PCR tradizionale. Come End Point si intende un risultato disponibile solo alla fine dell’amplificazione e non indica a che ciclo il materiale è messo in evidenza. Per la ricerca dei micobatteri tubercolari si possono utilizzare varie zone del DNA come target. Dovranno essere delle zone conservate in tutti i micobatteri del complesso tubercolare Le più note sono: ‐
il rDNA 16S una fra le regione più conservate nei batteri ‐
IS6110 è una sequenza di 1.361 basi in grado di duplicarsi e di spostarsi all’interno del genoma di micobatteri del complesso tubercolare; di essa è possibile ritrovarne fino a 25 copie, anche se nella grande maggioranza dei ceppi il numero è compreso fra 5 e 20 (5). 14 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 2 Motivazionedellasceltadellavorodidiploma
La tubercolosi, malattia fino a poco tempo fa considerata debellata nei paesi occidentali, si sta ripresentando. La riemergenza sarebbe dovuta a flussi migratori, zone in gravi condizioni di povertà e casi d’immunodepressione. Questa problematica interessa anche la Svizzera e la realtà ticinese. Nella maggior parte dei casi che si presentano in Ticino, si tratta di soggiornanti nel centro asilanti di Chiasso. La gestione di tali casi è presa principalmente in gestione dall’Ospedale Regionale di Mendrisio (OBV). Introdurre una diagnostica rapida come quella del kit MTB‐RIF Xpert® permetterebbe una diagnostica della tubercolosi in tempi brevi e consentirebbe d’isolare precocemente il paziente, evitando cosi altri contatti e contaminazioni, nonché aiuterebbe a contenere parte delle spese sanitarie, particolarmente quelle generate dall’isolamento del paziente. 3 Obiettivo
Lo scopo di questo lavoro di diploma è quello di validare l’analisi per la ricerca di micobatteri del complesso tubercolare con il kit MTB‐RIF GeneXpert della Cepheid. Kit che oltre a rilevare la presenza del M. tubercolosis Complex è in grado di rilevare la presenza delle resistenze alla Rifampicina, medicamento di prima linea per il trattamento delle tubercolosi. L’introduzione in routine di tale analisi non andrebbe comunque a sostituire le attuali analisi di microscopia diretta e coltura dei micobatteri presso il servizio di microbiologia Eolab. Si tratterebbe di aver un primo risultato in due ore, che in caso di positività consentirebbe d’isolare immediatamente il paziente aiutando quindi il trattamento di tali casi all’interno dell’equipe medica. In caso di rilevamento della resistenza alla rifampicina, si avrebbe una prima indicazione terapeutica. 15 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 4 TestMTB‐RIFGenexpert®
L’ Xpert MTB‐RIF è un sistema semiquantitativo per la messa in evidenza di DNA di micobatteri del complesso tubercolare (MTBC) e presenza delle mutazioni del gene rpoB responsabili della resistenza alla rifampicina su campioni d’espettorato, tramite real‐time PCR utilizzando come apparecchio il Genexpert System. L’integrazione in routine dell’MTB‐RIF fornisce due informazioni importanti per il sospetto di tubercolosi: ‐
La detezione di genoma micobatterico del complesso tubercolare ‐
Un’eventuale mutazione che porta alla resistenza alla rifampicina L’esecuzione di questo test comporta la manipolazioni con campioni con potenziale presenza di micobatteri del complesso tubercolare. È necessarie quindi misure di sicurezza adeguate al trattamento di un battere di classe III. Il laboratorio dovrà perciò disporre di una cappa a flusso laminare dove poter effettuare le manipolazioni sul materiale clinico d’analisi in totale sicurezza. 4.1 Cappaaflussolaminare
Il primo passo per l’introduzione di tale analisi è stato quindi l’acquisto di una cappa a flusso laminare di cui il laboratorio dell’Ospedale di Mendrisio non era a disposizione. La scelta è stata una cappa biologica a flusso laminare verticale di tipo due. La principale caratteristica è quella di proteggere l’operatore grazie al flusso verticale ed allo schermo regolabile che separa l’operatore dalla zona di lavoro. È dotata di: quattro filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air filter), d’illuminazione, prese di corrente attivabili dai tasti esterni , lampada raggi UV con attacco a calamita e possibilità di regolazione timer. Funzionamento: l’aria pressurizzata spinta nell’aria di lavoro, attraverso motoventilatore, passa , insieme all’aria proveniente dall’esterno attraverso la griglia bucherellata ,che costituisce la superficie del piano di lavoro. Da li viene aspirata nel canale che porterà l’aria nel retro della cappa dove passa attraverso il filtro HEPA. Parte di essa viene rigettata all’esterno nell’ambiente e parte torna nella zona di lavoro. Il nome “flusso laminare” è dovuto proprio a quest’unidirezionalità dell’aria che crea una corrente d’aria omogenea priva di turbolenze. Per assicurare il flusso laminare l’operatore dovrà utilizzare la cappa nel modo corretto, cioè tenere l’apertura al minimo indispensabile 20 cm circa e non coprire la 16 Figura 5: movimento aria in una cappa a flusso laminare Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 superficie poiché interrompe il flusso omogeneo e causa il rigetto dell’aria della zona di lavoro all’esterno costituendo cosi un pericolo di contaminazione della zona circostante l’aria di lavoro qualora si fosse creato dell’aerosol durante la manipolazione di campioni infetti da TBC. Cura della cappa: terminate le manipolazioni si pulisce la cappa con disinfettanti appositi per i micobatteri, si chiude la cappa e si attiva la lampada raggi UV per circa tre ore per effettuare una sterilizzazione dell’aria di lavoro, eliminando eventuali tracce di micobatteri che durante le manipolazioni possono essere stati sparsi nell’aria di lavoro. (7) 4.2 GeneXpert
GeneXpert della ditta Cepheid è un apparecchio di biologia molecolare automatizzato in grado di eseguire una PCR real‐time e dei principiali processi associato ad esso cioè: l’estrazione del DNA, l’amplificazione del Target e il rilevamento; utilizzando delle cartucce fornite dai vari kit per le diverse analisi. I kit che siamo andati a utilizzare con il sistema GeneXpert è l’Xpert MTB‐RIF, per la ricerca dei micobatteri del complesso tubercolare, fornito sempre dalla ditta Cepheid. 4.3 Descrizionedell’analisi
Prima di poter iniziare con l’analisi, si deve pretrattare il campione. Il pretrattamento consiste nel fluidificare il campione utilizzando il reagente campione, che ha la funzione di omogenizzare il campione e ridurre la vitalità dei micobatteri per abbassare i rischi infettivi. La cartuccia utilizzata, fornita nel kit, è costituita da quattro aree di reazione un tubo di aspirazione centrale che comunica con il filtro sottostante e degli scompartimenti dove sono contenuti i reagenti, che contengono i tamponi con surfattanti, e le microsfere, che contengono i costituenti necessari per la PCR real‐time (primer, sonde, KCl, MgCl₂, HEPES pH 8,BSA, HEPES pH 7,2, polimerasi, dNTP). Una volta dispensato il campione nella camera del campione ed inserita la cartuccia nel modulo, l’apparecchio introdurrà il pistone nella camera di aspirazione e procederà all’aspirazione del campione nella zona attiva. Con un sistema di pressione spinge il campione sul filtro aspira i diversi reagenti contenti i tamponi e procede con la fase di estrazione del DNA,che avviene mediante un corno sonoro che causa la lisi dei bacilli tramite ultrasuoni. Il materiale genetico liberato passa oltre la membrana del filtro e viene spinto nelle camere di contenimento delle prime due microsfere. Tramite il controllo PCC l’apparecchio verifica l’idratazione delle sfere liofilizzate ed al momento opportuno inietta il campione con le sfere reidratate nella camera di reazione dove avverrà la prima reazione PCR. Terminata la prima reazione dispensa il materiale nella camera contente le altre sfere liofilizzate. Come prima appena l’idratazione sarà completa ridispensa il campione nella camera di reazione e avviene un altro ciclo con l’utilizzo della detezione della fluorescenza. 17 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 4.4 PCRreal‐time
La PCR real‐time viene utilizzata come applicazione in campo medico per determinare la presenza di DNA anche a concentrazioni molto basse. Costituisce cioè un metodo altamente sensibile. Utilizza dei cicli termici per le differenti fasi della PCR: ‐
Denaturazione (94‐96°) In questa fase avviene l’apertura della catena a doppia elica ‐
Ibridazione (56‐56°) La temperatura dipende dai primer utilizzati. In questa fase i primer si legheranno al Dna Target single strand. ‐
Estensione del filamento Fase in cui la polimerasi andrà a costruire il filamento complementare al DNA target utilizzando i dNTPs. Nel susseguirsi di questi cicli, generalmente 30, le copie di filamento che verranno a formarsi saranno raddoppiate per ogni ciclo completato. Si ha quindi un’amplificazione esponenziale dei filamenti di DNA target. L’amplificazione non andrà avanti all’infinito, è limitata dalla quantità dei dNTPs, dall’attività della polimerasi e dall’ibridazione dei filamenti del DNA target. Si raggiunge quindi una fase di plateau, dove il numero di copie rimane invariato. Il numero di copie ottenuto è proporzionale alla quantità di DNA templato inizialmente presente nel campione. La real‐time PCR ha proprio il vantaggio di poter monitorare la crescita esponenziale, fornendo dei risultati semiquantitativi in tempo reale. Ciò avviene grazie all’utilizzo della fluorescenza. Questa fluorescenza si ottiene o con l’intercalare nel DNA di sostanze coloranti fluorescenti o con l’ibridazione di sonde specifiche fluorescenti, come nel caso del kit MTB‐RIF. La lettura della fluorescenza avviene attraverso un light termocycler che nel caso del GeneXpert è contenuto nel modulo. 18 Lavorro di diplomaa 2013 CCuccu Lucian
na Maria
SSMT‐TAB3
3 4.5 Regione
ediresiste
enzaperllarifampicina
Nell aanalisi PCR reeal‐time del Kit Xpert MTTB‐RIF viene analizzato il gene rpoB pper la resiste
enza alla rifam
mpicina. È notto che tutte le resistenzee alla rifampiicina sono do
ovute a mutaazioni del gene rpoB. Il kit co
ontiene cinqu
ue differenti sonde che ppossono ibrid
dizzare copre
endo l’interaa zona di 81b
bp del gene.
Figuraa 6: sequenza del gene di resisstenza alla rifam
mpicina In questo modo ssi riescono a metterein eevidenza tuttte le possibili mutazioni cche avvengono del gene onde che ibri dizzano ciascuna zona rpoB.. Quando non viene rilevvata una fluoorescenza delle cinque so
del filamento di D
DNA del gene
e, vuol dire cche nella zon
na identificata dalla sond a c’è stata una ui essa non riiesce ad ibriddizzare, ciò sspiega la man
ncanza del seegnale. (8) mutaazione per cu
19
Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 5 Materialiemetodi
5.1.1
Campioniclinici
I campioni clinici su cui si può effettuare l’analisi MTB‐RIF GeneXpert sono: ‐
Espettorato spontaneo o indotto ‐
Sedimento di espettorato dopo decontaminazione (forniti dal servizio di microbiologia) Tutti i materiali vanno considerati potenzialmente infetti 5.1.2
‐
Materialinonfornitinelkit
Cappa a flusso laminare: ditta: EHRET modello: BIOSAFE 8‐130‐2 numero di serie: 4574 ‐
Genexpert: ditta: Cepheid modello: numero di serie: analizzatore automatico di biologia molecolare, con computer, lettore cd, lettore codice a barre e manuale dell’operatore ‐
non disponibile la stampante ‐
pipette sterili ‐
falcon per diluire il campione ‐
vortex ‐
guanti ‐
contenitore per smaltimento rifiuti ‐
disinfettante ‐
portaprovette per falcon 20 Lavoro di diploma 2013 5.1.3
‐
Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 materialedelkit
cd: file di definizione del saggio istruzioni per l’importazione dellAFD nel software GX foglio illustrativo ‐
pipette di trasferimento con tacca che segna il volume minimo di campione ‐
10 cartucce Xpert MTB/RIF con provette di reazione integrate ‐
10 flaconi da 8ml di Reagente del Campione(RC) :idrossido di sodio e isopropanolo In ogni cartuccia: ‐
Microsfera 1: primer, sonde, KCl, MgCl₂, HEPES Ph 8, BSA(sieroalbumina bovina) ‐
Microsfera2:sonda, polimerasi, KCL, MgCl₂, dNTP, HEPES, pH 7,2 ,BSA ‐
Microsfera 3: circa 6000 spore di controllo non infette per la preparazione del campione ‐
Reagente 1: 4ml tampone Tris,EDTA e surfattanti ‐
Reagente 2: 4ml tampone Tris,EDTA e surfattanti (8) 5.2 Controllidiqualità
Ogni analisi include: ‐
un controllo di elaborazione del campione (SPC) ‐
e un controllo per la sonda (PCC) L’SPC contiene spore non infette mentre il PCC misura il segnale emesso dalle sonde per controllare la reidratazione delle sonde contenute nelle microsfere liofilizzate. (8) 5.3 Principiodellaprocedura
GeneXpert Dx System consente di integrare e automatizzare l’analisi dei campioni, l’amplificazione degli acidi nucleici e il rilevamento delle sequenze bersaglio in campioni semplici o complessi, utilizzando la PCR in tempo reale e trascrittasi inversa. Il kit non fornisce le temperature di denaturazione di ibridazione e di estensione del filamento. (8) 5.4 Procedimento
Preparazione del campione di espettorato(lavoro sotto cappa a flusso laminare) ‐
Assicurarsi che il campione non contenga materiale alimentare. ‐
Etichettare le cartucce con l’identità del paziente o scrivervi il nome ai lati 21 Lavorro di diplomaa 2013 ‐
CCuccu Lucian
na Maria
SSMT‐TAB3
3 Sotto cap
ppa aggiunge
ere nel conteenitore del caampione il re
eagente cam
mpione in volume: 2:1(2 volu
umi di reagente per 1 voolume di cam
mpione)per l’e
espettorato 3:1(3 volu
umi di reagente per 1 voolume di cam
mpione) per ill sedimento di espettorato ‐
Ritapparee e assicurarsi che sia be n chiuso erm
meticamente ‐
Mescolarre vigorosam
mente per 10 .20 volte ‐
Incubare il campione per 15 minuuti a temperaatura ambien
nte mescolanndo di tanto in tanto. I ultare liquefaatti e omogenei campionii devono risu
‐
Aprire la cartuccia senza toccare lla linguetta rretrostante
‐
Porzionarre con la pipetta all’interrno della carttuccia, aspirando
o fino alla prrima tacca e ttrasferirla ne
ell’apertura aposita seenza creare bolle. ‐
Richiuderre bene la ca
assetta P
Precauzioni : il lavoro sottto cappa devve rispettare
e le norme b
base di sicureezza del tratttamento di m
materiale pottenzialmente
e infetto. Quuindi utilizzo di guanti e m
modalità di laavoro accura
ato sotto capppa, cioè evittare la creazione di aerossol e non ese
eguire m
manovre che possano interrompere i l flusso lamin
nare della ca
appa. Esecu
uzione del te
est (all’apparrecchio GeneeXpert) ‐
Andare all’apparecchio GeneXperrt , creare il ttest, ‐
Scansionaare prima l’e
etichetta a baarcode del paziente o ‐
Inserire ill numero del paziente a m
mano ‐
Scansionaare il codice a barre dellaa cartuccia e cliccare su sstart test. ‐
Attendere la luce verde lampeggi ante ‐
Aprire il m
modulo segn
nalato dall’appparecchio ‐
Inserire laa cartuccia fa
acendola scivvolare dentrro dolcementte ‐
Richiuderre bene lo sp
portelletto deel modulo ‐
La luce veerde non dovvrebbe più laampeggiare e il test è in esecuzione. ‐
Nella schermata del ccomputer è vvisualizzabile
e l’icona test in esecuzionne ‐
ne dell’analisi la luce verdde sopra il modulo si spegne e il test sarà visibile il risultato.
Al termin
‐
Lo sporteello del modu
ulo si sarà apperto automaaticamente
‐
Estrarre la cartuccia e
e gettarla ne l bidone giallo per i mate
eriali biologicci contamina
ati (8)
22
Lavorro di diplomaa 2013 CCuccu Lucian
na Maria
SSMT‐TAB3
3 5.5 Letturadelrisulttato
Cliccaando sul l’ID del test sarà
à possibile vi sualizzare :laa primary curve ed il testt report ‐
La primarry curve ÈÈ un diagramma che mostra il segnalee fluorescentte delle varie
e sonde utilizzzate nel kit fornendo come informaazione a che ciclo la fluo rescenza divventa positiva per la singoola sonda ch
he nel ggrafico è indeentificata dall diverso coloore. Di fianco
o al grafico è
è disponibile la didascalia
a delle sonde fluoresscenti. (8) ‐
Il test rep
port: Fornisce i dettagli de
ella primary ccurve in term
mini numerici. Con il Ct sii sa a che ciclo la zona nda risulta ppositiva e l’en
nd point da il valore num
merico finale ad analisi indentificcata dalla son
terminataa. Le principa
ali informazi oni sono forrnite dal test result: la deetezione della
a presenza di micobaatteri e l’eventuale detezzione della p
presenza di re
esistenza allaa rifampicina
a. 23
Lavorro di diplomaa 2013 CCuccu Lucian
na Maria
24
SSMT‐TAB3
3 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 5.6 Limitazionidelmetodo
‐
Il rilevamento dei micobatteri del complesso tubercolare dipende dal numero di microrganismi presenti nel campione caricato nella cartuccia. ‐
Il test positivo non indica necessariamente che i micobatteri siano vitali. ‐
Il DNA micobatterico può persistere anche dopo la terapia antibiotica, probabilmente si tratterà di micobatteri morti. ‐
Mutazioni o polimorfismi nelle regioni dove andrà a legarsi il primer possono compromettere il rilevamento di varianti nuove o conosciute di ceppi mutliresistenti. (8) 5.7 SensibilitàrispettoalGoldStandard
Risultati con 3 campioni d’espettorato per paziente (8) Microscopia
Coltura
Sensibilità
Positiva Positiva 99,5% Negativa Positiva 90% Risultati con 1 campione d’espettorato per paziente (8) Microscopia
Coltura
Sensibilità
Positiva Positiva 97,8% Negativa Positiva 73,1% 5.8 Sensibilitàanalitica
Il limite di rilevamento (LoD) è definito come il numero più basso di unità formanti colonie (CFU) per campione che possono essere distinte da campioni negativi con limite di confidenza del 95%. Il test ha un LoD di 131CFU/ml intervallo di confidenza del 95% compreso tra:106,2‐176,4 CFU. (8) 6 Validazione
I campioni su cui è stata effettuata la validazione sono 17 campioni di espettorato, lavaggio o aspirato, porzionati in precedenza al servizio di microbiologia Eolab da campioni su cui è stata effettuata la microscopia e la messa in coltura per la ricerca di micobatteri del complesso tubercolare , più un controllo di qualità poiché l’unico positivo per la resistenza alla rifampicina in modo da poter testare il funzionamento anche per l’amplificazione della zona di resistenza. Queste porzioni conservate in Eppendorf sono state sottoposte a processo di neutralizzazione. La neutralizzazione consiste nella disattivazione del materiale portandolo ad una temperatura di 80°. In questo modo si ha la denaturazione del DNA e quindi una morte degli eventuali micobatteri. Con la denaturazione 25 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 del DNA dei micobatteri il materiale non costituisce più pericolo infettivo. Successivamente i campioni sono stati trasportati all’Ospedale Regionale di Mendrisio dove sono stati conservati in frigo a 4°C ed utilizzati come campioni per la validazione del metodo MTB‐RIF Xpert ®. 7 Risultati
Risultati SMIC
Nr.
Risultati GenXpert
PCR
RIF
Campione
Materiale
Microscopia
Roche
Coltura
Antibiogramma
MTB
resistance
1
espettorato
numerosissimi
+
MTBC
sensibile
detected
high
not detected
2
lavaggio
numerosissimi
+
MTBC
sensibile
detected
high
not detected
3
aspirato
alcuni
+
MTBC
sensibile
detected
medium
not detected
4
lavaggio
numerosissimi
+
MTBC
sensibile
detected
medium
not detected
5
espettorato
6
lavaggio
7
espettorato
alcuni
+
8
espettorato
rarissimi
+
9
espettorato
rarissimi
n.d.
level
numerosissimi
+
MTBC
sensibile
detected
medium
not detected
negativa
+
negativa
-
not detected
-
-
MTBC
sensibile
detected
medium
not detected
MTBC
sensibile
detected
medium
not detected
negativa
-
detected
low
not detected
very
10
espettorato
negativa
+
MTBC
sensibile
detected
low
not detected
11
espettorato
alcuni
+
MTBC
sensibile
invalid
-
-
Rif Resistente
12
espettorato
numerosi
+
MTBC
(Ser531Leu)
detected
high
Detected
13
espettorato
numerosi
n.d.
MTBC
sensibile
detected
low
not detected
14
espettorato
numerosi
n.d.
MTBC
sensibile
detected
low
not detected
15
espettorato
rari
Nd
MTBC
sensibile
detected
medium
not detected
16
espettorato
alcuni
+
MTBC
sensibile
detected
low
not detected
17
espettorato
alcuni
+
MTBC
sensibile
detected
low
not detected
18
espettorato
rarissimi
+
MTBC
sensibile
invalid
-
-
7.1 Discussione
I raggruppamenti di colore identificano i singoli pazienti, mentre le righe, i singoli campioni. Per tutti i campioni si hanno a disposizione i risultati della microscopia, coltura e della PCR real‐time con MTB‐
RIF Xpert®, in alcuni casi è disponibile anche il risultato della PCR Roche eseguita al servizio di microbiologia Eolab. Tutti campioni postivi alla microscopia sono identificati postivi anche col l’analisi MTB‐RIF Xpert®. Il kit testato è stato anche in grado di rilevare la presenza del micobattere anche in un caso in cui la microscopia aveva dato esito negativo mentre poi la coltura ha confermato la presenza. In due casi il risultato dell’analisi è risultato invalido, l’apparecchio ha segnalato un errore 2008 che indica un errore di pressione della siringa di aspirazione che può anche essere dovuto alla viscosità del campione, mentre nel secondo caso si tratta di un errore di comunicazione tra il modulo e il computer e quindi non vi è risultato, segnalato con l’errore 2127. A causa dell’insufficienza del materiale e della limitata disponibilità dei test per la validazione non è stato possibile rianalizzare 26 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 questi due campioni. Come risultato negativo vi è un solo caso è si tratta di un campione risultato negativo anche alla microscopia e nella coltura ma risultato positivo nella PCR Roche. Questo non deve destare alcuna perplessità poiché la PCR Roche ha un limite di rilevamento più basso rispetto a quello del kit MTB‐RIF Xpert®. Per quanto riguarda i livelli di positività con cui il risultato viene espresso non è sempre congruente alla perfezione con la microscopia ma è abbastanza rappresentativo nella maggiorparte dei casi. Volendo dare un valore simile alle quantità sia ai risultati della microscopia sia a quelli ottenuti con il kit MTB.RIF Xpert® MTB.RIF Xpert Valore assegnato microscopia Very low 1 Rarissimi Low 2 Rari Medium 3 Alcuni High 4 Numerosi Very High 5 numerosissimi Ora proviamo a paragonare le quantità: CAMPIONE MTB.RIF Xpert MICROSCOPIA Differenze 1 5 4 1 2 5 4 1 3 3 3 0 4 5 3 2 5 5 3 2 7 3 3 0 8 1 3 2 9 1 1 0 10 0 2 2 12 4 4 0 13 4 2 2 14 4 2 2 15 2 3 1 16 3 2 1 17 3 2 1 27 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 Calcolando la media delle differenze si hanno una differenza pari a 1. Si può quindi dire che anche i livelli di qualità sono abbastanza rappresentativi. Le differenze che a volte sono più marcate in alcuni campioni sono da ricondurre anche alla omogeneità del campione. con i dato ottenuti il calcolo della specificità e della sensibilità non è rappresentativo si fa quindi riferimento a quella fornita dal kit sopraelencata nelle tabelle del capitolo 5.7. 7.2 Conclusioni
Possiamo quindi affermare che il kit MTB‐RIF Xpert è in grado di rilevare la presenza dei micobatteri del complesso tubercolare nei casi positivi mostrando un ottima concordanza con i risultati ottenuti con la microscopia diretta; in questo caso del 100% nei test riusciti. In conclusione la validazione del MTB.RIF Xpert ® è riuscita e il test può a tutti gli effetti entrare in routine. L’obiettivo di questo lavoro di diploma è stato raggiunto. 8 Ringraziamenti
Ringrazio l‘Ospedale Regionale di Mendrisio per avermi permesso di sviluppare questo lavoro di diploma. Un grazie alla mia referente Dr.ssa F. Baggi per avermi dato le dritte nel campo della microbiologia e aver curato tutta la parte specialistica, ringrazio anche il Dr. F. Keller. Il ringraziamento più sentito va al laboratorio di Mendrisio soprattutto alla capolaboratorio Rosita Ghidossi e alla mia referente degli allievi Ines Salina per avermi supportato in ogni modo e ovviamente un grazie di cuore a tutti voi tab di Mendrisio che mi avete sopportato e sostenuto in questo periodo. Ringrazio anche tutte le persone che mi stanno vicino e nel cuore in tutti i giorni della mia vita la mia mamma e i miei amici dagli abbracci più sinceri che anche se non capivano molto del mio lavoro mi son stati accanto e mi hanno supportato. Grazie anche alla scuola e al supporto ricevuto negli ultimi mesi, ma soprattutto grazie a quelle compagne di classe che mi hanno rassicurato davanti alle mie insicurezze. 28 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3 9 Bibliografia
1. Pasquinelli, Filippo. diagnostica e tecniche di laboratorio. 2. ticinese, lega polmonare. manuale della tubercolosi 2011. 3. Organisation, World Healt. Global Tubercolosis Report 2012. 4. manuale di sicurezza nei laboratori di ricerca. [Online] università di padova azienda ospedaliera. http://www.bio.unipd.it/safety/man/manbio.html. 5. micobatteriologia clinica. [Online] AMCLI. http://www.mycobactoscana.it/micobatteriologia/. 6. schede operative smic. 7. EHREIT. operating instruction Biosafe cabinet. 8. Cepheid. Cd del kit MTB‐RIF Xpert‐ metodica. Figura 1: http://medicinecookbook.blogspot.it/ .................................................................................... 5 Figura 2:incidenza TBC nel mondo anno 2011 ........................................................................................ 6 Figura3:http://www.oocities.org/gbruno_2000/mico.htm .................................................................. 11 Figura4:http://www.lung.ca/tb/images/full_archive/107_bacillus.jpg ............................................... 11 Figura 5. http://www.gruppostrola.com/index.asp?p=GS800%20LAF................................................. 16 Figura 6: sequenza del gene di resistenza alla rifampicina da manuale del kit .................................... 19 10 Abbreviazioni:
OBV ospedale beate vergine di Mendrisio SMIC servizio di microbiologia Eolab WHO World Heath Organisation TBC tubercolosi MTB micobacterium tuberculosis RIF rifampicina TAB tecnico in analisi biomediche 29 Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria 11 Allegati:
1. www.cepheid.com/.../XpertMTB_Broch_R9_EU.p...
2. contenuto cd con metodica in pdf
3. risultati delle analisi in pdf
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